污水處理廠中兩種典型微塑料表面生物膜分析*

馬新剛 宛 博 孫佳雯 臧玉魏 謝連科 張國英 崔相宇 祝凡平 袁憲正#

(1.國網(wǎng)山東省電力公司電力科學研究院，山東 濟南250002；2.山東中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，山東 濟南 250001；3.山東大學環(huán)境科學與工程學院，山東 青島 266237)

塑料作為20世紀的一項偉大發(fā)明，現(xiàn)已是不可或缺的生產(chǎn)生活材料。據(jù)研究表明，2010年全球192個沿海國家和地區(qū)共制造了2.75億t塑料垃圾[1]。其中，中國是世界上最大的塑料生產(chǎn)和消費國。大量堆積在環(huán)境中的塑料垃圾在機械作用、生物降解、光降解等過程的共同作用下，被逐漸分解成毫米級別乃至納米級別的塑料碎片[2]。其中，微塑料指的是直徑小于5 mm的塑料碎片和顆粒[3]。微塑料比表面積大，吸附污染物的能力強，可作為有機污染物的載體幫助其擴散[4]。此外，微塑料體積小，容易被貽貝、浮游動物等食物鏈底端生物攝食[5-6]，并伴隨食物鏈傳送至上級消費者，甚至是人類，危害人類健康[7]。因此，微塑料污染不容小覷。

目前，關于微塑料的研究以海洋微塑料居多，包括微塑料的來源、分布、食物網(wǎng)轉移、生態(tài)毒理學效應等[8]。另已有研究表明在海水中浸泡的塑料上會形成清晰可見的生物膜[9]。塑料上生物膜的形成會降低塑料浮力，使一些塑料碎片沉入深海，加重海洋塑料垃圾的堆積[10]。此外，消費者可能會優(yōu)先攝取攜帶生物膜的高營養(yǎng)塑料顆粒，附著生物膜的塑料片會增加動物攝食塑料的概率[11]。ZETTLER等[12]首次對塑料表面的微生物群落進行了綜合表征，提出了“Plastisphere”這個概念，并指出北大西洋近海水域中的聚乙烯(PE)和聚丙烯塑料片上會形成獨特、多樣且復雜的微生物群落，包括異養(yǎng)生物和自養(yǎng)生物。但目前淡水環(huán)境下微塑料與微生物群落的相互作用鮮有報道。污水處理廠含有豐富的微生物，因此，污水處理廠中的微塑料有可能攜帶更豐富的細菌，成為細菌傳播的載體。

表1 污水水質情況Table 1 Water quality of sewage

本研究以常見的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)和PE微塑料為實驗對象，因為有研究表明PET和PE是環(huán)境中最常檢測到的塑料之一[13-15]，同時也是污水處理廠污泥中最常見的微塑料之一，其中由于PE被廣泛用于包裝，是豐度最高的微塑料類型[16-17]；針對這兩種微塑料上生物膜相關研究較多，其表面物理化學性質較為明晰[18],[19]2,[20]。研究在好氧池與厭氧池中PET和PE微塑料表面生物膜的差異特征，為污水處理廠中微塑料的治理與安全性評估提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選擇同時具有好氧池和厭氧池的青島某污水處理廠作為實驗地點，該污水處理廠采用厭氧/好氧(A/O)工藝，污水經(jīng)過一系列預處理后進行二級處理，首先流入?yún)捬醭?，接著再進入好氧池。對塑料投放時的污水水質進行檢測，具體水質指標如表1所示。

選擇的PET和PE兩種微塑料，購自于廣東省東莞市某塑膠材料有限公司，具體參數(shù)如表2所示。

表2 微塑料表征Table 2 Characterization of microplastics

將120片相同的微塑料裝入帶孔洞的不銹鋼小球(直徑約6 cm)中，PET和PE各有6個不銹鋼小球。另外，好氧池和厭氧池各有3個投放點，每個投放點投放裝有PET的不銹鋼小球和裝有PE的不銹鋼小球各1個，投放深度均為2 m，3處投放點間距大致相同。實驗選取同一流程中的厭氧池和好氧池，即污水流經(jīng)厭氧池后，流入好氧池中。

培養(yǎng)15 d后，將不銹鋼小球從好氧池和厭氧池取出，分別命名為PET-O(好氧池PET)、PE-O(好氧池PE)、PET-A(厭氧池PET)和PE-A(厭氧池PE)，并立即在低溫條件下送回實驗室處理。每個投放點回收的微塑料用無菌水沖洗3次，其中一部分浸泡在無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS,0.01 mol/L,pH=7.4)中，用于觀察微塑料表面生物膜的分布，剩余的部分存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于后續(xù)的脫氧核糖核酸(DNA)提取以及生物多樣性分析。同時分別取好氧池和厭氧池中的本底污泥樣品，分別命名為Sludge-O(好氧池污泥)、Sludge-A(厭氧池污泥)，用于DNA提取以及生物多樣性分析。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物膜觀察

應用Fluo ViewTM FV1000型激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)進行生物膜的觀察測定。使用碘化丙啶(PI)染料(Sigma，德國)對生物膜進行染色。將浸泡在0.01 mol/L PBS中的微塑料取出，用質量分數(shù)為2.5%的戊二醛溶液固定1.5 h，再用無菌0.01 mol/L PBS沖洗3次，加入PI染料，在黑暗中染色15 min，再用無菌0.01 mol/L PBS沖洗3次。制作玻片后，通過配有氬激光器(488 nm)的激光共聚焦顯微鏡觀察樣品。每種微塑料樣品隨機選取一個視野，觀察塑料表面是否有微生物附著(物鏡10×，目鏡10×)。

1.2.2 細菌的多樣性分析

分別收集好氧池與厭氧池中的微塑料，通過離心(12 000 g,1 min)收集微塑料上的生物膜。使用PowerSoil?DNA分離試劑盒(Qiagen，德國)對DNA進行提取。為獲取微塑料上的生物膜，將300 mg無菌玻璃珠(直徑1 mm)添加到每個裝有樣品的PowerBead管中，充分渦旋并在FastPrep?快速核酸提取儀(MP Biomedicals，美國)上研磨3次，每次1 min。采用Qubit?2.0熒光計(Invitrogen，美國)檢測抽提的基因組DNA濃度，并采用質量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳進行DNA完整性檢測。按照Illumina公司DNA測序樣品前處理指導手冊第二版(Illumina TruSeq DNA Sample Prep v2 Guide)對每個樣品構建大約500 bp大小的DNA文庫。使用Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies，英國)和Agilent 2100 DNA 1000試劑盒評估文庫質量。所有樣品在Hiseq X-ten平臺(Illumina，美國)上進行150 bp配對末端測序。篩選Illumina原始序列，然后，使用短序列比對軟件SOAPaligner 2.21比對國家生物技術信息基因庫的細菌基因組和序列，并除去映射到宿主基因組的序列。處理后的序列通過SOAPaligner 2.21與美國國家生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行比對，用于檢測已知的細菌。然后將排列好的序列分為界、門、綱、目、科、屬、種進行分類和豐度統(tǒng)計，生成不同層次的分類學相對豐度分布圖。

1.2.3 生物信息學分析

通過Shannon-Wiener指數(shù)比較物種種類和物種豐度分配的均勻性；通過Simpson指數(shù)分析群落多樣性。運用非度量多維尺度(NMDS)分析、主坐標(PCoA)分析比較Beta多樣性。利用R語言Vegan軟件包進行NMDS分析，利用R語言ade4程序包進行PCoA分析。

2 結果與討論

2.1 微塑料表面生物膜的空間分布

PI與DNA結合可發(fā)出紅色熒光，激光共聚焦圖像(見圖1)顯示，經(jīng)過15 d的培養(yǎng)，PET和PE表面均有微生物附著。在好氧池中培養(yǎng)的微塑料表面微生物分布較為密集，而在厭氧池中培養(yǎng)的微塑料表面微生物較為稀疏，這種現(xiàn)象可在PET和PE上同時體現(xiàn)。因此，與厭氧池相比，好氧池中的微生物更容易附著在PET和PE表面，形成穩(wěn)定的生物膜。另外，在好氧池中培養(yǎng)的PE-O上有累枝蟲附著，累枝蟲是污水處理廠好氧池中常見的原生動物。因此，進入污水處理廠的PET和PE均會成為微生物附著的載體，生物膜的多少與環(huán)境微生物的種類相關。

2.2 物種多樣性分析

由表3可以看出，好氧池中微塑料上生物膜的細菌豐度和多樣性均高于好氧池中本底污泥樣品，而在厭氧池中則相反；PET-O的Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)均為最高，其次是PE-O；同一好/厭氧池中的PET和PE的Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)差別較小。因此，微塑料會在特定環(huán)境下富集微生物，好氧池中微塑料上的生物膜具有較高的物種多樣性，而厭氧池中微塑料的物種多樣性較低。這說明生物膜的物種多樣性與培養(yǎng)環(huán)境有關，而塑料種類起到的影響較小。

表3 各樣品物種多樣性指數(shù)Table 3 Species diversity index of each sample

2.3 群落結構分析

由圖2可見，基于點與點之間的距離，6種樣品可分為3組，其中相距較近的樣品有PET-O和PE-O、PET-A和PE-A、Sludge-O和Sludge-A。這說明在好氧池中培養(yǎng)的PET和PE細菌群落組成相似；在厭氧池中培養(yǎng)的兩種微塑料生物膜的細菌組成差異度較小。因此，相比于微塑料材質，環(huán)境因素對生物膜細菌群落結構的影響更大。同時，Sludge-O和Sludge-A的微生物群落接近但存在差異。從圖2可以得出，不同培養(yǎng)環(huán)境下污泥的微生物群落結構也存在一定的差異，導致同一種微塑料在不同培養(yǎng)環(huán)境下的菌群差異。FENG等[19]5研究發(fā)現(xiàn)，不同微塑料上的微生物群落與海水中存在差異，此外，微塑料生物膜群落的差異與微塑料的類型有關，這是由于微塑料上官能團影響生物膜的形成，例如芳香基團可以促進細菌附著[21]，這與本研究結果是類似的。然而，在塑料上形成了不同于相應好/厭氧池本底污泥的微生物群落，說明微塑料是一種獨特的微生物載體。

各樣品基于屬水平的PCoA分析如圖3所示，其中第1主成分(PCoA1)的貢獻率為 62.9%，第2主成分(PCoA2)貢獻率為 27.9%，能客觀反映各樣品間微生物群落結構上的差異。圖3與圖2顯示的結果一致，微塑料上的生物膜與相應好/厭氧池中本底污泥的細菌群落組成存在明顯差異。

科分類水平的細菌群落組成(見圖4)顯示了各樣品前20的物種組成。PET-O的優(yōu)勢菌為紅環(huán)菌科(Rhodocyclaceae)，占細菌科種類總數(shù)的16.49%；PE-O的優(yōu)勢菌同為紅環(huán)菌科，占細菌科種類總數(shù)的12.02%；Sludge-O上的優(yōu)勢菌為伯克氏菌科(Burkholderiaceae)，占細菌科種類總數(shù)的24.62%; PET-A和PE-A中的優(yōu)勢菌相同，均屬于聚磷菌(Candidatus Accumulibacter)，分別占細菌科種類總數(shù)的32.09%、38.30%；Sludge-A上的優(yōu)勢菌為紅環(huán)菌科，占細菌科種類總數(shù)的22.45%。雖然6種樣品在科水平的優(yōu)勢菌不同，但其均屬于β-變形菌綱(Betaproteobacteria)。此外，PET-O和PE-O的差別主要體現(xiàn)在伯克氏菌科，PET-O中伯克氏菌科的豐度略高于PE-O。在厭氧池中培養(yǎng)的PET-A和PE-A可以得到相同的結果。因此伯克氏菌科細菌更容易附著在PET上。綜上所述，同種塑料在不同環(huán)境中優(yōu)勢菌不同，不同塑料在相同環(huán)境下優(yōu)勢菌相同，但仍在部分細菌上表現(xiàn)出豐度差異。

圖5顯示了屬水平上前20種細菌在6種樣品中的豐度分布情況以及聚類樹。PET-O上陶厄氏菌(Thauera)占優(yōu)勢地位，隨后依次為聚磷菌(CandidatusAccumulibacter)、分枝桿菌(Mycobacterium)、青枯菌(Ralstonia)。PE-O優(yōu)勢菌為陶厄氏菌，隨后依次為分枝桿菌、戈登氏菌(Gordonia)、聚磷菌。Sludge-O主要細菌有青枯菌、陶厄氏菌、丙酸桿菌(Propionibacterium)、代爾夫特菌(Delftia)。PET-A聚磷菌占優(yōu)勢地位，隨后依次為青枯菌、分枝桿菌、戈登氏菌。PE-A細菌豐度從高到低分別為聚磷菌、陶厄氏菌、戈登氏菌、分枝桿菌。Sludge-A主要細菌有陶厄氏菌、青枯菌、代爾夫特菌、聚磷菌。

由圖5中樣品的布雷距離關系可分析樣品的相似度。PET-O和PE-O的細菌結構較為相似，優(yōu)勢菌均為陶厄氏菌。Sludge-O的細菌結構與PET-O及PE-O顯著不同，優(yōu)勢菌為青枯菌。因此，微塑料上形成了與污泥樣品結構不同的微生物群落。在厭氧池中可以得到相似的結論。PET-A和PE-A的優(yōu)勢菌屬為聚磷菌，僅在陶厄氏菌和青枯菌的豐度上有所差異。Sludge-A的聚磷菌豐度較小，其優(yōu)勢菌屬為陶厄氏菌。Sludge-O和Sludge-A的細菌群落結構相似，但在好氧池中培養(yǎng)的PET-O和在厭氧池中培養(yǎng)的PET-A在細菌群落結構上卻存在差異，PET-A的聚磷菌和青枯菌豐度顯著高于PET-O。PE-O和PE-A在細菌相對豐度上同樣存在差異。另外，雖然不同微塑料上的細菌群落結構存在差異，但與相應好/厭氧池中本底污泥相比，微塑料上附著的生物膜群落結構更為相似。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過短期培養(yǎng)，PET和PE微塑料上均會形成生物膜，因此微塑料可以作為微生物的載體，協(xié)助細菌的擴散。另外，在同一生物處理池中，PE上的生物膜要多于PET，這可能是由于兩者的性質不同導致的。表2顯示，PE的水接觸角為95.02°，PET的水接觸角為76.35°，PE的疏水性大于PET。有研究表明，水接觸角較大(即越疏水)的膜材料表面越容易被細菌粘附[22]。另外，研究發(fā)現(xiàn)由于生物膜可以增加微塑料被動物攝食的可能性，附著生物膜的微塑料環(huán)境危害性顯著升高[23]。

本研究通過物種多樣性分析發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)環(huán)境中的PET和PE上附著的生物膜細菌群落的豐富度和多樣性存在較大差異。這可能是由于好氧池中的微生物相較于厭氧池豐富度更高且容易附著在微塑料上，另外，好氧池和厭氧池的pH、氨氮、總磷、COD等環(huán)境因子存在差異，這些都會影響微生物群落的組成。不同的環(huán)境會為微生物的附著提供不同的條件[24]。

本研究結果表明，背景污泥的優(yōu)勢菌與相應微塑料生物膜上的優(yōu)勢菌不同，如好氧污泥中的優(yōu)勢菌為青枯菌，而PET-O和PE-O上的優(yōu)勢菌為陶厄氏菌。原因可能為：PET和PE為生物膜的附著提供了條件，水體中的一些細菌會更傾向于粘附在塑料上并逐漸附著在塑料表面，形成生物膜上的優(yōu)勢菌。由于PET和PE在成分和物理性質方面存在差異，因此為微生物富集提供的條件不同，兩者在細菌組成上就存在差異。不同塑料對附著細菌的種類具有選擇性，故塑料上的優(yōu)勢菌與背景水樣并不同。此外，污水處理廠持續(xù)運行，水體中的污染物濃度、溫度、碳氮比等會隨著時間變化，這也會影響微塑料上生物膜的組成，導致生物膜的優(yōu)勢菌和采樣時背景污泥的優(yōu)勢菌不同[25]。

PET-O、PE-O和Sludge-A的優(yōu)勢菌紅環(huán)菌科、Sludge-O上的優(yōu)勢菌伯克氏菌科、PET-A和PE-A中的優(yōu)勢菌聚磷菌均屬于變形菌門。變形菌門是細菌中最大的門，有報道指出其在污水處理廠中分布十分廣泛，是污水中最大的一個門類[26]。其中屬于變形菌門的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)含有多種致病菌，比如沙門氏菌(Salmonella)、埃希氏菌(EscherichiaCastellaniandChalmers)、志賀氏菌(ShigellaCastellani)。在本實驗中，各樣品在科水平的細菌相對豐度顯示，在6種樣品中均可檢測到一定數(shù)量的腸桿菌科細菌。因此，微塑料有可能攜帶致病菌，成為致病菌傳播的載體。雖然污水處理廠通過二級處理和三級處理可以去除大部分微塑料[27]，但污水處理廠的出水中仍檢測到大量微塑料[28]，它們會被釋放到水生生態(tài)系統(tǒng)中，特別是河流[29-30]。污水處理廠是將微塑料傳播至河流、江海的重要點源[31]。因此，攜帶致病菌的微塑料會通過出水由污水處理廠進入河流或海洋，將致病菌擴散至更廣的環(huán)境中。但目前尚未對從污水處理廠流入水生生態(tài)系統(tǒng)中的微塑料上致病菌的含量做相關研究，其對環(huán)境造成的具體危害性仍有待深入探討。

4 結 論

浸泡在好氧池和厭氧池中的PET和PE微塑料表面均有生物膜附著，但生物膜量存在差異。微塑料是一種獨特的微生物載體，其上可形成不同于背景環(huán)境的微生物群落。環(huán)境對微生物群落結構的形成具有重要影響，在不同環(huán)境中培養(yǎng)的微塑料會形成不同的細菌群落結構，且豐富度和多樣性存在差異。此外，微塑料還可能會成為致病菌的載體，協(xié)助致病菌的傳播與擴散。