基于處方挖掘與分子動(dòng)力學(xué)模擬篩選嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2潛在抑制劑分子的研究*

張曉錚 高 穎 劉 玉 邰楊浩 梁力中 張玉龍 侯淑琳 解 軍**

（1）山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，出生缺陷與細(xì)胞再生山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001；2）山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，太原030001；3）山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，太原 030001；4）中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510530）

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）于2019年12月31日被首次發(fā)現(xiàn)［1］，其在全球范圍內(nèi)的廣泛傳播對(duì)全人類的生命健康造成了嚴(yán)重危害。截至2022年4月，全球已有超過(guò)5.14億人確診，625萬(wàn)余人死亡。COVID-19患者以發(fā)熱、干咳、乏力為典型癥狀，重癥患者可出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、多器官功能衰竭等癥狀［2］。SARSCoV-2表面刺突蛋白（spike protein，S蛋白）的受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）能夠與人體細(xì)胞的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensinconverting enzyme 2，ACE2）結(jié)合，這是病毒感染人體的主要途徑［3］。

目前尚無(wú)SARS-CoV-2特異性抗病毒藥物，臨床治療以對(duì)癥治療和支持治療為主［4］?，F(xiàn)有西醫(yī)藥療法約占臨床試驗(yàn)數(shù)的40.9%，涉及西藥種類52種，其中包括洛匹那韋/利托那韋、達(dá)蘆那韋/考比司他、抗流感藥物法匹拉韋、巴洛沙為酯和奧司他韋等。洛匹那韋和利托那韋均為HIV-1蛋白酶抑制劑，而瑞德西韋［5］的作用機(jī)制是整合進(jìn)SARSCoV-2的RNA鏈中，阻斷RNA復(fù)制，最終導(dǎo)致RNA鏈終止延遲。臨床研究顯示，洛匹那韋［6］等西藥對(duì)COVID-19有一定抑制作用，但存在胃腸道反應(yīng)、肝功能損害、脂質(zhì)代謝異常等不良反應(yīng)。同時(shí)瑞德西韋［7］、洛匹那韋和利托那韋［8］等可能無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞抑制病毒復(fù)制、裝配，導(dǎo)致這些藥物單獨(dú)使用效果較差?？贵w藥物療法約占臨床試驗(yàn)數(shù)的19.2%，其優(yōu)點(diǎn)在于特異性強(qiáng)、安全性好等［9］。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所從康復(fù)患者體內(nèi)分離出一株高效單克隆抗體——埃特司韋單抗（Etesevima），其能有效預(yù)防和治療COVID-19。Etesevima與Bamlanivimab雙抗體療法效果更佳，但是對(duì)奧密克戎（Omicron）變異株失效［10］。美國(guó)再生元制藥公司和瑞士羅氏制藥公司聯(lián)合開創(chuàng)了一種新的抗體療法，該療法由伊維德單抗（REGEN10987）和卡西里單抗（REGEN10933）組成［11］。該抗體主要適用于輕中度患者，但對(duì)奧密克戎變異株失去抑制作用［12-14］。值得注意的是，這兩種抗體療法都是通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)域，阻止S蛋白R(shí)BD與人體ACE2受體結(jié)合，進(jìn)而避免病毒感染宿主細(xì)胞［11］。因此，抑制SARS-CoV-2與ACE2受體的結(jié)合，進(jìn)而阻止病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合在預(yù)防和治療COVID-19中發(fā)揮重要作用。但目前候選抗體藥物多數(shù)從康復(fù)患者血清中獲取，來(lái)源非常有限；且有研究表明，SARS-CoV-2可能導(dǎo)致抗體依賴 性 增 強(qiáng) （antibody-dependent enhancement，ADE）效應(yīng)［15］，無(wú)法避免其在宿主體內(nèi)的核酸復(fù)制和裝配。

中醫(yī)藥療法約占COVID-19治療性臨床試驗(yàn)的39.9%，在COVID-19的預(yù)防和臨床治療過(guò)程中發(fā)揮了積極作用［16］。中國(guó)國(guó)務(wù)院新聞辦在《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》中推薦使用金花清感顆粒、連花清瘟膠囊（顆粒）、清肺排毒湯等進(jìn)行治療［2］。以清肺排毒湯為例，其主要中藥成分如槲皮素、柚皮素、木犀草素通過(guò)作用于多個(gè)靶點(diǎn)，涉及多種信號(hào)通路，參與調(diào)控機(jī)體代謝、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等生理過(guò)程，呈現(xiàn)出抗炎、抗病毒的作用［17］。然而，這些中藥處方中對(duì)COVID-19治療起到關(guān)鍵作用的活性成分以及這些活性成分抗SARS-CoV-2的分子機(jī)制尚不明確，這在很大程度上阻礙了中醫(yī)藥在COVID-19治療中的應(yīng)用。因此，篩選COVID-19治療處方中的有效活性成分并闡明其抑制SARS-CoV-2感染的內(nèi)在分子機(jī)制對(duì)開發(fā)治療COVID-19效果顯著的藥物意義重大。

本文首先通過(guò)檢索COVID-19治療中藥處方，挖掘潛在SARS-CoV-2抑制活性成分，構(gòu)建了“新冠肺炎中藥候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)”?；贏CE2與SARS-CoV-2表面S蛋白的結(jié)合位點(diǎn)已成為COVID-19的潛在藥物作用靶點(diǎn)［18］。本文以具有人源ACE2抑制作用的活性小分子化合物為訓(xùn)練集構(gòu)建藥效團(tuán)模型，并以優(yōu)選藥效團(tuán)模型對(duì)“新冠肺炎中藥候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)”進(jìn)行虛擬篩選，得到能與ACE2結(jié)合的潛在抑制SARS-CoV-2活性成分。隨后，本文將上述潛在抑制活性成分作為配體，與人源ACE2受體蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，預(yù)測(cè)了10個(gè)可與ACE2/SARS-CoV-2識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合的中藥成分。最后，通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬探究了具有潛在SARSCoV-2抑制作用的活性小分子與ACE2蛋白的互作機(jī)制，進(jìn)一步從原子水平揭示了其抑制SARSCoV-2 S蛋白R(shí)BD與ACE2結(jié)合的內(nèi)在機(jī)制。本項(xiàng)研究將為SARS-CoV-2特異性抗病毒藥物的研發(fā)提供必要的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 中藥活性成分獲取

1.1.1 中藥處方挖掘

研究基于已報(bào)道的用于臨床治療的處方，同時(shí)參考中國(guó)各地方針對(duì)COVID-19治療的不同處方以及已公布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》中的中藥復(fù)方，全面搜集抗新冠肺炎的有效方劑，重復(fù)者只取其一。

1.1.2 COVID-19中藥候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的建立

參考《中華本草》和《中國(guó)藥典》對(duì)處方中的中藥進(jìn)行名稱規(guī)范及頻數(shù)統(tǒng)計(jì)，取頻次≥5的中藥材作為研究對(duì)象，建立新冠肺炎中藥候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP）［19］，以中藥名稱為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度（oral-bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為參考指標(biāo)，對(duì)其活性成分進(jìn)行搜索并構(gòu)建新冠肺炎中藥候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 藥效團(tuán)模型的建立及驗(yàn)證

1.2.1 訓(xùn)練集和測(cè)試集的搜集

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道搜集具有人源ACE2抑制活性的小分子化合物，同時(shí)在Binding Database數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.bindingdb.org/）中檢索以人源ACE2為靶點(diǎn)的抑制活性成分，用于訓(xùn)練集和測(cè)試集的構(gòu)建。訓(xùn)練集由6個(gè)具有一定活性梯度且結(jié)構(gòu)差異較大的小分子組成（活性梯度為：Ki＜100，100≤Ki≤1 000，Ki＞1 000），用于生成藥效團(tuán)模型。測(cè)試集由30個(gè)活性化合物和非活性化合物組成，用于藥效團(tuán)模型的評(píng)價(jià)及驗(yàn)證。

1.2.2 HipHop藥效團(tuán)模型的建立

藥效團(tuán)是指藥物活性分子中對(duì)活性起著重要作用的“藥效特征元素”及其空間排列形式，可認(rèn)為是大量活性化合物的共同特征。本研究使用Discovery Studio version 3.5軟 件HipHop藥效團(tuán) 構(gòu)建方法，旨在發(fā)現(xiàn)配體小分子化合物的共同特征。按活性排列訓(xùn)練集中小分子化合物，將其中活性較高者Principal設(shè)置為2，其他5個(gè)活性較低化合物Principal設(shè)置為1。所有化合物MaxOmitFeat均設(shè)置為1。將正電中心（positive ionizable，PI）、氫鍵供體（hydrogenbond donor，D）、氫鍵受體（hydrogen bond acceptor，A）、疏 水 基 團(tuán)（hydrophobic region，H）、芳環(huán)（ringaromatic，R）作為藥效團(tuán)的特征元素進(jìn)行評(píng)價(jià)。藥效團(tuán)元素的設(shè)定范圍為0~5，選擇Best模式進(jìn)行運(yùn)算，獲得10個(gè)藥效團(tuán)模型。

1.2.3 藥效團(tuán)模型評(píng)價(jià)驗(yàn)證

本研究使用Ligand Profiler模塊，選擇Best模式，用測(cè)試集中小分子化合物對(duì)藥效團(tuán)模型的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，在評(píng)分值盡可能高的情況下，選取與活性化合物匹配度較高并與非活性化合物匹配度較低的藥效團(tuán)作為優(yōu)選藥效團(tuán)模型。

1.3 基于藥效團(tuán)模型虛擬篩選

基于以上得到優(yōu)選藥效團(tuán)模型，對(duì)1.1.2節(jié)中構(gòu)建的新冠肺炎中藥候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選。首先，使用Prepare Ligands模塊對(duì)COVID-19中藥候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)中小分子化合物處理，使其轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)并保存。其次，使用Build 3D Database模塊構(gòu)建3D新冠肺炎中藥候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。最后，使用Search 3D Database模塊進(jìn)行篩選，得到可與人源ACE2結(jié)合的潛在SARS-CoV-2抑制活性成分，并使用Filter by Lipinski and Veber Rules模塊，遵循Lipinski Rules of Five和Veber Rules原則，通過(guò)分子類藥性對(duì)潛在抑制活性成分進(jìn)行過(guò)濾。

1.4 分子對(duì)接

分子對(duì)接技術(shù)基于配體與受體作用的“鎖鑰原理”，預(yù)測(cè)受體與配體的結(jié)合模式和親和力［20］。通過(guò)分子對(duì)接確定配體小分子與受體蛋白的結(jié)合位點(diǎn)和空間位置，有助于研究藥物的作用機(jī)制和指導(dǎo)新藥物的設(shè)計(jì)［21］。本研究從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/）下載RBD-ACE2-B0AT1復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：6M17）［22］，截取ACE2的一條B鏈，刪去水分子，添加氫原子，即為分子對(duì)接的受體。將1.3節(jié)中類藥性篩選后的小分子化合物作為配體，并進(jìn)行能量?jī)?yōu)化、生成三維坐標(biāo)、添加氫原子等處理［23］。使用LibDock分子對(duì)接方式，并選 擇Conformation Method為Fast、Docking Preferences為High Quality。根據(jù)對(duì)接結(jié)果初步評(píng)價(jià)配體與受體的結(jié)合情況。為了驗(yàn)證分子對(duì)接結(jié)果合理性，本文同時(shí)使用Auto Dock Vina軟件［24］進(jìn)行配體小分子與ACE2受體的分子對(duì)接。采用Auto Dock Vina分子對(duì)接方式，對(duì)接盒子大小設(shè)為88?×88?×82?，能覆蓋所有對(duì)接位點(diǎn)。對(duì)接過(guò)程完全采用半柔性對(duì)接，ACE2被視為一個(gè)剛體，只有配體小分子的構(gòu)象是可以變化的。

1.5 分子動(dòng)力學(xué)模擬

采用NAMD 2.12軟件［25］對(duì)小分子化合物與ACE2的最佳對(duì)接模型進(jìn)行進(jìn)一步模擬和優(yōu)化。本文運(yùn)用Discovery Studio version 3.5軟件中的Macromolecules模塊對(duì)ACE2初始結(jié)構(gòu)中缺失的氫原子在中性條件下進(jìn)行了添加。受體蛋白ACE2采用經(jīng)典分子力場(chǎng)Amber 03力場(chǎng)進(jìn)行處理。同時(shí)，運(yùn)用Gaussian 09軟件包中的B3LYP密度泛函理論（DFT）對(duì)配體小分子進(jìn)行了幾何優(yōu)化，所有分子的幾何優(yōu)化都使用了6-31G（d，p）基組。在高斯優(yōu)化的基礎(chǔ)上，通過(guò)R.E.D.對(duì)原子電荷分布的擬合得到相應(yīng)的小分子力場(chǎng)，其他原子參數(shù)采用常規(guī)Amber力場(chǎng)（Gaff）進(jìn)行處理。每個(gè)體系放入一個(gè)TIP3水盒子中，盒子邊界與蛋白質(zhì)之間最小距離設(shè)置為10?。同時(shí)，在水盒子中加入0.15 mol/L的鈉離子和氯離子使體系保持電中性，盡可能還原真實(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。首先用共軛梯度算法對(duì)所有系統(tǒng)進(jìn)行10 000步的能量最小化，然后將體系逐漸升溫到310 K；溫度控制在310 K，所有體系在NVT系綜條件下進(jìn)行2 ns平衡；同樣在310 K溫度和1 atm壓強(qiáng)下，截?cái)嘀翟O(shè)為12，所有體系在NPT系綜下進(jìn)行了200 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。

1.6 結(jié)合自由能計(jì)算

本研究通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)泊松玻爾茲曼-表面積法（molecular mechanics-Poisson Boltzmann surface area，MM-PBSA），采用分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡最后30 ns等間隔提取的300個(gè)構(gòu)象，計(jì)算了小分子化合物與ACE2的結(jié)合自由能。MM-PBSA方法已在結(jié)合自由能計(jì)算中得到了廣泛應(yīng)用［26］，具體公式如下：

公式中ΔGcomplex、ΔGprotein和ΔGligand分別表示復(fù)合物、受體蛋白以及配體的吉布斯自由能，每一項(xiàng)自由都由ΔEMM、ΔGsolvation和-TΔS 3部分組成，分別表示真空中受體-配體結(jié)合前后動(dòng)力學(xué)能量的差值、溶劑化自由能和熵罰。其中動(dòng)力學(xué)項(xiàng)ΔEMM可分為范德華相互作用（ΔEvdW）和靜電相互作用（ΔEele），溶劑化自由能包括極性溶劑化自由能（ΔGsol-polar）和非極性溶劑化自由能（ΔGsol-nonpolar）。

2 結(jié) 果

2.1 中藥處方建立“新冠肺炎中藥候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)”

檢索文獻(xiàn)和臨床治療處方，全面搜集抗COVID-19的有效方劑，最終篩選出143個(gè)中藥處方作為候選處方。對(duì)處方中的中藥進(jìn)行名稱規(guī)范并進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì)，取頻次≥5的中藥材作為研究對(duì)象。共搜集到209種藥材，其中59種作為研究對(duì)象。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP）檢索和篩選，獲得了640個(gè)候選中藥活性成分，完成COVID-19中藥候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的建立。COVID-19中藥候選活性成分篩選流程圖見圖1。

2.2 HipHop藥效團(tuán)模型建立及驗(yàn)證

采用HipHop方法，以訓(xùn)練集中的6個(gè)活性化合物為對(duì)象構(gòu)建出10個(gè)藥效團(tuán)模型。訓(xùn)練集中活性化合物詳細(xì)信息見表S1，HipHop藥效團(tuán)模型構(gòu)建結(jié)果見表1。10個(gè)藥效團(tuán)評(píng)分值都超過(guò)88，同時(shí)其匹配數(shù)均為6，說(shuō)明訓(xùn)練集中6個(gè)小分子的共同特征比較明顯。圖2為藥效團(tuán)驗(yàn)證結(jié)果，在評(píng)分值盡可能高的情況下，選取與活性化合物匹配度較高及與非活性化合物匹配度較低的藥效團(tuán)作為優(yōu)選藥效團(tuán)模型。根據(jù)藥效團(tuán)熱圖選擇優(yōu)選藥效團(tuán)，暖色調(diào)代表藥效團(tuán)對(duì)配體響應(yīng)度較高，冷色調(diào)代表藥效團(tuán)對(duì)配體響應(yīng)度較低。本研究選取藥效團(tuán)08為優(yōu)選藥效團(tuán)模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 優(yōu)選藥效團(tuán)對(duì)“新冠肺炎中藥候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)”中潛在SARS-CoV-2抑制成分的虛擬篩選

采用2.2節(jié)中構(gòu)建的優(yōu)選藥效團(tuán)模型，對(duì)2.1節(jié)中構(gòu)建的“新冠肺炎中藥候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)”中640個(gè)小分子化合物進(jìn)行虛擬篩選，匹配出107個(gè)化合物。再通過(guò)“成藥五原則”（分子質(zhì)量＜500 u，氫鍵供體數(shù)＜5，氫鍵受體數(shù)＜10，脂水分配系數(shù)＜5，可旋轉(zhuǎn)鍵≤10）對(duì)小分子化合物進(jìn)行類藥性篩選，最終得到72個(gè)可與ACE2結(jié)合的潛在SARS-CoV-2抑制活性小分子。優(yōu)選藥效團(tuán)08主要是由3個(gè)氫鍵受體（A）、2個(gè)疏水中心（H）和1個(gè)芳環(huán)中心（R）組成（圖3a）。圖3b-h為優(yōu)選藥效團(tuán)匹配到的候選成分。表2為虛擬篩選出的部分排名靠前的主要活性成分。

2.4 潛在活性成分與ACE2關(guān)鍵位點(diǎn)的分子對(duì)接

為了進(jìn)一步篩選可以與SARS-CoV-2 S蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合在ACE2關(guān)鍵活性位點(diǎn)的抑制劑分子，本項(xiàng)研究以2.3節(jié)中虛擬篩選出的72個(gè)潛在抑制劑小分子為配體，以人源ACE2蛋白為受體進(jìn)行了分子對(duì)接研究。宋磊等［27］通過(guò)點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SARSCoV-2 S蛋 白 的GLY502、TYR505、TYR489、LYS417、ASN487、ASN501在與ACE2分子識(shí)別時(shí)起到至關(guān)重要的作用。本文通過(guò)反向找靶確定了ACE2中與上述殘基具有關(guān)鍵相互作用的氨基酸殘

基（GLN24、THR27、TYR83、TYR41、LYS353、LYS354），并以此為對(duì)接活性位點(diǎn)。采用Libdock半柔性對(duì)接方式進(jìn)行分子對(duì)接。每種小分子化合物對(duì)接結(jié)果中出現(xiàn)多種結(jié)合構(gòu)象，在打分值盡可能高的情況下，選擇S蛋白R(shí)BD與ACE2的結(jié)合位點(diǎn)處關(guān)鍵氨基酸殘基呈現(xiàn)較強(qiáng)相互作用的小分子化合物為潛在活性成分。如表3所示，共篩選出10個(gè)小分子化合物，10個(gè)小分子的詳細(xì)信息見表S2。為了驗(yàn)證對(duì)接結(jié)果合理性，同時(shí)使用Auto Dock Vina軟件驗(yàn)證分子對(duì)接結(jié)果。在Libdock篩選出10個(gè)化合物中，有3個(gè)化合物與S蛋白/ACE2識(shí)別位點(diǎn)處關(guān)鍵氨基酸殘基具有較強(qiáng)相互作用（圖4）。

2.5 分子動(dòng)力學(xué)模擬驗(yàn)證

分子對(duì)接無(wú)法充分考慮蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的柔性，為了進(jìn)一步闡明候選藥物與受體蛋白的關(guān)鍵相互作用，以及候選藥物的結(jié)合對(duì)S蛋白與ACE2識(shí)別的影響，本項(xiàng)研究對(duì)最佳分子對(duì)接模型進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬。在200 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬中，3個(gè)化合物與ACE2的均方根偏差（RMSD）都達(dá)到了相對(duì)平衡的狀態(tài)（圖5，圖S1）。MM/PBSA方法計(jì)算得到的結(jié)合自由能收斂（圖S2）。如表4所示，3個(gè)小分子化合物與ACE2的結(jié)合自由能均為負(fù)值，MOL012556具有最好的結(jié)合自由能（（-14.8±0.5）kcal/mol），其 次 為MOL003306（（-14.6±0.4）kcal/mol），MOL004866的 結(jié) 合 自 由 能 最 弱（（-10.5±0.5）kcal/mol）。此外，從結(jié)合自由能分解項(xiàng)可以看出候選化合物與ACE2的結(jié)合主要是由范德華相互作用力（ΔEvdW）驅(qū)動(dòng)的。

經(jīng)過(guò)200 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，最終只有MOL012556小分子依然處在最初結(jié)合位置，其他兩個(gè)小分子結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，移動(dòng)到ACE2腔體深處。圖6展示了MOL012556、MOL004866、MOL003306三個(gè)小分子與ACE2在結(jié)合自由能最低時(shí)候的代表性結(jié)合方式與相互作用。對(duì)于MOL012556（圖6a），在結(jié)合位點(diǎn)處，其C21、C39和C15位羥基分別與ACE2的ASP350（2.6?）、MET383（2.7?）、ALA386（3.0?）形成3個(gè)氫鍵相互作用，LYS353、ARG393與MOL012556通過(guò)靜電相互作用結(jié)合在一起。除此之外，GLY354、PHE356和ALA387與MOL012556通過(guò)疏水相互作用結(jié)合在一起。MOL003306與MOL012556具有相似的結(jié)合自由能，但表現(xiàn)出不同的結(jié)合方式。MOL003306主要通過(guò)疏水相互作用結(jié)合在ACE2腔體深處，其中包括：PHE40、TRP69和PHE390與配體間的Pi-Pi疏水堆積作用；LEU73、LEU391與配體間的Pi-Alkyl疏水作用；以及GLN102、ASP350與配體間的靜電相互作用（圖6c）。MOL004866（圖6b）、C18位 或C19位 羥 基 與ASP382通過(guò)氫鍵相互作用結(jié)合。此外，MOL004866通過(guò)靜電相互作用與ASP350、ASP382和LYS562結(jié)合，通過(guò)疏水相互作用與PHE40、PHE390和LEU391結(jié)合。

因此，上述3個(gè)候選藥物都可以與ACE2形成穩(wěn)定的復(fù)合物，尤其是MOL012556可以結(jié)合在S蛋白與ACE2的識(shí)別位點(diǎn)。圖7為MOL012556結(jié)合前后S蛋白與ACE2的結(jié)合模型圖，黃色卡通呈現(xiàn)的是S蛋白，灰色卡通為無(wú)配體時(shí)的ACE2受體，玫紅色卡通為加入MOL012556小分子后ACE2構(gòu)象。從動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果看，當(dāng)無(wú)抑制劑分子時(shí)（圖7a），ACE2氨基酸殘基TYR41的側(cè)鏈乙基-苯酚羥基與S蛋白氨基酸殘基THR550上的主鏈氧原子形成氫鍵相互作用。此外，ACE2的氨基酸殘基LYS353分別與S蛋白氨基酸殘基GLY496、ASN501、GLY502形成較強(qiáng)的氫鍵相互作用。然而，當(dāng)MOL012556結(jié)合以后（圖7b），S蛋白與ACE2間的關(guān)鍵相互作用，尤其是上述氫鍵相互作用完全喪失。整體來(lái)看，MOL012556小分子與ACE2結(jié)合方式和相互作用更優(yōu)，兩者的結(jié)合能有效阻斷SARS-CoV-2 S蛋白與宿主細(xì)胞ACE2結(jié)合，進(jìn)而阻斷病毒感染人體。綜上，本文推測(cè)MOL012556小分子極有可能是一種潛在的SARSCoV-2抑制劑。

3 討 論

為了探索對(duì)SARS-CoV-2具有潛在抑制作用的中藥活性成分，本文首先檢索了COVID-19治療中藥處方143個(gè)，代表處方有荊防敗毒散、柴胡達(dá)胸合劑、疏風(fēng)解毒膠囊、連花清瘟膠囊、清肺達(dá)原顆粒、化濕敗毒方、宣肺敗毒方、止咳枇杷合劑等。其中代表性藥材包括黃芪、黃芩、連翹、柴胡、甘草、青蒿、枇杷葉等，這些藥材被報(bào)道在抗SARSCoV-2中起到一定作用［28］，表明本文取樣和統(tǒng)計(jì)方法的可靠性。本文進(jìn)一步采用基于配體的虛擬藥物篩選，分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法探究了這些藥材中的活性成分與ACE2蛋白的互作機(jī)制。結(jié)果表明，MOL012556小分子與ACE2的結(jié)合能有效阻斷SARS-CoV-2 S蛋白與宿主細(xì)胞ACE2識(shí)別的關(guān)鍵相互作用。因此，推測(cè)MOL012556小分子為一種潛在的SARS-CoV-2抑制劑。

MOL012556小分子全稱為23-trans-pcoumaryhormentic acid，其OB為36.08，DL為0.32。23-trans-p-coumaryhormentic acid是中藥枇杷葉中有效活性成分，代表處方有五葉蘆根湯代茶飲、新冠康復(fù)顆粒、薛氏五葉蘆根湯、銀連解毒湯、止咳枇杷合劑。枇杷葉主要含有黃酮類、三萜酸類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類等化學(xué)成分，主要用于清肺止咳、降逆止嘔，同時(shí)還具有抗炎、祛痰、止咳、抗肺纖維化、抗氧化、降血糖、抗腫瘤、止嘔等藥理作用［29］。向陽(yáng)等［30］基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接法探討薛氏五葉蘆根湯防控COVID-19的作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)薛氏五葉蘆根湯中多種活性成分可通過(guò)與COVID-19的相關(guān)靶標(biāo)結(jié)合，通過(guò)多種生物學(xué)途徑對(duì)COVID-19發(fā)揮調(diào)控作用。周瑞等［31］預(yù)測(cè)止咳枇杷合劑干預(yù)COVID-19的作用機(jī)制得出結(jié)論：枇杷葉作為方劑中主要中藥，其活性化合物可能通過(guò)抗炎、抗病毒復(fù)制等過(guò)程發(fā)揮多靶點(diǎn)、多通路、多成分干預(yù)COVID-19的作用。由此可見，枇杷葉抗炎、祛痰、止咳、抗肺纖維化等療效在COVID-19治療中發(fā)揮巨大作用，其有效活性成分在研發(fā)COVID-19特異性抗病毒藥物中具有極大的潛力。

目前，已有阻斷ACE2和病毒S蛋白相互作用的潛在COVID-19藥物的研究。有研究報(bào)道了兩種影響ACE2和病毒S蛋白相互作用的小分子，分別為SSAA09E2（-8.04 kcal/mol） 和Nilotinib（-8.34 kcal/mol）［32］。從 親 和 力 看23-trans-pcoumaryhormentic acid（（-14.8±0.5）kcal/mol）優(yōu)于上述兩種分子。SSAA09E2的結(jié)合使得ACE2和S蛋白之間產(chǎn)生了更多的氫鍵和更強(qiáng)的相互作用，盡管該研究中通過(guò)動(dòng)力學(xué)分析強(qiáng)調(diào)SSAA09E2的結(jié)合可對(duì)ACE2和S蛋白的結(jié)合過(guò)程產(chǎn)生影響，但SSAA09E2更有可能是一種ACE2與S蛋白結(jié)合的激 動(dòng) 劑。與SSAA09E2相 比，23-trans-pcoumaryhormentic acid有效阻斷了ACE2和S蛋白之間包括氫鍵在內(nèi)的相互作用，更有可能開發(fā)為SARS-CoV-2抑制劑分子。另外一種分子Nilotinib的結(jié)合可通過(guò)阻斷ACE2和S蛋白之間氫鍵相互作用進(jìn)而影響ACE2和S蛋白的結(jié)合。23-trans-pcoumaryhormentic acid與Nilotinib有 相 似的 抑 制機(jī)制，但不同于Nilotinib（酪氨酸蛋白激酶（abl-tk）抑制劑），23-trans-p-coumaryhormentic acid是已用于COVID-19治療的中藥處方中的活性成分，更有可能開發(fā)為SARS-CoV-2抑制劑分子。遺憾的是，限于目前難以獲取23-trans-p-coumaryhormentic acid的純品，本研究還不能從生物實(shí)驗(yàn)上驗(yàn)證其對(duì)SARS-CoV-2的抑制作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證非常值得期待。

4 結(jié) 論

本文通過(guò)中藥處方挖掘和分子動(dòng)力學(xué)模擬，從143個(gè)COVID-19治療中藥處方中篩選出10種可與SARS-CoV-2 S蛋白/人源ACE2識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合的中藥成分。其中，枇杷葉主要活性成分23-trans-pcoumaryhormentic acid與ACE2具有最高的親和力，且23-trans-p-coumaryhormentic acid的結(jié)合可有效阻斷SARS-CoV-2 S蛋白與宿主細(xì)胞ACE2的結(jié)合，進(jìn)而阻止SARS-CoV-2感染人體。因此，本文推測(cè)23-trans-p-coumaryhormentic acid小分子是一種潛在的SARS-CoV-2抑制劑，同時(shí)從原子水平預(yù)測(cè)了其抑制SARS-CoV-2 S蛋白與ACE2結(jié)合的內(nèi)在機(jī)制，這將為SARS-CoV-2特異性抗病毒藥物的研發(fā)提供新的思路。

附件見本文網(wǎng)絡(luò)版（http://www.pibb.ac.cn或http://www.cnki.net）：

PIBB_20220224_Table S1.pdf

Table 1 Parameters of 10 pharmacophores based on common molecular characteristics

Table 2 Information graph of main active ingredients screened by the virtual screen

Table 3 Molecular docking results

Table 4 MM/PBSA derived binding free energies(kcal·mol-1)of small molecule compounds and ACE2

PIBB_20220224_Table S2.pdf

PIBB_20220224_Fig S1.jpg

PIBB_20220224_Fig S2.jpg