基于蛋白質組學技術的新型冠狀病毒肺炎研究進展*

劉 響 宮鵬云 湯 敏 胡鴻珂 張永彪** 劉 超**

（1）北京航空航天大學醫(yī)學科學與工程學院，北京 100191；2）北京航空航天大學生物與醫(yī)學工程學院，北京 100191）

2019年12 月，一種新型冠狀病毒（后命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2））引起的肺炎疫情爆發(fā)，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）將 該 疾 病 命 名 為新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），簡稱“新冠肺炎”，并于2020年3月宣布COVID-19成為全球性大流行病［1］。截至2022年3月18日，全球已累計報告超4.6億名確診病例，逾608萬名患者死亡，目前仍在持續(xù)擴散中［2］。COVID-19現在是影響全球公共健康的最具破壞性的流行病之一，引發(fā)國內外廣泛關注。為了找到遏制COVID-19大流行的解決方案，全球研究工作已迅速動員起來，在基礎研究、診斷、治療和藥物研發(fā)等方面開展了一系列研究并取得了重要進展。

蛋白質組學（proteomics）是1994年由Marc R.Wikins首先提出，是以所有基因表達的全部蛋白質為研究對象，研究細胞、組織或生物體蛋白質組成及其變化規(guī)律的科學［3-4］。蛋白質組學技術是當前解決醫(yī)學和生物學中諸多問題的重要工具之一，已被廣泛應用于傳染性疾病的研究當中。通過對病原體和感染后的宿主細胞、組織、體液等進行蛋白質組學研究，同時結合免疫學進行分析，可為傳染性疾病的診斷、治療、預防等方面的研究提供新的策略和依據。COVID-19疫情爆發(fā)以來，蛋白質組學技術已被廣泛應用于COVID-19的研究中，并在篩選生物標志物、研究病毒感染的分子機制和研發(fā)預防和治療藥物等3個方面取得較大進展。

本文首先介紹了SARS-CoV-2的基因組結構和病毒感染過程，總結了目前常用的基于質譜的蛋白質組學研究技術，并對基于質譜的蛋白質組學技術在COVID-19生物標志物研究、感染機制研究和藥物治療靶標研究中的應用進展進行了梳理、總結和展望，以期對COVID-19的防控和治療提供有力的支撐。

1 SARS-CoV-2的基因組結構和病毒感染過程

COVID-19是 由SARS-CoV-2引 起 的 疾 ?。?］。經基因組測序，SARS-CoV-2為有包膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組序列與嚴重急性呼吸綜合征冠 狀 病 毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）序列相似度約為80%，與中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）序列相似度約為50%［6-7］，屬于β冠狀病毒屬，是一種新型的冠狀病毒［5，8］。

SARS-CoV-2的基因組大小約29 900個堿基，包含14個主要的開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼27種蛋白質（圖1），位于基因組5'端的ORF1ab和ORF1a基因分別編碼2個多聚蛋白pp1ab和pp1a，多聚蛋白pp1ab和pp1a經剪切可產生16種非結構蛋白（non-structural proteins，NSPs），包括nsp1~16?；蚪M的3'端編碼4種主要的結構蛋白和8種輔助蛋白，其中刺突蛋白（spike protein，S蛋白）、包膜蛋白（envelope protein，E蛋白）、膜蛋白 （membrane glycoprotein，M蛋白）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N蛋白）是結構蛋白；ORF3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b和ORF14是輔助蛋白［7，9］。這些蛋白質是SARS-CoV-2感染宿主的物質基礎。

SARS-CoV-2感染宿主細胞是通過病毒表面的S蛋白與宿主細胞表面的跨膜蛋白血管緊張素轉化酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）發(fā)生相互作用所介導的［7，10］。S蛋白由2個糖基化的亞基S1和S2組成，其中S1亞基含有受體結合域（receptor binding domain，RBD），負責識別細胞的受體；S2亞基含有膜融合過程所需的基本元件，催化病毒和細胞膜的融合［10］。ACE2是一種細胞表面肽酶，可水解血管緊張素II，ACE2是目前已知最主要的SARS-CoV-2受體，在大多數器官中均有表達，特別是在肺和小腸上皮中高表達［11］。病毒感染宿主細胞的過程（圖2）包括：①病毒的S蛋白與宿主細胞表面受體結合后，通過兩種方式進入細胞，一種是被質膜上的跨膜絲氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）切割S蛋白，激活病毒膜與宿主膜融合，另一種是被組織蛋白酶L（CTSL）切割和激活S蛋白，介導SARS-CoV-2通過內吞進入細胞，基因組RNA釋放到細胞質中。②宿主核醣體結合到病毒RNA，翻譯pp1a、pp1ab多聚蛋白。③產生的多聚蛋白pp1a和pp1ab被翻譯后加工成單個非結構 蛋 白（nsp1~16）。④RNA依 賴RNA聚 合 酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）與nsp7、nsp8等因子形成轉錄復制復合體（replication and transcription complex，RTC）復制病毒RNA，負鏈RNA可用于翻譯各種結構蛋白，如E、N、S和M蛋白。⑤復制后的RNA由N蛋白包裹與M蛋白、E蛋白和S蛋白組裝成完整的病毒顆粒。⑥病毒通過高爾基體或溶酶體釋出感染其他細胞［12-15］。

ACE2廣泛分布于人體的多個組織，包括肺、小腸、心臟、肝臟、腎臟、胰腺、睪丸和神經組織等［15-19］。因此SARS-CoV-2能夠侵染人體的多個組織，對人體造成嚴重傷害，導致嚴重的呼吸系統(tǒng)問題、免疫功能障礙、神經系統(tǒng)損傷以及心血管、肺、胃腸道、腎臟功能障礙和多器官衰竭等［16-22］。

2 基于質譜的蛋白質組學技術

生物質譜技術是蛋白質組學研究中最重要的分析技術。目前常用的質譜包括兩種：基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）和液相色譜-電噴霧質譜聯用（liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry，LC-ESI-MS）［23］。兩者都可以用于蛋白質分析鑒定，但是電離原理不同，應用方向各有特點。MALDI-TOF MS常用于簡單樣品如純化蛋白質的分析鑒定，其特點是速度快、靈敏度高，常用于蛋白質、多肽、核酸等的分析檢測，以及微生物菌種鑒定和質譜成像等，在SARS-CoV-2病毒顆粒的鑒定和生物標志物研究中發(fā)揮重要作用；LC-ESI-MS主要用于來自組織、細胞等復雜蛋白質與多肽樣品的分析檢測，其特點是靈敏度高、檢測范圍廣，在COVID-19的生物標志物、發(fā)病機制和藥物靶標研究中都發(fā)揮了重要的作用。

2.1 MALDI-TOF MS技術

MALDI-TOF MS技術的原理是將蛋白質、多肽等樣品溶液與芳香族有機酸等小分子基質溶液混合后點在金屬靶盤上，待溶劑揮發(fā)后形成共結晶，用激光照射晶體時，基質分子吸收激光能量、蒸發(fā)和離子化，并帶著樣品分子解吸附進入氣相，基質-樣品分子之間發(fā)生電荷轉移使樣品分子電離，采用飛行時間質量分析器檢測帶電荷的分析物，從而獲得樣品的質荷比（m/z）信息。MALDI-TOF MS一般用于蛋白質、多肽、核酸、脂質和寡糖的分子質量測定、蛋白質的肽質量指紋圖譜分析與快速鑒定。MALDI-TOF/TOF MS可得到MS/MS譜圖，可以得到肽段氨基酸組成信息。

MALDI-TOF MS常用于微生物菌種快速鑒定。每一種微生物都有其特征的蛋白質指紋圖譜，通過MALDI-TOF MS分析獲得微生物菌種核糖體蛋白指紋圖譜，與已知微生物菌種蛋白質指紋圖譜數據庫比對分析后，實現微生物菌種的快速鑒定。MALDI-TOF MS數據庫中菌株種類豐富，來源廣泛，在臨床上常用于常見致病菌檢測?；贛ALDI-TOF MS的蛋白質組學及多肽組學技術也成為SARS-CoV-2快速檢測的潛在技術，已有研究報道利用MALDI-TOF MS技術鑒定鼻咽拭子中的SARS-CoV-2病毒蛋白，檢測準確度可達到93.9%［24-25］，這些研究揭示了MALDI-TOF MS技術的臨床診斷應用價值。

2.2 LC-ESI-MS技術

目前蛋白質組學研究主要使用LC-ESI-MS聯用技術，其原理是：樣品經色譜柱分離后，經毛細管噴頭流出時，在千伏級高壓電場的作用下形成帶電小液滴；隨著液滴的溶劑蒸發(fā)，液滴表面離子密度增大，當庫倫斥力和液滴表面張力極限值相等時發(fā)生庫倫爆炸，形成更小的帶電液滴；然后在電場作用下重復蒸發(fā)、分裂的過程，直至形成氣相離子進入質量分析器被分離檢測。該方法的優(yōu)點是可以實現從液態(tài)到氣態(tài)分子的轉變，產生的離子可以帶有一個或多個電荷，這種多電荷離子的產生大大擴展了普通質譜儀能分析的質量范圍，使質譜儀可以分析分子質量為幾十萬道爾頓的蛋白質分子［23，26］。因此，LC-ESI-MS技術在蛋白質組學研究中應用最為廣泛，適用于蛋白質質譜鑒定、蛋白質組定量分析、蛋白質翻譯后修飾鑒定和蛋白質相互作用研究等。

目前基于LC-ESI-MS的蛋白質組學技術主要采用3種采集方式：數據依賴性采集（data dependent acquisition，DDA）、數據非依賴性采集（data independent acquisition，DIA）和靶向數據采集［27］。

2.2.1 數據依賴性采集（DDA）技術

DDA技術的原理是利用一級全掃描檢測肽段母離子，然后按照母離子的信號強度排序，將強度較高的一系列（topN）母離子由強到弱依次進行選擇、碎裂和檢測二級碎片離子。同時，質譜的動態(tài)排除、動態(tài)背景扣除、價態(tài)排除等技術，使DDA盡可能多地采集有效母離子的二級譜圖，實現鑒定結果最大化［28］。DDA技術在SARS-CoV-2感染后的病毒蛋白質鑒定、蛋白質組定量、蛋白質翻譯后修飾（如S蛋白的糖基化以及蛋白質組的磷酸化等）鑒定和蛋白質相互作用研究中發(fā)揮重要作用?；贒DA的同位素標記定量是目前應用最廣泛的蛋白質組學定量技術，其中使用最多的同位素標記試 劑 是iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）和TMT（tandem mass tags）。標記定量的主要策略是向每組多肽樣品中引入不同的穩(wěn)定同位素標記的小分子，通過同位素標記后所產生的質量差來識別肽段的來源。標記定量方法將不同組樣本混勻后同時進行質譜檢測，可以避免樣品前處理所帶來的定量誤差［29］。目前標記定量最多可實現16標同時定量，特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的COVID-19樣本的差異蛋白質組分析。

2.2.2 數據非依賴性采集（DIA）技術

DIA技術的原理是首先將質譜掃描的整個一級質量范圍根據離子密度分割為若干窗口，每個窗口依次選擇、碎裂、掃描，DIA能夠獲得每個窗口范圍內所有母離子的全部碎片離子信息，循環(huán)時間固定，同時數據可以回溯，有效解決了DDA技術存在的隨機性和低豐度離子缺失的問題。但是DIA模式產生的碎片離子譜圖過于復雜，丟失了母離子與碎片離子的對應關系，因此高度復雜的混合二級譜圖對肽段和蛋白質的正確解析提出了挑戰(zhàn)。為了減少肽段共流出問題，降低DIA譜圖的復雜度，一些具有革命性突破的DIA策略也相繼被開發(fā)。如diaPASEF技術［30］通過離子淌度提供額外一個維度的分離，使DIA數據采集時在不犧牲窗口循環(huán)速度的同時，降低譜圖復雜度和提高離子利用率，帶來4D-蛋白質組學在鑒定深度、檢測周期、定量準確性等性能的全面提升。Scanning-SWATH技術［31］利用四級桿的連續(xù)掃描功能，通過設定更小的質量隔離窗口和超高的掃描速度，提供更好的譜圖專屬性和靈敏度，提高定性、定量的準確度。綜上，DIA技術是一種高通量的蛋白質組學研究手段，可應用于COVID-19大樣本量高通量差異蛋白質組學研究和翻譯后修飾位點分析。

2.2.3 靶向數據采集技術

靶向數據采集技術針對目標蛋白/肽段離子進行靶向監(jiān)測和采集，主要采集方式包括基于三重四級桿質譜儀的多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）和基于高分辨質譜儀的平行反應 監(jiān) 測（parallel reaction monitoring，PRM）。MRM技術選擇目標肽段的特定母離子和子離子對進行靶向質譜分析，最大限度排除干擾離子的影響，顯著提高了目標肽段的信噪比，常用于高通量靶向蛋白質定量。該技術具有靈敏度高、準確性好、特異性強的優(yōu)點，被譽為質譜定量的“金標準”，特別適用于蛋白質標志物的高通量驗證［32］。PRM是MRM的一種衍生技術，是基于高分辨、高精度質譜進行靶向定量，PRM選擇目標肽段的特定母離子碎裂，對母離子得到的所有子離子進行全掃描。PRM基于高分辨質譜，精度更高、抗背景干擾能力更強［33-34］。在應用方面，MRM/PRM技術可替代傳統(tǒng)的Western blot技術，能夠實現在大規(guī)模生物樣本中進行高通量的目標蛋白質驗證，提高實驗效率。在COVID-19研究中，MRM和PRM技術常用于發(fā)現的潛在生物標志物和藥物靶標的驗證。

3 蛋白質組學在COVID-19研究中的應用

基于質譜的蛋白質組學技術進行COVID-19研究的工作流程如圖3所示，通過對病原體和感染后的宿主細胞、組織、體液等進行蛋白質組學研究，可以快速全面的篩選到重要的目標蛋白，并結合生物信息學分析、蛋白質相互作用分析等，為揭示COVID-19相關的生物標志物、研究分子機制、識別潛在藥物靶點提供了一種有效的策略。

3.1 面向精準診斷的生物標志物研究

生物標志物是指一種可客觀檢測和評價的指標性物質，作為正常生物學過程、病理過程或治療干預藥理學反應的指示因子［35］。生物標志物的發(fā)現對于疾病的早期診斷、治療監(jiān)測、疾病分級以及預后評估等領域具有重要的價值。隨著質譜技術的進步以及生物信息學與統(tǒng)計學算法的發(fā)展，運用蛋白質組學方法尋找和發(fā)現有價值的生物標志物是目前研究的一個熱點。其中鼻咽拭子、唾液、血液和尿液等體液樣本具有低侵入性、易于獲取、易于采集和處理、成本低等優(yōu)點，成為人類疾病標志物研究的最佳樣品來源［36］。

3.1.1 鼻咽拭子檢測和病毒顆粒標志物

鼻咽部位是SARS-CoV-2發(fā)生感染和免疫反應的“第一戰(zhàn)場”，因此，鼻咽拭子、唾液樣本等常用于進行病毒顆粒的檢測和診斷標志物研究。病毒顆粒是由病毒的結構蛋白（S蛋白、M蛋白、E蛋白、N蛋白）等以及遺傳物質RNA組成。采用蛋白質組學技術對SARS-CoV-2進行研究，可以獲得病毒顆粒的蛋白質組成及其修飾信息，從而發(fā)現特征性蛋白和特征多肽，用于病毒檢測和疾病的早期診斷（表1）。

基于MALDI-TOF MS的蛋白質組學技術用于SARS-CoV-2快速檢測顯示了較好的準確度。Nachtigall等［24］采用MALDI-TOF MS技術結合機器學習的方法對362份鼻拭子樣本（211份SARSCoV-2陽性樣本和151份陰性樣本）進行檢測。研究發(fā)現，支持向量機模型（support vector machines，SVM）分析得到了最高的準確率（93.9%），陽性樣本的誤判率為7%，陰性樣本的誤判率為5%。結果表明，MALDI-TOF MS和機器學習分析可用于檢測鼻拭子樣本中的SARS-CoV-2。Iles等［25］采用MALDI-TOF MS進行SARS-CoV-2病毒蛋白檢測，結果顯示，在假病毒、唾液和漱口水樣本中均能檢出S蛋白的S1和S2b片段，其中S1片段的檢測率和特異性接近100%。該方法取樣容易、樣品處理簡單、分析速度快、準確率高，這些特點揭示了MALDI-TOF MS技術的臨床診斷應用價值。

高通量DDA/DIA技術結合PRM/MRM靶向定量的策略發(fā)現多個特征多肽可作為SARS-CoV-2病毒顆粒的檢測標志物。Gouveia等［37］采用DDA技術鑒定到101條來自SARS-CoV-2的特征肽段，通過排除與其他物種有交叉和有變異的多肽，最終選擇S蛋 白 的3個 特 征 肽（FQTLLALHR、HTPINLVR、LQSLQTYVTQQLIR）和M蛋白的1個特征肽（VAGDSGFAAYSR）作為最佳特征肽段可用于SARS-CoV-2感染的檢測。Bezstarosti等［38］通過DDA技術鑒定到9個SARS-CoV-2病毒蛋白；通過PRM靶向定量技術在臨床病人鼻咽拭子和痰液樣本中定量到4個特征肽段：3個來自N蛋白（GFYAEGSR、ADETQALPQR、AYNVTQAFGR），1個來自M蛋白的特征肽段可應用于SARS-CoV-2感染的檢測。Cazares等［39］建立了基于PRM技術檢測SARS-CoV-2病毒S蛋白和N蛋白的檢測方法，S蛋白的特征肽（FQTLLALHR）、N蛋白的特征肽（DQVILLNK）可用于病毒檢測。Cardozo等［40］采用DDA技術結合PRM技術的策略建立高通量SARS-CoV-2臨床質譜檢測方法，可直接從鼻咽和口咽拭子中檢測SARS-CoV-2 N蛋白的肽段，通過在985例臨床樣本中對該方法進行定性和定量驗證，準確度>87%，特異性>95%。以上結果揭示了DDA/DIA技術結合PRM/MRM靶向定量的策略具有高通量、高靈敏度、高準確度的特點，顯示了MRM/PRM技術的臨床診斷應用價值。

綜合以上研究結果，目前用于鼻咽拭子檢測的病毒顆粒標志物主要來源于SARS-CoV-2的結構蛋白N蛋白、M蛋白和S蛋白。有以下特征肽段可作為SARS-CoV-2感染診斷的標志序列：N蛋白的特征 肽 段GFYAEGSR、RGPEQTQGNFGDQELIR、ADETQALPQR、DQVILLNK；M蛋白的特征肽段EITVATSR、VAGDSGFAAYSR；S蛋白的S1片段和特征肽段QIAPGQTGK、FQTLLALHR、HTPINLVR、LQSLQTYVTQQLIR。這些多肽序列有望應用于SARS-CoV-2感染的臨床篩查和病毒檢測。

Table 1 Application of proteomics in the study of SARS-CoV-2 nasopharyngeal swab test and viral particle biomarkers表1蛋白質組學在SARS-CoV-2鼻咽拭子檢測和病毒顆粒標志物研究中的應用

3.1.2 血漿/血清生物標志物

血液是臨床檢測中最常用的樣本。血液由血漿和血細胞組成，血漿是血液中加入抗凝劑分離后的上清液；血清為未加入抗凝劑，經血液凝固后析出或離心后上層的液體，血清與血漿的主要區(qū)別是血清中不含纖維蛋白原，血漿和血清蛋白質表達的變化都可反映人體生理或病理狀態(tài)，可用于疾病診斷、早期篩查以及預后評估等領域。通過對比COVID-19患者和健康人的血清/血漿蛋白質含量差別確定差異表達蛋白質，并分析相關的差異蛋白參與的分子通路和生物學功能（表2）。這些差異蛋白可作為診斷疾病和監(jiān)測疾病進程的標志物，可以預測疾病的易感性和臨床結局。

基于TMT標記定量的蛋白質組學研究發(fā)現多個潛在的不同疾病進程的COVID-19血漿/血清生物標志物。Shen等［41］采用TMT標記定量技術進行COVID-19患者血清的蛋白質組學和代謝組學表征，利用機器學習模型篩選到22個重要的蛋白質和7個代謝物，可用于進行嚴重COVID-19患者的預測和分類。這些差異化合物介導的病理生理途徑包括免疫或炎癥反應、血小板脫顆粒、凝血和代謝途徑，其中最顯著上調的是急性期蛋白，包括SAA1、SAA2、SAA4、CRP、SERPINA3、SAP/APCS等。Yan等［42］結合蛋白質組學、代謝組學分析技術和患者臨床生化檢測指標發(fā)現，血清乳酸脫氫酶（LDH）水平與COVID-19的嚴重程度有關，血清LDH水平升高可能是缺氧和炎癥引起的組織損傷的結果。Shu等［43］采用TMT標記定量技術進行COVID-19血漿生物標志物研究，通過機器學習方法篩選了11個宿主蛋白可組合作為不同疾病進程的生物標志物，其中ORM1/AGP1、ORM2、FETUB和CETP可用于鑒別COVID-19患者和健康對照；CETP、S100A9和CRP可用于預測COVID-19重癥患者是否有致命的結局；AZGP1、ORM2和CFI可用于預測輕癥到重癥的臨床結局；SERPINA3/ACT、LCP1/LPL和PI16的生物標志物組合可用于預測康復。

基于DIA技術的蛋白質組學研究發(fā)現，多個潛在的血漿/血清生物標志物，可用于進行嚴重COVID-19患者的預測和分類。Messner等［44］基于DIA技術篩選到27種差異表達的潛在生物標志物可用于進行嚴重COVID-19患者的預測和分類，其中補體系統(tǒng)蛋白（C1R、C1S、C8A、CFB、CFI、CFH）、急性反應期蛋白（CRP、SAA1、SAA2、HP）、白介素-6信號通路因子（ITIH4、LRG1、LBP）隨疾病程度增加而上調，而載脂蛋白（APOA1、APOC1）、ALB、GSN、TF隨疾病程度增加而下調。Geyer等［45］應用基于diaPASEF的4D-蛋白質組學技術檢測COVID-19患者血清的54 d縱向時間表達變化，結果顯示先天免疫系統(tǒng)的蛋白質如CRP、SAA1、CD14、LBP和LGALS3BP在感染過程的早期下降，25 d后又逐漸升高；凝血調節(jié)劑（APOH、FN1、HRG、KNG1、PLG）和脂質穩(wěn)態(tài)相關蛋白（APOA1、APOC1、APOC2、APOC3、PON1）在疾病過程中逐漸升高。其中促炎急性期蛋白ITIH4在死亡病人取樣第1天就顯著升高，其可能會成為預測死亡風險的生物標志物。Vollmy等［46］采用基于DIA技術的蛋白質組學方法篩選到9個蛋白質生物標志物組合（HRG、FETUB、ITIH1、ITIH2、HPR、SERPINA3、LCAT、IGFALS、IGFBP3）用于死亡風險評估和預測。Chen等［47］結合轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學進行血漿生物標志物分析，發(fā)現HGFAC、F13A1和CLEC3B可作為血漿蛋白質生物標志物。Messner等［31］應用Scanning SWATH采集技術進行COVID-19血漿高通量蛋白質組學分析，僅1 min梯度即可定量190個血漿蛋白質，該研究新發(fā)現11個在COVID-19患者中差異表達的生物標志物，主要為急性期反應和補體級聯反應相關蛋白。

綜合以上血漿/血清蛋白質組學研究結果，COVID-19血漿/血清生物標志物主要是與急性期反應、補體級聯反應、炎癥反應、免疫反應、凝血級聯反應和脂質代謝相關的蛋白質，其中急性期反應蛋白SAA1、CRP在多個研究中發(fā)現對預測疾病嚴重性進程具有重要意義。

Table 2 Application of proteomics in the study of COVID-19 plasma/serum biomarkers表2蛋白質組學在COVID-19血漿/血清生物標志物研究中的應用

續(xù)表2

3.1.3 尿液生物標志物

尿液樣本因非侵入性、易獲取、可反映疾病的動態(tài)變化等優(yōu)點，在生物標志物研究中越來越受關注。尿液沒有穩(wěn)態(tài)調控機制，能更早的反應疾病變化［48］。通過對比COVID-19患者和健康人的尿液蛋白質含量差別確定差異表達蛋白質，并分析其參與的分子通路和相關生物學功能（表3），可以為早期診斷和疾病進程研究提供重要意義。

Table 3 Application of proteomics in the study of COVID-19 urine biomarkers表3蛋白質組學在COVID-19尿液生物標志物研究中的應用

Bi等［49］全面分析了COVID-19患者血清和尿液的蛋白質組學和代謝組學數據，結果顯示尿液蛋白質組比血清蛋白質組有更高的檢測靈敏度，并建立了基于20個尿液蛋白質的生物標志物組合，具有對COVID-19輕重型進行分類預測的潛力。Tian等［50］采用基于diaPASEF的4D-蛋白質組學技術進行COVID-19尿液生物標志物和感染機制研究，發(fā)現在COVID-19感染早期發(fā)生免疫抑制和緊密連接障 礙，其 中MT1G、LPL、β2M、PRKACA、FOLR2和APOA4發(fā)生顯著改變，有望作為尿液生物標志物。Li等［51］采用DDA技術進行COVID-19尿液蛋白質組學分析，發(fā)現COVID-19患者補體系統(tǒng)、缺氧反應分子上調；而血小板脫顆粒、糖代謝和脂代謝下調。其中，上調的蛋白HYOU1、D-dimer、SERPIND1和 下 調 的 蛋 白NPC2、APOA1、CUBN有望作為尿液生物標志物。Chavan等［52］采用TMT標記定量技術進行尿液蛋白質組學分析，發(fā)現在COVID-19陽性樣本中，急性期反應、先天免疫反應、補體激活的調節(jié)和血小板激活過程相關蛋白上調；細胞黏附、細胞外基質組織和白細胞遷移過程相關蛋白下調。Li等［53］采用定量蛋白質組學和代謝組學方法全面分析了COVID-19患者血漿和尿液中的分子變化，發(fā)現了一系列生物標志物。在驗證組尿液樣本中，生物標志物組合預測AUC值達到0.904。Ni等［54］分析了大量基于LC-MS/MS的尿液蛋白質組學數據，發(fā)現在1 925名成人的尿液樣本中80.1%的樣本檢測到ACE2，284名健康兒童中14.1%的樣本檢測到ACE2。研究證明，尿液中ACE2可以通過基于質譜的蛋白質組學方法檢測，尿液ACE2水平在大隊列長期監(jiān)測結果中較穩(wěn)定，并且與多種生理和病理條件有關。ACE2有望作為預測SARS-CoV-2感染風險及其并發(fā)癥的生物標志物。

綜合以上尿液蛋白質組學結果，尿液蛋白質組比血清蛋白質組有更高的檢測靈敏度，COVID-19尿液生物標志物與血漿/血清生物標志物反映了相同的生物學通路的變化，包括急性期反應、補體級聯反應、炎癥反應、免疫系統(tǒng)、凝血和代謝途徑等。尿液樣本具有完全無創(chuàng)、可連續(xù)收集、更容易檢測低豐度蛋白、早期發(fā)現、檢測敏感、特異性強等優(yōu)勢［49］，被認為是鑒定生物標志物的理想來源，并且在大隊列長期監(jiān)測結果中較穩(wěn)定，有望作為COVID-19早期診斷和疾病進程研究的重要生物標志物來源［55］。

3.2 面向SARS-CoV-2感染的分子機制研究

蛋白質組表達的改變不僅可以用于發(fā)現生物標志物，而且可以揭示疾病的發(fā)生發(fā)展變化過程。盡管現在對COVID-19進行了快速和廣泛的研究，但對其發(fā)病機制，特別是病理生理條件下的分子機制仍然知之甚少。通過蛋白質組學技術可以快速全面的篩選到重要的目標蛋白，大大縮短實驗周期，并結合生物信息學通路分析、蛋白質相互作用分析，為揭示與SARS-CoV-2致病性相關的分子機制提供了一種有效的策略。目前，基于蛋白質組學技術對SARS-CoV-2感染的分子機制研究主要采用病毒感染的細胞模型和患者組織或體液樣本進行研究。

3.2.1 基于病毒感染的細胞模型研究

病毒感染可以通過操縱宿主代謝來啟動，適應宿主代謝環(huán)境是病毒病原體復制、繁殖和戰(zhàn)勝它們入侵的鄰近細胞的先決條件［56］。為了解感染后宿主蛋白質組的變化、深入認識發(fā)病機理、探究生物學機制，通常必須借助病毒感染細胞的模擬樣本。Bojkova等［57］通過研究病毒感染的細胞模型發(fā)現SARS-CoV-2感染后重塑了蛋白質翻譯、剪接、碳代謝、核酸代謝和蛋白質穩(wěn)態(tài)等中心細胞途徑。

蛋白質的磷酸化對蛋白質的功能具有重要影響，可以改變細胞的信號傳導、發(fā)育和分化以及周期控制和代謝。Bouhaddou等［58］采用Vero E6細胞模型進行了SARS-CoV-2感染后的磷酸化蛋白質組學研究，發(fā)現SARS-CoV-2感染調節(jié)宿主激酶信號，其中p38絲裂原活化蛋白激酶（p38/MAPK）、酪蛋白激酶II（CK2）、鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶II（CAMK2G）等激酶活性上調，而周期蛋白依賴性激酶（CDK）、蛋白激酶B（AKT）以及Rho家族的激酶活性出現下調。結合細胞學和生物化學的實驗證明，病毒N蛋白能夠同CK2結合并進而調節(jié)細胞骨架的組裝，而病毒侵染會導致p38/MAPK的升高并導致細胞周期中止。Stukalov等［59］用SARS-CoV-2、SARS-CoV分 別 感 染A549肺 癌 細胞，分析了病毒對宿主細胞轉錄組、蛋白質組、泛素化和磷酸化修飾組的影響。該研究共定量到16 399個磷酸化位點，其中4 643個磷酸化位點在病毒感染后出現顯著變化，與細胞存活、細胞周期進展、細胞生長和動力、應激反應和DNA損傷反應有關的中心激酶（CDKs、AKT、MAPKs、ATM和CHEK1）參與了調控。細胞相互作用分析結果顯示，SARS-CoV-2調節(jié)多種細胞功能，如先天免疫調節(jié)通路、膽固醇代謝等，SARS-CoV和SARSCoV-2病毒感染均導致I型干擾素反應下調并激活促炎信號。

蛋白質糖基化修飾作為最常見也是最重要的一種翻譯后修飾種類，在病毒的生命周期中起著不可替代的作用，包括調節(jié)蛋白質折疊、干預受體結合、影響蛋白質降解率、調控宿主偏好和屏蔽免疫系統(tǒng)識別的免疫原性表位等［60-61］。Watanabe等［60］研究表達于293F細胞系SARS-CoV-2的S蛋白，發(fā)現22個N-糖基化位點均發(fā)生N-糖基化修飾，糖鏈類型包括高甘露糖型、雜合型和復雜型，其中高甘露糖型和復雜型糖鏈占比較高，這些位點上15%的糖鏈含至少一個唾液酸殘基，52%的糖鏈發(fā)生了巖藻糖基化。Dong等［62］采用LC-MS/MS技術對SARS-CoV-2的S蛋白進行O-糖基化修飾分析，鑒定到27個O-糖基化位點和66種O-糖鏈結構，其中26種含唾液酸殘基、37種發(fā)生了巖藻糖基化。Tian等［61］采用基于質譜的糖蛋白質組學技術，從SARS-CoV-2病毒顆粒中提取的S蛋白上鑒定到了17個O-糖基化修飾位點，其中有11個位點發(fā)生在N-糖基化位點1至3個氨基酸附近（“N±1~3”），其中的4個位點發(fā)生了唾液酸修飾（T236、S659、T1076和T1077），通過定點突變驗證N-糖基化位點是這些O-糖基化位點出現的先決條件，并將這一現象命名為“O-Follow-N”規(guī)律（表4）。糖基化修飾對于COVID-19發(fā)病機制的探索、疫苗和治療藥物的設計開發(fā)，以及檢測試劑盒的生產具有重要意義。

Wang等［63］采用4D蛋白質組學技術和生物成像技術，通過模擬肺泡-微血管屏障，揭示了SARS-CoV-2感染對于肺泡上皮細胞和肺微血管內皮細胞的損傷機理。在肺泡上皮細胞中，細胞周期、細胞增殖和細胞程序性死亡等生物學過程受到顯著影響。SARS-CoV-2感染肺泡上皮細胞后，可激活其抗病毒和先天免疫反應，上調促炎細胞因子表達，如IL-1α和干擾素。這些細胞因子釋放到細胞外空間，并進一步誘發(fā)相鄰肺微血管內皮細胞的損傷，最終導致肺泡-微血管屏障破壞。

綜合以上基于病毒感染的細胞模型研究結果，揭示了SARS-CoV-2感染細胞后重塑了蛋白質翻譯、剪接、碳代謝、核酸代謝和蛋白質穩(wěn)態(tài)等中心細胞途徑，細胞周期、細胞增殖和細胞程序性死亡等生物學過程受到顯著影響。

Table 4 Partial reports of N-glycosylation and O-glycosylation of SARS-CoV-2 spike protein based on glycoproteomics表4基于糖蛋白質組學技術的SARS-CoV-2刺突蛋白N-糖基化和O-糖基化修飾的部分報道

3.2.2 基于患者組織或體液樣本研究

通過對COVID-19患者的組織和體液樣本的蛋白質組學分析，可以快速全面的得到所有蛋白質變化的信息，為揭示與SARS-CoV-2致病性相關的分子機制提供了一種有效的策略。目前研究結果顯示，COVID-19患者中與免疫反應和炎癥反應、代謝途徑、凝血級聯反應等通路相關的蛋白質嚴重失調。

COVID-19患者適應性免疫應答降低，炎癥反應的多個通路被激活。Nie等［20］通過蛋白質組學技術，系統(tǒng)分析了COVID-19去世患者7種器官的組織病理學改變。在肺中檢測到兩種免疫關鍵蛋白癌胚抗原相關細胞黏附分子1（CEACAM1）和CD276蛋白上調，在肺和脾中檢測到淋巴細胞特異性酪氨酸蛋白激酶（LCK）下調，表明T細胞介導的免疫反應在肺和脾臟受到抑制；同時脾臟中T細胞衰竭和單核細胞生物標志物上調提示高炎癥反應；在腎皮質中檢測到涉及炎癥反應的多個通路被激活，包括LPS/IL-1介導的RXR功能抑制、急性期反應、toll樣受體信號、IL-6信號和NF-kB信號。Li等［64］采用定量蛋白質組學方法對COVID-19病人外周血單核細胞（PBMCs）進行分析，發(fā)現COVID-19患者體內的T細胞激活、中性粒細胞介導的免疫反應通路發(fā)生顯著變化，通路分析結果揭示了病毒蛋白與細胞炎癥和先天性免疫反應相關蛋白的特異性相互作用，其中Nsp10與NF-κB抑制因子（NKRF）相互作用促進IL-8的誘導，這有助于IL-8介導的中性粒細胞趨化和COVID-19患者過度炎癥反應。Chen等［47］對不同疾病程度的COVID-19患者以及健康對照血液樣本進行蛋白質組學分析。結果顯示，輕癥和重癥患者免疫反應表現不同，SARS-CoV-2在輕癥患者的特點是入院時T細胞信號激活和T細胞分化富集，隨后迅速減少；在重癥患者中持續(xù)檢測的T細胞信號呈陰性。重癥患者在整個住院期間，IFN信號持續(xù)被激活，而先天性免疫信號的負調控因子（如TRIM59、USP21和NLRC3）下調。與輕癥患者相比，重癥患者IL-6、IL-8和IL-10水平顯著升高。

COVID-19患者體內代謝途徑紊亂，脂蛋白代謝、糖酵解和三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）途徑失調，脂肪酸β氧化和氧化磷酸化被激活。Chen等［47］通過血液多組學分析結果顯示，輕度和重度COVID-19患者的可溶性低密度脂蛋白受體（sLDLR）、卵磷脂膽固醇酰基轉移酶（LCAT）、膽固醇酯轉移蛋白（CETP）等脂蛋白代謝相關關鍵蛋白水平明顯降低；COVID-19患者TCA循環(huán)周期中的酶如ACO2、IDH、OGDH、DLD、SDH和MDH較低，而脂肪酸合成的關鍵酶（乙酰輔酶A羧化酶（ACAC）和脂肪酸合成酶（FASN））升高；另外，血漿乳酸和乳酸脫氫酶也同時顯著升高。這些數據揭示了SARS-CoV-2感染導致脂蛋白代謝、糖酵解和TCA循環(huán)的失調。Nie等［20］對COVID-19去世患者7種器官的蛋白質組學研究中發(fā)現多種代謝過程被抑制，包括糖原分解、半乳糖降解和糖酵解；而在大多數器官中，脂肪酸β氧化和氧化磷酸化被激活，這表明一種轉換到高效率的能量生產模式。Shen等［41］對COVID-19患者血漿蛋白質組學和代謝組學分析，發(fā)現多種載脂蛋白的失調，包括APOA1、APOA2、APOH、APOL1、APOD和APOM。載脂蛋白在膽固醇反向轉運中起重要作用，揭示了膽固醇代謝失調。Chen等［65］分析了COVID-19患者在發(fā)病和康復階段的血清蛋白質組，結果顯示COVID-19患者在疾病期和恢復期膽固醇代謝和心肌功能相關通路長期紊亂。

COVID-19患者發(fā)生凝血功能障礙。COVID-19患者血液臨床凝血試驗結果顯示D-dimer、凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）上調，揭示血小板脫顆粒和凝血級聯功能障礙與COVID-19的 嚴 重 程 度 密 切 相 關［43，66-67］。D’Alessandro等［68］對COVID-19患者的血清蛋白質組分析，結果顯示凝血/纖溶級聯反應相關蛋白，包括SERPINA1、SERPINA3、SERPINF2等絲氨酸蛋白酶抑制劑和羧肽酶（CPB2/TAFI）的蛋白表達水平顯著增加。Nie等［20］對COVID-19患者7種器官的蛋白質組學研究數據揭示了參與凝血、抗凝和纖溶系統(tǒng)的多種蛋白質失調，其中凝血酶原（F2）、凝血因子XI、XII、XIIA（F11、F12和F13A1）在COVID-19患者中均出現異常；纖維蛋白原α鏈、γ鏈和β鏈增加（FGA、FGG和FGB），這些蛋白質可以分裂成纖維蛋白，從而形成血凝塊；在COVID-19器官中檢測到多種絲氨酸蛋白酶抑制劑的失調：肝素輔因子2（SERPIND1）是一種凝血酶的抑制劑和肝素的輔因子，纖溶酶原激活物抑制劑（SERPINE1）是一種主要的纖溶酶抑制劑，可以破壞血液凝塊。腎皮質中SERPIND1的下調和SERPINE1的上調可能是導致COVID-19腎皮質微血栓形成的原因。同時，COVID-19患者肺、腎、下肢靜脈均可見微血栓，微血栓的形成是凝血、抗凝和纖溶系統(tǒng)之間的不平衡造成的。

綜合以上蛋白質組學研究結果，揭示了COVID-19感染患者中免疫反應和炎癥反應、代謝紊亂、凝血級聯反應相關的蛋白質嚴重失調，通過影響上述通路而引發(fā)機體功能障礙和代謝紊亂是SARS-CoV-2感染機制之一。

3.3 面向精準治療的藥物靶標研究

目前，COVID-19的治療藥物作用機制主要可以歸納為兩大類：一類是阻止病毒和宿主細胞結合，作用的靶位是S蛋白、ACE2、TMPRSS2等，如目前處于臨床試驗階段的該類藥物有TMPRSS2抑制劑甲磺酸卡莫他司、單克隆抗體藥物等；另一類是阻止新病毒在宿主細胞內的產生，抑制病毒復制和翻譯過程，作用的靶位是RdRp或者3CLpro等，如目前處于臨床試驗階段的該類藥物有瑞德西韋、法維拉韋、利巴韋林、洛匹那韋和法匹拉韋等［15］。盡管這些在體外顯示出抗病毒活性的藥物已進入臨床研究，但是一些藥物臨床試驗結果顯示對重癥患者無效或治療價值有限。到目前為止，還沒有治療COVID-19的特效藥物［69］。蛋白質組學研究可以輔助繪制病原體在感染、入侵、持久性和發(fā)病機制后對宿主引起的變化的全景圖，并有助于確定新的治療靶點［53］。

Bojkova等［57］研究證明，SARS-CoV-2重塑了人類細胞中的翻譯、剪接、碳代謝、核酸代謝和蛋白質穩(wěn)態(tài)等中心細胞途徑。該研究測試了多個關鍵途徑的抑制劑。a.翻譯抑制劑：環(huán)己亞胺（翻譯伸長抑制劑）和依米?。?0S核糖體蛋白S14抑制劑）可抑制SARS-CoV-2在細胞中的復制；b.剪接體抑制劑：以剪接因子SF3B117為靶點的剪接體抑制劑pladienolide B，可在對人類Caco-2細胞無毒的濃度下抑制SARS-CoV-2病毒復制；c.糖酵解抑制劑：己糖激酶的抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖可阻斷糖酵解，抑制SARS-CoV-2在Caco-2細胞中的復制；d.核苷酸合成抑制劑：鳥苷核苷酸從頭合成中的限速酶肌苷單磷酸脫氫酶（IMPDH）的抑制劑利巴韋林，可抑制SARS-CoV-2在細胞中的復制；e.蛋白酶穩(wěn)態(tài)擾動抑制劑：p97是蛋白質穩(wěn)態(tài)的關鍵成分，p97的抑制劑NMS-873在低納米摩爾濃度下抑制SARS-CoV-2復制。該研究為COVID-19的治療提供了新的潛在靶點。Bouhaddou等［58］通過分析受感染細胞的磷酸化圖譜，揭示現有的激酶靶向藥物有望阻止SARS-CoV-2劫持宿主細胞。通過對全景磷酸化圖譜中失調的激酶和通路分析，找到87種相關的藥物和化合物。通過測試發(fā)現，p38、CK2、CDKs、AXL和PIKFYVE等激酶家族的抑制劑顯示出了強大的抗病毒活性，對COVID-19的治療方法提供了新的思路和依據。

Gordon等［70］鑒定了332個SARS-CoV-2與人類蛋白質之間的高可信度蛋白質-蛋白質相互作用，這些相互作用與蛋白質販運、翻譯、轉錄和泛素化調控等多個生物學過程有關。以這些相互作用為靶點，篩選到兩類有效降低SARS-CoV-2病毒感染的分子：mRNA翻譯抑制劑（zotatifin、ternatin-4和PS3061）和Sigma1、Sigma2受體的調節(jié)劑（氟哌啶醇、PB28、PD-144418和羥氯喹）。研究發(fā)現，PB28的效力是羥氯喹的20倍，mRNA翻譯抑制劑顯示出較強的病毒抑制作用，使得這類化合物成為極具吸引力的潛在藥物。Stukalov等［59］以病毒-宿主蛋白相互作用為靶點，測試了48種藥物對SARS-CoV-2的影響。其中用于治療癌癥和自身免疫性疾病的B-RAF抑制劑（索拉非尼、瑞戈非尼、達拉菲尼）、JAK1/2抑制劑（巴瑞替尼）和MAPK抑制劑（SB-239063）可導致病毒生長的顯著增加；而DNA損傷誘導物（替拉扎明、Rabusertib）和mTOR抑制劑（雷帕霉素）可抑制病毒生長；FLT3酪氨酸激酶抑制劑（富馬酸吉列替尼）、AKT抑制劑（Ipatasertib）、MMPs抑制劑（普馬司他和馬立馬司他）的抗病毒活性最高。這些化合物對SARS-CoV-2的復制具有明顯的抑制作用，但對細胞生長無影響或影響較小。這些研究基于宿主-病毒潛在的蛋白質相互作用分析，為后續(xù)進行藥物篩選和開發(fā)抗SARS-CoV-2相關藥物研究提供了新的思路和策略。

明確藥物靶標是治療COVID-19的必由之路。21世紀以來已經發(fā)生了3次由冠狀病毒引起的重大傳染病疫情，但截止目前仍未發(fā)現特效治療藥物。SARS-CoV-2未來可能會在人類社會長期存在，成為全人類需要面對的共同挑戰(zhàn)。因此，需要開發(fā)針對SARS-CoV-2及廣譜冠狀病毒的特效藥物。蛋白質組學在尋找藥物靶標方面具有高通量、高靈敏的優(yōu)勢，是未來篩選和開發(fā)抗SARS-CoV-2藥物的重要技術手段。

4 總結與展望

自COVID-19大流行以來，應用基于質譜的蛋白質組學技術進行COVID-19生物標志物研究、疾病機制研究、藥物靶點篩選的研究與應用已經展現巨大的潛力。采用蛋白質組學技術在鼻咽拭子等樣本中成功鑒定和定量來自SARS-CoV-2病毒顆粒的多個特征肽段，這些特征肽段可作為潛在的SARSCoV-2感染快速篩查和診斷的標志物；高通量DDA/DIA技術結合PRM靶向定量的策略，從COVID-19患者的血清/血漿或尿液樣本中篩選與感染相關的蛋白質，發(fā)現可作為診斷疾病和監(jiān)測疾病進程的標志物，可以預測疾病的易感性和臨床結局；蛋白質翻譯后修飾研究、SARS-CoV-2與宿主細胞相互作用蛋白質組學研究，為揭示與SARSCoV-2致病性相關的分子機制提供了一種有效的策略；基于蛋白質組學進行病毒-宿主蛋白質相互作用分析，在尋找藥物靶標方面具有高通量、高靈敏的優(yōu)勢，為抗SARS-CoV-2藥物研究提供重要的技術手段。

雖然應用蛋白質組學技術在COVID-19研究中取得較大進展，但仍有一些亟待解決的技術瓶頸，例如：a.目前質譜技術的自動化程度還有待提高，前處理過程也相對復雜，需要建立自動化和通量化的微量臨床樣本前處理技術體系；b.目前臨床微量樣本的質譜數據采集過程涉及較多步驟和參數，需要建立完整的行業(yè)標準以規(guī)范實驗過程，保證實驗間的重復性；c.針對大隊列臨床微量樣本的蛋白質組學數據解析，還需要進一步提升鑒定和定量軟件的靈敏度和準確度，發(fā)現低豐度蛋白質和標志物；d.蛋白質翻譯后修飾（如S蛋白的糖基化以及蛋白質組的磷酸化、泛素化等）較復雜，樣品中翻譯后修飾蛋白質含量低、動態(tài)范圍廣給相關研究帶來了很大的挑戰(zhàn)，需要提高大規(guī)模翻譯后修飾位點的鑒定和定量的能力；e.目前發(fā)現的蛋白質標志物和藥物靶點均處于基礎研究階段，需要結合生物學和免疫學方法，實現候選蛋白分子的規(guī)模化驗證。更先進的蛋白質組學技術必將促進COVID-19的精準診療研究。

隨著質譜儀器性能和算法軟件的不斷發(fā)展與革新、相關技術瓶頸的不斷突破，蛋白質組學數據采集和數據分析全流程標準化體系的建立，其應用的廣度及深度將會迅速發(fā)展。蛋白質組學樣品制備自動化技術逐漸成熟，可以實現短時間內對數以千計樣本的快速前處理；隨著大隊列臨床蛋白質組學的發(fā)展，生物標志物走向臨床已成為發(fā)展趨勢，單次分析可同時精確地檢測出幾十個甚至上百個生物標志物，并可檢測出多種傳統(tǒng)診斷技術無法檢測到的生物標志物；將修飾蛋白質組學及蛋白質相互作用方法學應用于臨床研究，實現修飾位點和藥物靶點的精準檢測，將拓展蛋白質分子機制的研究和藥物靶點的發(fā)現。隨著SARS-CoV-2突變株的發(fā)現，COVID-19發(fā)病機制愈加復雜，其精準診療面對更嚴峻的挑戰(zhàn)，蛋白質組學技術有望走向臨床成為廣泛接受的COVID-19診療手段。