miR-103 通過(guò)NF-κB 通路上調(diào)MGMT 表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞紫杉醇耐藥

高曉丹 王麗潔 王書夢(mèng) 蘇 潔

胃癌（gastric carcinoma）是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤。紫杉醇（paclitaxel，PTX）作為天然抗癌藥物，在胃癌化療中療效確切[1]。但獲得性耐藥的出現(xiàn)往往導(dǎo)致PTX 治療失敗。微小RNA-103（miRNA-103，miR-103）是一種可參與肝癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等惡性生物學(xué)行為的miRNA[2-4]。研究顯示，miR-103 參與惡性腫瘤化療耐藥[5]。但miR-103 與胃癌PTX 耐藥的關(guān)系還不明確。核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路已被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤化療耐藥中發(fā)揮作用[6-7]。最新研究顯示，miR-103 能夠靶向TLR4 而抑制NFκB 磷酸化水平[8]，提示miR-103 在NF-κB 信號(hào)通路中可能發(fā)揮抑制作用。O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）是NF-κB 參與惡性腫瘤細(xì)胞耐藥的重要下游信號(hào)分子[9]。但目前miR-103 是否通過(guò)NF-κB/MGMT 介導(dǎo)胃癌PTX 耐藥還不清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建PTX 耐藥胃癌細(xì)胞，觀察miR-103 對(duì)胃癌PTX 耐藥的影響，并探討NF-κB/MGMT 在其中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì) 胞 人胃癌NCI-N87 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典藏培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 主要試劑 PTX（批號(hào)20211212）購(gòu)自南京本草益康生物科技有限公司；miR-103 抑制物（miR-103 inhibitor）轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自上海吉瑪公司；四甲基偶氮唑鹽比色[3-（4，5-Dimethylthia-zol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]和結(jié)晶紫染液購(gòu)自上海碧云天公司；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒（含引物）（批號(hào)0000173942）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTqPCR）試劑盒（批號(hào)0000170712）購(gòu)自美國(guó)Promega公司；miR-103 和U6 合成引物購(gòu)自上海生工生物；RIPA 總蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；胎牛血清（FBS，批號(hào)2132094P）、DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)8120033）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)AE29449009）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；NF-κB p65（1∶1000）（批號(hào)06）、p-NF-κB p65（1∶1000）（批號(hào)12）、IκBα（1∶1000）（批號(hào)23）抗體及熒光二抗（1∶500）（批號(hào)02）抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司；MGMT（1∶1000）（批號(hào)GR3301548-3）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；GAPDH（1∶1000）（批號(hào)15）抗體購(gòu)自南京Bio-World 公司；抗鼠和抗兔IgG、HRP-linked 二抗（批號(hào)G1421、G1526）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 N87/PTX 構(gòu)建和細(xì)胞培養(yǎng) 采用逐漸增加PTX濃度，間歇誘導(dǎo)的方法構(gòu)建N87/PTX 細(xì)胞。N87 和N87/PTX 細(xì)胞以DMEM 全培養(yǎng)基（含10%FBS 和1%青-鏈霉素）進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，含5%CO2的無(wú)菌環(huán)境。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-103 inhibitor 抑制內(nèi)源性miR-103將N87/PTX 細(xì)胞接種于6 孔板，培養(yǎng)過(guò)夜。次日，將10 μL miR-103 抑制物（inhibitor）和陰性對(duì)照（NC）分別用 DMEM 高糖培養(yǎng)基稀釋 50 倍。將Lipofectamine 2000 稀釋300 倍。分別吸取miR-103 inhibitor 0.5 mL 和Lipofectamine 2000 稀釋液1.5 mL 混合并靜置20 min。將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為上述混合液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。將轉(zhuǎn)染miR-103 inhibitor 和NC 的N87/PTX 細(xì)胞分別設(shè)為miR-103 inhibitor 組和NC 組，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染的N87/PTX 細(xì)胞作為空白對(duì)照組（Control）。

2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 N87 或N87/PTX 細(xì)胞以每孔9×103個(gè)接種于96 孔板，以PTX（0、0.01、0.1、1、10、100、1000 μmol/L）處理48 h，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。48 h 時(shí)每孔直接加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL）處理4 h，而后每孔加入二甲基亞砜100 μL，用酶標(biāo)儀（490 nm）檢測(cè)吸光度并計(jì)算細(xì)胞活力，根據(jù)細(xì)胞活力計(jì)算各細(xì)胞IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。耐藥指數(shù)=N87/PTX 細(xì)胞IC50 均值/N87 細(xì)胞IC50 均值。

2.4 RT-qPCR 檢測(cè)miR-103 表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)期所需細(xì)胞接種于96 孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合度時(shí)以TRIZOL 法提取細(xì)胞總RNA。按說(shuō)明書以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。稀釋cDNA 和引物。以U6 為內(nèi)參，用RT-試劑盒在ABI 7500 型RT-qPCR 系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，以2-△△Ct法計(jì)算miR-103 的表達(dá)水平。miR-103 上游引物：5′-AGCAGCATTGTACAGGGCTATCA-3′，下游引物：5′-GCCGTCGGTGATGCTTTTTTGG-3′。U6 上游引物，5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2.5 結(jié)晶紫染色 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6 孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至60%匯合度時(shí)按需求加入PTX（3 μmol/L）處理48 h。PBS 洗滌，加入4%多聚甲醛固定10min。PBS 洗滌，每孔加入2 mL 結(jié)晶紫染液染色10 min。清水洗滌，于倒置顯微鏡下觀察拍照，隨機(jī)記錄3 個(gè)視野細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞貼壁存活率。

2.6 miR-103 的靶基因預(yù)測(cè) 以miRcode 網(wǎng)站（http://www.mircode.org/）分析miR-103 與IKBα 的編碼基因NFKBIA 結(jié)合的可能性。同時(shí)在RNA22 v2 microRNA target detection 網(wǎng)站（https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive）預(yù)測(cè)二者結(jié)合的潛在位點(diǎn)。

2.7 蛋白印跡法檢測(cè)p-NF-κB p65、MGMT 及IKBα 蛋白表達(dá) 提前配制含蛋白抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 細(xì)胞裂解液，置于冰上備用。將所需檢測(cè)細(xì)胞以PBS 洗兩遍，第二遍保留PBS，用蛋白刮刀刮下細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，4 ℃、800 g 離心5 min，棄去上清液并用吸水紙吸干水分，各加入100 μL 裂解液于冰上裂解15 min，4 ℃、8500 g 離心20 min，上清液即為提取總蛋白，總蛋白經(jīng)BCA 蛋白定量試劑盒定量后制備成蛋白樣品。以每孔道30 μg/10 μL 蛋白樣品進(jìn)行電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。PVDF 膜以5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜。次日加入NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKBα、MGMT 及GAPDH 抗體避光孵育4 h。TBST 洗膜后，加入抗鼠和抗兔IgG，HRP-linked 二抗室溫避光孵育1 h，PVDF 膜以TBST 清洗后用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，凝膠成像儀進(jìn)行曝光。

2.8 免疫熒光法檢測(cè)NF-κB p65 細(xì)胞分布 將細(xì)胞鋪在蓋玻片上，24 h 后于冰上用預(yù)冷的甲醇固定20 min。然后用0.1% Triton X-100 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，室溫條件下用3% BSA 封閉30 min。將細(xì)胞與NF-κB p65 抗體（1∶500）室溫孵育2 h。PBST 洗滌后，細(xì)胞與熒光二抗（1∶1000）孵育2 h。在室溫下用0.5 μg/mL 的DAPI 孵育10 min。于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)用Shapiro-Wilk進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，均為正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組內(nèi)兩樣本均數(shù)比較用t 檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 miR-103 在N87/PTX 表達(dá)上調(diào) MTT 結(jié)果顯示，PTX 對(duì)N87 和N87/PTX細(xì)胞的IC50分別為（1.5±0.2）和（40.6±4.5）μmol/L，經(jīng)計(jì)算N87/PTX 耐藥指數(shù)為27.1。RT-qPCR結(jié)果顯示，N87細(xì)胞和N87/PTX 細(xì)胞miR-103 表達(dá)水平分別為（0.9±0.1）和（10.7±0.9），與N87 細(xì)胞比較，N87/PTX 細(xì)胞miR-103 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。

3.2 抑制miR-103 影響PTX 對(duì)N87/PTX 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 MTT 結(jié)果顯示，PTX 對(duì)Control、NC 及miR-103 inhibitor 組N87/PTX 細(xì)胞的IC50 分別為（43.5±4.8）、（41.7±4.5）及（3.3±0.3）μmol/L。與NC 組比較，miR-103 inhibitor 組IC50 顯著降低（P＜0.01）。

3.3 抑制miR-103 影響N87/PTX 細(xì)胞對(duì)PTX 的敏感性 結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，PTX（3 μmol/L）對(duì)Control 組N87/PTX 細(xì)胞存活能力有一定影響。Control+PTX 和NC+PTX 組細(xì)胞存活率無(wú)明顯差異。與NC+PTX 組比較，miR-103 inhibitor+PTX 組N87/PTX 細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖1 和表1。

表1 PTX 處理后各組N87/PTX 細(xì)胞存活率比較（%，）

表1 PTX 處理后各組N87/PTX 細(xì)胞存活率比較（%，）

注：Control 為空白對(duì)照；NC 為陰性對(duì)照；miR-103 inhibitor 為miR-103 抑制物；PTX 為紫杉醇；Solvent 為溶媒；與Control+Solvent 比較，aP＜0.01；與NC+PTX 比較，bP＜0.01

3.4 NFKBIA 基因（IKBα 蛋白的編碼基因）可能是miR-103 的靶基因 RNA22 v2 和miRcode 軟件分析結(jié)果顯示，IKBα 的編碼基因NFKBIA 與miR-103存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，可能是后者的靶基因，二者結(jié)合位點(diǎn)序列見(jiàn)表2。

表2 miR-103 與NFKBIA 基因的結(jié)合序列

3.5 p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT 蛋白在N87/PTX 細(xì)胞的表達(dá) 蛋白印記結(jié)果顯示，相較于N87細(xì)胞，N87/PTX 細(xì)胞IKBα 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，p-NF-κB p65 和MGMT 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖2 和表3。

表3 N87/PTX 細(xì)胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT相對(duì)蛋白表達(dá)量比較（%，）

表3 N87/PTX 細(xì)胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT相對(duì)蛋白表達(dá)量比較（%，）

注：N87 為正常培養(yǎng)的N87 細(xì)胞；N87/PTX 為PTX 耐藥N87 細(xì)胞；N87 為正常培養(yǎng)的N87 細(xì)胞；N87/PTX 為PTX 耐藥N87 細(xì)胞；IKBα為核因子κB 抑制蛋白α；MGMT 為O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶；與N87 比較，aP＜0.01

3.6 miR-103 對(duì)p-NF-κB p65、IKBα 和MGMT 蛋白表達(dá)的影響 蛋白印記結(jié)果顯示，NC 和Control組N87/PTX 細(xì)胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT 蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。與NC 組比較，miR-103 inhibitor 組N87/PTX 細(xì)胞p-NF-κBp65 和MGMT 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，IKBα 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖3 和表4。

表4 各組細(xì)胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT相對(duì)蛋白表達(dá)量比較（%，）

表4 各組細(xì)胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT相對(duì)蛋白表達(dá)量比較（%，）

注：Control 為空白對(duì)照；NC 為陰性對(duì)照；miR-103 inhibitor 為miR-103 抑制物；p-NF-κB p65 為磷酸化型NF-κB p65；IKBα 為核因子κB 抑制蛋白α；MGMT 為O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶；與NC組比較，aP＜0.01

3.7 miR-103 對(duì)NF-κB p65 核質(zhì)分布的影響 免疫熒光結(jié)果顯示，Control 和NC 組N87/PTX 細(xì)胞NF-κB p65 分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。相較于NC組，miR-103 inhibitor 組N87/PTX 細(xì)胞NF-κB p65主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，而在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)明顯減少，見(jiàn)圖4。

4 討論

miR-103 作為miRNA 家族成員，已顯示與惡性腫瘤化療耐藥有關(guān)。一項(xiàng)關(guān)于肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，miR-103 可靶向PTEN 激活PI3K/AKT 信號(hào)通路，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549 對(duì)達(dá)沙替尼耐藥[5]。研究顯示，miR-103 能通過(guò)調(diào)節(jié)COP1 誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞對(duì)阿霉素耐藥[10]。本研究成功構(gòu)建PTX 耐藥胃癌細(xì)胞N87/PTX，并發(fā)現(xiàn)miR-103 在N87/PTX 細(xì)胞中表達(dá)升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-103 inhibitor 處理即可降低PTX 對(duì)N87/PTX 細(xì)胞的IC50，還可抑制N87/PTX 細(xì)胞的貼壁存活能力。提示miR-103 可能與N87/PTX細(xì)胞PTX 耐藥相關(guān)。通過(guò)生物學(xué)信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，IKBα 蛋白的編碼基因NFKBIA 與miR-103 存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，NFKBIA 可能是miR-103 的靶基因。提示miR-103 對(duì)胃癌細(xì)胞PTX 耐藥的影響可能與IKBα 相關(guān)。在經(jīng)典的NF-κB 通路中，IKB 能結(jié)合NF-κB 而抑制后者活性，而其自身降解可活化NFκB。在過(guò)去的研究中，NF-κB 已被證明在卵巢癌[7]、乳腺癌[12]及黑色素瘤[13]等惡性腫瘤化療藥物耐藥中發(fā)揮作用。在本研究中，N87/PTX 細(xì)胞IKBα 蛋白表達(dá)下調(diào)，p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)上調(diào)。提示miR-103可能通過(guò)靶向抑制IKBα 蛋白表達(dá)，從而磷酸化激活NF-κB p65 蛋白。

為了進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，本研究采用miR-103 抑制物miR-103 inhibitor 抑制N87/PTX 細(xì)胞內(nèi)源性miR-103 活性表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-103 inhibitor 可誘導(dǎo)N87/PTX 細(xì)胞IKBα 蛋白表達(dá)上調(diào)，p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)下調(diào)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-103 inhibitor 處理后N87/PTX 細(xì)胞核NF-κB p65 表達(dá)明顯減少。通常情況下，NF-κB 磷酸化激活后通過(guò)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)與其相關(guān)的DNA 基序結(jié)合，從而誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄[7-8，13]。這些提示，在本研究中，miR-103 可能通過(guò)靶向抑制IKBα 蛋白表達(dá)，從而磷酸化激活NF-κB p65 蛋白，后者進(jìn)入細(xì)胞核參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

MGMT 是NF-κB 參與惡性腫瘤細(xì)胞耐藥的重要下游信號(hào)分子，能與DNA 鳥嘌呤6 位氧上的烷基化合物結(jié)合，將烷基轉(zhuǎn)移到MGMT 的第145 號(hào)半胱胺酸活性位點(diǎn)上，使DNA 上烷基化的鳥嘌呤被還原，最終避免子鏈DNA 缺口出現(xiàn)，導(dǎo)致細(xì)胞耐藥[9，14]。本研究中N87/PTX 細(xì)胞MGMT 蛋白表達(dá)上調(diào)，提示N87/PTX 細(xì)胞耐PTX 效應(yīng)可能與NF-κB 通路介導(dǎo)MGMT 蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-103 inhibitor 還可誘導(dǎo)N87/PTX 細(xì)胞MGMT 蛋白表達(dá)下調(diào)，提示miR-103 可能通過(guò)NF-κB 通路介導(dǎo)MGMT 蛋白表達(dá)上調(diào)。

綜上所述，miR-103 可能通過(guò)靶向抑制IKBα 蛋白表達(dá)而促進(jìn)NF-κB p65 磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，而后者通過(guò)調(diào)節(jié)MGMT 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終介導(dǎo)胃癌細(xì)胞PTX 耐藥。