水平潛流人工濕地堵塞初期微生物群落結(jié)構(gòu)變化

張明珍 曹濤濤 劉 偉 李前正 胡 澤 陳迪松吳振斌 徐 棟

(1.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049;3.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 武漢 430074; 4.武漢市生態(tài)環(huán)境科技中心, 武漢 430015)

水平潛流人工濕地(HFCWs)作為一種污水處理技術(shù), 兼有效性、經(jīng)濟(jì)性及觀賞性, 因此被廣泛用于工業(yè)廢水、生活污水、農(nóng)業(yè)尾水及城市地表徑流的凈化處理中[1—3]。然而, 大量的工程實(shí)踐表明, 隨著人工濕地運(yùn)行時(shí)間的增加, 內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)不同程度的堵塞。一般來(lái)說(shuō), 濕地堵塞過(guò)程主要是濕地填料內(nèi)有效孔隙逐漸減少、滲透系數(shù)緩慢下降的過(guò)程, 大致可歸結(jié)為物理、化學(xué)和生物三方面的原因: (1)物理機(jī)理: 濕地進(jìn)水中的有機(jī)、無(wú)機(jī)懸浮物和難降解有機(jī)物沉積在濕地表面、基質(zhì)顆粒之間及基質(zhì)顆粒內(nèi), 使基質(zhì)孔隙逐漸減小; (2)化學(xué)機(jī)理: 基質(zhì)和基質(zhì)中水相的物理化學(xué)性質(zhì)造成濕地堵塞, 比如基質(zhì)的化學(xué)組成和孔隙率、水相的有機(jī)物組成、pH和氧化還原電位等; (3)生物機(jī)理: 微生物利用濕地內(nèi)積累的有機(jī)物, 迅速生長(zhǎng)形成大量的胞外聚合物, 滲透系數(shù)緩慢下降, 該物質(zhì)還可與多糖類、聚脲類等物質(zhì)形成低密度的孔徑為納米級(jí)的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu), 攔截?zé)o機(jī)和有機(jī)顆粒物, 使?jié)B透系數(shù)下降到堵塞的程度[4—6]。

這三種機(jī)理共同作用, 使人工濕地短流或表面雍水, 最終影響濕地處理效率甚至縮短其使用年限[7,8]。因此, 為了避免上述情況發(fā)生, 對(duì)人工濕地運(yùn)行過(guò)程的堵塞狀況進(jìn)行監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。

目前, 人工濕地堵塞的判定方法主要是基于水力傳導(dǎo)率或污染物去除效率的變化[9], 通常分為三個(gè)階段: 第一階段即堵塞初期階段, 基質(zhì)滲透系數(shù)呈下降趨勢(shì), 但其值仍然與初始滲透系數(shù)接近; 第二階段即堵塞中期階段, 滲透系數(shù)大幅度下降; 第三階段即堵塞后期階段, 滲透系數(shù)趨于平穩(wěn), 并出現(xiàn)明顯的堵塞現(xiàn)象, 包括濕地表面雍水及處理效率降低等[10]。事實(shí)上, 微生物在人工濕地污染物的去除以及其生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,任何功能微生物的變化都與濕地內(nèi)部的生化反應(yīng)相關(guān)聯(lián), 從而反映人工濕地的運(yùn)行狀態(tài)[11]。有學(xué)者利用高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)表征垂直流人工濕地柱在運(yùn)行過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化, 其結(jié)果表明隨著濕地柱堵塞程度的增加, 細(xì)菌群落的豐富度和多樣性都降低[9]。但是很少有研究探索具體的微生物類群作為“指示物”來(lái)預(yù)報(bào)HFCWs早期堵塞的發(fā)生。本研究通過(guò)運(yùn)行不同組的水平潛流人工濕地反應(yīng)器來(lái)模擬濕地堵塞初期過(guò)程并研究其中微生物群落結(jié)構(gòu)與組成的變化, 以期找出該階段的特征微生物類群, 為堵塞人工濕地微生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)的研發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置及運(yùn)行

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由4組尺寸相同(長(zhǎng)×寬×高=100 cm×50 cm×70 cm)的水平潛流人工濕地反應(yīng)器組成(B0為未種植植物, B1為種植美人蕉, B2為種植菖蒲, B3為種植香蒲; 圖1), 其中a—c: a為84d和166d時(shí)未種植植物的濕地反應(yīng)器B0的基質(zhì)采樣點(diǎn)(B0in-84和B0in-166); b為84d和166d時(shí)4組濕地反應(yīng)器的基質(zhì)采樣點(diǎn)(B0mid-84、B1-84、B2-84、B3-84、B0mid-166、B1-166、B2-166和B3-166); c為84d和166d時(shí)未種植植物的濕地反應(yīng)器B0的基質(zhì)采樣點(diǎn)(B0out-84和B0out-166)。

圖1 水平潛流濕地反應(yīng)器裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of horizontal subsurface flow wetland reactors

本研究人工濕地反應(yīng)器中的植物取自已建成并穩(wěn)定運(yùn)行的人工濕地公園, 每株植物株高和分支近似(種植密度為20株/m2)。進(jìn)水采用自配污水來(lái)模擬生活污水, 參考Prochaska等[12]的方法制備。此外, 為盡可能地還原水平潛流人工濕地堵塞的過(guò)程,實(shí)驗(yàn)進(jìn)水中添加適量的粉煤灰代替生活污水中的懸浮物。本實(shí)驗(yàn)在室外實(shí)驗(yàn)基地中進(jìn)行, 運(yùn)行時(shí)間為2019年6月22日至2019年12月30日; 所有濕地系統(tǒng)均間歇運(yùn)行, 水力負(fù)荷為0.0625 m3/(m2·d)。在濕地運(yùn)行期間白天室外溫度不低于10℃, 人工濕地系統(tǒng)中大部分的硝化與反硝化細(xì)菌可以在該環(huán)境溫度下良好生長(zhǎng)[13], 所以本研究中排除溫度對(duì)主要功能微生物生長(zhǎng)的影響。本研究采用基質(zhì)過(guò)濾速率的變化作為人工濕地反應(yīng)器進(jìn)入堵塞初期的判定方式。

1.2 采樣

為避免植物根系對(duì)微生物的影響, 以便于各濕地反應(yīng)器微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性比較, 未種植植物的人工濕地反應(yīng)器(B0)的基質(zhì)采樣點(diǎn)為濕地表面向下25 cm的3個(gè)區(qū)域, 包括濕地水力沿程方向上的10—20 cm、45—55 cm和80—90 cm(如圖1所示依次為a、b、c三個(gè)點(diǎn)位); 對(duì)于3組種植植物的人工濕地反應(yīng)器, 于同一深度, 從根際區(qū)域(如圖1所示b點(diǎn)位)采集基質(zhì)樣品。樣品在現(xiàn)場(chǎng)采集后放入有冰塊保溫箱中暫存, 隨后立即轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室-80℃超低溫冰箱中保存。

1.3 DNA 提取、高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

基質(zhì)樣品中的DNA用美國(guó)Omega公司的Mag-Bind Soil DNA分離試劑盒提取。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取細(xì)菌總DNA, 并使用Qubit 3.0(LIFE,USA)對(duì)DNA的濃度進(jìn)行定量, 以確保提取了足夠數(shù)量的高質(zhì)量基因組。本研究選擇16S rDNA V3-V4可變區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 引物序列為341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')和805R(5'-GACT ACHVGGGTATCTAATCC-3')。擴(kuò)增條件為: 95℃變性3min; 95℃變性30s, 45℃退火30s, 72℃延伸30s, 擴(kuò)增5個(gè)循環(huán); 然后95℃變性20s, 55℃退火30s,72℃延伸30s, 擴(kuò)增20個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸5min。擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后, 由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行MiSeq(Illumina)高通量測(cè)序并基于Mothur 1.30對(duì)原始序列進(jìn)行校正, 得到優(yōu)化序列。本研究在97%的相似水平下對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行OTU(可操作分類單元, Operational Taxonomic Units)劃分, 確定α-多樣性指數(shù)(Chao1多樣性指數(shù)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和克隆覆蓋率); 使用Origin 2018 和GraPhlAn 0.9.7繪制圖形; 最后利用Fisher’s exact test來(lái)分析樣本間微生物豐度差異。

2 結(jié)果

2.1 人工濕地水力特性與凈化性能變化

在本研究中, 各組水平潛流人工濕地反應(yīng)器的基質(zhì)過(guò)濾速率與污染物去除效率變化如圖2所示。從圖2a看出, 隨著運(yùn)行時(shí)間的增加, 4組水平潛流人工濕地反應(yīng)器的基質(zhì)過(guò)濾速率持續(xù)下降: 未種植植物的濕地反應(yīng)器(B0)下降了18%; 種植美人蕉、菖蒲和香蒲的濕地反應(yīng)器(B1、B2和B3)分別下降了14%、15%和13%。此外, 從圖2b—d看出, 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 4種濕地系統(tǒng)中的COD和TN去除效率分別穩(wěn)定在50%—85%和10%—20%, 而TP去除效率從大約60%持續(xù)下降到約5%。

圖2 不同水平潛流人工濕地反應(yīng)器在堵塞過(guò)程中總體性能變化Fig.2 The variation of overall performance in four HFCW reactors during the clogging process

2.2 細(xì)菌群落的α-多樣性分析

在堵塞形成過(guò)程中, 不同水平潛流人工濕地反應(yīng)器中細(xì)菌群落的α-多樣性分析結(jié)果如表1所示:每個(gè)樣品覆蓋率均在0.99以上, 表明測(cè)序?qū)悠犯采w度較高; 通過(guò)高通量測(cè)序分析12個(gè)基質(zhì)樣品共得到31679個(gè)OTU, 且堵塞前的OTU數(shù)大于堵塞初期的OTU數(shù); 12個(gè)基質(zhì)樣品的Chao1多樣性指數(shù)在2596.60—4659.16, 具體表現(xiàn)為在植物組人工濕地反應(yīng)器(B1、B2和B3)中, 堵塞前的Chao 1值大于堵塞初期的Chao 1值, 而在未種植植物的濕地反應(yīng)器(B0)中, 布水區(qū)域的Chao 1值與植物組濕地反應(yīng)器表現(xiàn)出相同的趨勢(shì), 而中心區(qū)域和集水區(qū)域的Chao 1值則呈現(xiàn)相反的結(jié)果; 12個(gè)基質(zhì)樣品的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)在4.86—6.05且變化趨勢(shì)與Chao1多樣性的變化趨勢(shì)相類似。此外, 在本研究中植物組濕地反應(yīng)器的Chao 1和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)值都高于未種植植物濕地反應(yīng)器的Chao 1和Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)值。

表1 不同水平潛流人工濕地反應(yīng)器中12個(gè)基質(zhì)樣品細(xì)菌群落豐富度和多樣性分析Tab.1 The richness and diversity of bacterial community for twelve samples collected from different HFCW reactors

2.3 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群變化

門類水平本研究通過(guò)對(duì)12個(gè)基質(zhì)樣品進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析共得到33個(gè)細(xì)菌門, 以相對(duì)豐度 ＞1% 定義為優(yōu)勢(shì)菌門并比較其組成及相對(duì)豐度。從圖3可以看出在整個(gè)運(yùn)行過(guò)程中, 4個(gè)人工濕地反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì)菌門始終為變形菌門(Proteobacteria, 25.78%—54.96%)、厚壁菌門(Firmicutes,7.97%—24.79%)、綠彎菌門(Chloroflexi, 5.67%—17.33%)、擬桿菌門(Bacteroidetes, 3.98%—16.02%)、Parcubacteria(2.4%—8.06%)、放線菌門(Actinobacteria, 1.53%—4.42%)、浮霉菌門(Planctomycetes,0.62%—5.51%)、Candidatus Saccharibacteria(1.22%—3.35%)、酸桿菌門(Acidobacteria, 1.66%—9.17%)和疣微菌門(Verrucomicrobia, 0.59%—1.69%); 但當(dāng)4種人工濕地反應(yīng)器相繼發(fā)生堵塞后, 除變形菌門豐度明顯增加以外(P＜0.001), 其他優(yōu)勢(shì)菌門的豐度均呈下降趨勢(shì)(P＜0.05), 酸桿菌門和疣微菌門尤其明顯。

圖3 不同水平潛流人工濕地反應(yīng)器在堵塞過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌門的組成及其相對(duì)豐度Fig.3 The composition and relative abundance of dominant bacteria phyla in different HFCW reactors during clogging development (%)

屬類水平本研究中12個(gè)基質(zhì)樣品通過(guò)高通量測(cè)序分析共得到458個(gè)細(xì)菌屬, 以其相對(duì)豐度前20作圖4, 從中可以看出主要優(yōu)勢(shì)菌屬包括Ornatilinea(1.89%—11.27%)、Thauera(0.05%—11.38%)、Rhizobium(0.54%—13.57%)、Parcubacteria_genera_incertae_sedis(2.4%—8.06%)、Rhodobacter(0.38%—5.36%)、Clostridium_sensu_stricto(0.54%—4.48%)、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis(1.22%—3.35%)、Rhodopseudomonas(0.09%—7.28%)、Anaerovorax(0.6%—3.25%)、Levilinea(0.27%—3.53%)、Comamonas(0.32%—0.45%)、Thermomonas(0.46%—2.76%)、Longilinea(0.29%—3.13%)、Terrimonas(0.26%—3.68%)、Shinella(0.49%—2.35%)、Simplicispira(0.11%—5.83%)、Gracilibacter(0.06%—6.31%)、Holophaga(0.13%—5.64%)、Zoogloea(0.03%—3.84%)和Desulfovibrio(0.58%—1.69%)。

圖4 不同水平潛流人工濕地反應(yīng)器在堵塞過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌屬的組成及其相對(duì)豐度Fig.4 The composition and relative abundance of dominant bacteria genera in different HFCW reactors during clogging development (%)

從圖5可以看出, 約有一半的優(yōu)勢(shì)菌屬于變形菌門, 如L:SimplicispiraM:ComamonasN:ZoogloeaO:ThaueraP:RhodopseudomonasQ:ShinellaR:RhizobiumS:RhodobacterT:ThermomonasU:Desulfovibrio, 其中, 隨著堵塞的形成, 4組人工濕地系統(tǒng)中的Thauera、Zoogloea和Rhizobium菌屬的相對(duì)豐度明顯增加(P＜0.05);Simplicispira菌屬在未種植植物的人工濕地反應(yīng)器(B0)中明顯增加(P＜0.05)。Clostridiumsensu stricto 和Gracilibacter屬于厚壁菌門(Firmicutes),Levilinea菌屬屬于綠彎菌門(Chloroflexi); 在本研究中, 這3種菌屬的相對(duì)豐度在4組人工濕地反應(yīng)器堵塞后明顯增加(P＜0.05)。此外, 本研究中Holophaga為酸桿菌門(Acidobacteria)下豐度最高的菌屬, 其豐度變化趨勢(shì)與酸桿菌門一致, 均為隨著堵塞的形成, 其相對(duì)豐度明顯下降(P＜0.05)。

圖5 12個(gè)基質(zhì)樣品中優(yōu)勢(shì)物種分類和系統(tǒng)發(fā)育信息可視化圖Fig.5 Visualization of classification and phylogenetic tree of dominant genera in bacterial communities detected from twelve samples

3 討論

3.1 人工濕地水力特性與凈化性能變化

本研究根據(jù)基質(zhì)過(guò)濾速率的變化來(lái)確定基質(zhì)采樣時(shí)間?；|(zhì)樣品的第一次采集定在濕地反應(yīng)器運(yùn)行至第84天, 這是因?yàn)橛醒芯勘砻魅斯竦剡\(yùn)行至75—100d時(shí)人工濕地中的微生物群落已達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)[14,15]; 樣品的第二次采集定為濕地反應(yīng)器運(yùn)行至第166天, 此時(shí)4組人工濕地的基質(zhì)過(guò)濾速率下降了13%—18%, 符合濕地堵塞初期階段的描述,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)濕地系統(tǒng)確已進(jìn)入堵塞初期。此外, 本研究中4組人工濕地反應(yīng)器的COD和TN去除效率始終穩(wěn)定在一定范圍內(nèi), 即使進(jìn)入堵塞初期, 這兩者的去除效率仍沒有顯著變化, 這與Vymazal[8]的研究結(jié)論一致, 即局部堵塞對(duì)水平潛流人工濕地污染物的去除效果沒有顯著影響; 而TP的去除效率持續(xù)下降, 這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中濕地除磷的主要機(jī)理是基質(zhì)的吸附作用, 而非植物吸收以及微生物的降解作用[16]。

3.2 微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

Chao1和Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)分別反映細(xì)菌群落的豐富度和多樣性[17], 其結(jié)果表明, 水平潛流人工濕地反應(yīng)器堵塞后細(xì)菌的豐富度和多樣性會(huì)降低, 這與華國(guó)芬等[9]的研究結(jié)果是一致的。此外, 植物組人工濕地反應(yīng)器的Chao 1值和Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)值都高于未種植植物濕地反應(yīng)器的多樣性指數(shù)值, 這可能是因?yàn)橹参锔档拇嬖跁?huì)增加細(xì)菌的豐富性和多樣性[18,19]。

3.3 微生物門水平和屬水平差異分析

本研究中微生物門水平和屬水平上的測(cè)序結(jié)果表明, 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 變形菌門的物種豐度明顯高于其他微生物豐度, 此研究結(jié)果與之前人工濕地微生物的研究一致[20,21]; 同時(shí)當(dāng)4組人工濕地反應(yīng)器進(jìn)入堵塞初期階段時(shí), 變形菌門豐度變化最明顯, 具體表現(xiàn)為其門下的反硝化菌屬豐度增加:Thauera是一類好氧反硝化細(xì)菌屬, 其相對(duì)豐度明顯增加是因?yàn)闈竦囟氯麜?huì)導(dǎo)致溶解氧(DO)下降, 而Thauera可以在低DO環(huán)境中生存并參與厭氧反硝化作用[22];Zoogloea是一類好氧反硝化菌屬[23], 其相對(duì)豐度在濕地反應(yīng)器堵塞后明顯增加, 說(shuō)明該菌屬在堵塞后的人工濕地系統(tǒng)中具有較強(qiáng)的適應(yīng)性;有研究表明Rhizobium是一種自養(yǎng)反硝化菌屬, 主要參與-N的去除過(guò)程[24]。在濕地堵塞后, 其內(nèi)部出現(xiàn)許多厭氧或缺氧的微環(huán)境, 便于Rhizobium生長(zhǎng), 所以該菌屬的豐度在4組人工濕地反應(yīng)器進(jìn)入堵塞初期后明顯增加; 異養(yǎng)反硝化細(xì)菌屬Simplicispira在未種植植物的人工濕地反應(yīng)器中明顯增加,這是因?yàn)樵擃惥鷮倏梢栽陂L(zhǎng)期厭氧的環(huán)境下生長(zhǎng)[25]。

除反硝化細(xì)菌外, 有機(jī)物降解菌也是人工濕地生態(tài)系統(tǒng)中一類重要的功能菌。有研究表明厚壁菌門下的Clostridiumsensu stricto 和Gracilibacter在各生態(tài)系統(tǒng)中可以降解有機(jī)物[26,27]。在本研究中, 隨著堵塞的形成與發(fā)展, 4種人工濕地反應(yīng)器中的Clostridiumsensu stricto和Gracilibacter的相對(duì)豐度明顯增加, 這是因?yàn)樵谌斯竦囟氯? 濕地內(nèi)部積累了大量的有機(jī)物質(zhì), 從而為這類細(xì)菌的生長(zhǎng)提供足夠的碳源。此外, 綠彎菌門下的Levilinea可以將碳水化合物轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸, 因此在本研究中的4種濕地反應(yīng)器堵塞后其相對(duì)豐度顯著增加[28]。

王光華等[29]的研究表明, 濕地中的酸桿菌門可以降解植物殘?bào)w多聚物(如纖維素)及參與單碳化合物的代謝過(guò)程, 但本研究中酸桿菌門在有植物組濕地中的豐度卻低于在無(wú)植物組濕地中的豐度, 這表明堵塞會(huì)影響酸桿菌門的微生物生長(zhǎng)。此外,Holophaga為酸桿菌門下豐度最高的菌屬, 其豐度變化趨勢(shì)與酸桿菌門一致, 這進(jìn)一步說(shuō)明了堵塞影響酸桿菌門微生物生長(zhǎng)的實(shí)質(zhì)是影響其門下的Holophaga生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果分析表明: (1)水平潛流人工濕地反應(yīng)器堵塞后細(xì)菌的豐富度和多樣性會(huì)降低; (2)人工濕地系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌門主要是變形菌門, 且在堵塞初期變形菌門相對(duì)豐度明顯增加, 具體表現(xiàn)為其門下的反硝化細(xì)菌屬(Thauera、Zoogloea和Rhizobium)豐度顯著增加, 此外在此階段厚壁菌門和綠彎菌門下的有機(jī)物降解菌屬(Clostridiumsensu stricto、Gracilibacter和Levilinea)豐度也顯著增加;(3)隨著堵塞的形成與發(fā)展, 酸桿菌門下的主要菌屬Holophaga豐度顯著下降。上述結(jié)果說(shuō)明人工濕地系統(tǒng)中的反硝化細(xì)菌屬(Thauera、Zoogloea和Rhizobium)、有機(jī)物降解菌屬(Clostridiumsensu stricto、Gracilibacter和Levilinea)可作為堵塞發(fā)生的早期預(yù)警, 而Holophaga的指示作用有待進(jìn)一步的深入研究。此外, 當(dāng)前微生物測(cè)序技術(shù)的成本較高、用時(shí)相對(duì)較長(zhǎng), 限制了微生物監(jiān)測(cè)方法的發(fā)展與應(yīng)用, 因此將能夠指示濕地堵塞的特異菌屬的變化轉(zhuǎn)化為其他便于監(jiān)測(cè)的信號(hào)是我們未來(lái)研究的重點(diǎn)。

致謝:

感謝上海生工生物工程有限公司何雨蓉工程師在微生物數(shù)據(jù)分析方面提供的指導(dǎo), 感謝課題組邱東茹老師、張義老師、王來(lái)博士、王川博士、嚴(yán)攀同學(xué)等在實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析方面提的意見和建議。