高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬、牛和羊尿液中18種同化激素的含量

侯 軒，羅成江，王 彬，黃 娟，吳望君，任玉琴，陳 潔

(浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，杭州 310000)

同化激素(Anabolic hormones)屬于具有環(huán)戊烷并多氫菲母核的甾體激素類藥物，由于其具有提高飼料轉(zhuǎn)換率，加快動物蛋白質(zhì)的沉積，促進畜禽生長的功效[1-3]，可以快速產(chǎn)生顯著直接的經(jīng)濟效益，在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中常常存在違規(guī)使用的情況。但該類藥物在畜禽體內(nèi)易蓄積殘留[4]，人體攝入后會造成不同程度的危害[5-6]。自20世紀90年代開始，歐盟等西方發(fā)達國家對同化激素類藥物殘留進行了嚴格的限制[7]，為保障人民的身體健康和生命安全，保障畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，我國農(nóng)業(yè)部176公告已經(jīng)明確左炔諾孕酮、苯丙酸諾龍等同化激素類藥物禁止在飼料和動物飲用水中使用。目前，國內(nèi)外關(guān)于動物組織和尿液中同化激素檢測方法研究已有報道，檢測方法主要為氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]、液相-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]等。本研究通過對儀器條件及前處理方法進行優(yōu)化，擬建立可同時測定豬尿、牛尿、羊尿中18種同化激素HPLC-MS/MS檢測方法，為保障畜產(chǎn)品質(zhì)量安全提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 18種同化激素標準品(群勃龍、諾龍、勃地酮、雄烯二酮、睪酮、孕酮、雄烯醇酮、美雄酮、甲睪酮、甲氫睪酮、左炔諾孕酮、康力龍、丙酸諾龍、氟甲睪酮、達那唑、丙酸睪酮、醋酸甲羥孕酮和苯丙酸諾龍)、3種同化激素內(nèi)標標準品(D3-甲睪酮、D9-孕酮、D3-睪酮標準品)均購于Witega公司，純度≥90.0%；甲酸、甲醇、乙腈(色譜純，默克公司)；乙腈(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；C18固相萃取小柱 (500 mg/6 mL，Waters公司)。

1.2 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀(1290 Infinity，Agilent公司)串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(QTRAP 5500，ABSCIEX公司)；電子天平(XS-205，Mettler公司)；電子天平(SL502 N，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；氮吹儀(N-EVAP，Organomation公司)；冷凍離心機(3-18k，Sigma公司)；振蕩器(ZD-8500，華立達公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 儀器條件

1.3.1.1 色譜條件 用十八烷基鍵合硅膠色譜柱(Waters C18 3μ m 3.0×150 mm)，柱溫30 ℃，進樣量5 μL，0.2%甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，按表1進行梯度洗脫，流速為0.3 mL/min。

表1 HPLC-MS/MS流動相條件Table 1 Mobile Phase Conditions of HPLC-MS/MS

1.3.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧源正離子模式(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；離子源電壓：4500 V，輔助加熱氣溫度：500 ℃，氣簾氣流速：10 L/h；離子源氣流流速：Gas1為45 L/h，Gas2為45 L/h；18種同化激素類化合物及3種內(nèi)標的MRM條件參數(shù)見表2。

1.3.2 標準溶液及標準曲線工作溶液配制

1.3.2.1 標準貯備液及內(nèi)標貯備液配制(1.0 mg/mL) 分別精密稱取18種激素類藥物及3種內(nèi)標藥物標準品約10 mg(準確至0.01 mg)，置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分別配制成1.0 mg/mL的激素類藥物標準及內(nèi)標貯備液。-20 ℃保存，有效期6個月。

1.3.2.2 混合標準中間液配制(1.00 μg/mL) 分別吸取適量的18種激素類藥物的貯備液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，使之成1.00 μg/mL的混合標準中間液。4 ℃保存，有效期3個月。

1.3.2.3 混合內(nèi)標中間液配制(1.00 μg/mL) 分別吸取適量的3種內(nèi)標貯備液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，使之成1.00 μg/mL的混合內(nèi)標中間液。4 ℃保存，有效期3個月。

1.3.2.4 標準曲線工作溶液配制 分別吸取適量的混合標準中間液，用50%乙腈溶液稀釋成濃度為1.0、5.0、10.0、50.0、200.0 和500.0 μg/L的標準曲線溶液，臨用新配。

表2 18種同化激素和3種內(nèi)標多反應(yīng)監(jiān)測條件參數(shù)Tab 2 Retention time and MS parameters for analysis of 21 target compounds

1.3.3 樣品前處理 取試樣5.0 mL，置于10 mL離心管中，加入β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶50 μL，37.0 ℃(±0.5 ℃)下酶解16 h，取出冷卻至室溫后，用鹽酸溶液(2.0 mol/L)或 氫氧化鈉溶液(2.0 mol/L)調(diào)節(jié)pH值至7.0(±0.5)，于10000 r/min離心5 min，取上清液為備用液。

C18固相萃取柱依次用甲醇5 mL和水5 mL活化，取全部備用液過柱，控制流速在1.0 mL/min以下，用淋洗液5 mL淋洗，抽干。用8 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40 ℃水浴條件下，氮氣吹干，用50%乙腈水溶液適量溶解殘余物，取適量溶液經(jīng)0.22 μm過微孔濾膜，上機測定。

1.3.4 樣品添加回收率、準確度和精密度測定 分別對豬、牛和羊尿液進行1.0、2.0、10.0 μg/L的18種同化激素空白添加回收實驗，按1.3.3項前處理后進行HPLC-MS/MS檢測。每個濃度設(shè)5個平行，連續(xù)做3 d，計算添加回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 同化激素屬于脂溶性化合物，弱極性或中等極性，采用電噴霧電離(ESI)離子源，以0.1%甲酸水:乙腈:甲醇=1∶1∶1(V/V/V)為基準流動相，采用流動注射泵連續(xù)進樣，對18種同化激素藥物的質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，在正離子模式下進行全掃描，以選擇適當?shù)姆肿与x子峰和電離方式，確定了18種同化激素在多反應(yīng)監(jiān)測模式下信號采集的特征離子對(表2)。

2.2 液相條件的優(yōu)化 由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液狀態(tài)電離，因此流動相的組成和配比不但影響目標化合物的色譜行為，還會影響到目標化合物的離子化效率，從而影響靈敏度。本實驗選擇Waters C18柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)為分離柱，在正離子模式下，流動相中加入0.2%甲酸溶液，有利于化合物的離子化，通過梯度洗脫，確定了流動相比例和梯度條件。采用正離子模式監(jiān)測18種同化激素類藥物，并對離子源和氣體的相關(guān)參數(shù)進行了優(yōu)化，得到空白豬尿總離子流圖，見圖1；空白豬尿加標樣品選擇離子色譜圖，見圖2。由圖1、圖2中可以看出待測藥物出峰的位置沒有雜質(zhì)干擾，18種同化激素實現(xiàn)了良好的基線分離及響應(yīng)。

圖1 空白豬尿總離子流圖Fig 1 TIC of blank pig urine

2.3 固相萃取柱選擇 在動物尿液試驗中，由于同化激素極性較弱，在動物尿液檢測同化激素方法中，選擇反相固相萃取柱凈化，并對以下兩種萃取小柱進行試驗比較：1、HLB(親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮大孔共聚物)規(guī)格：500 mg/6 mL；2、C18(烷基鍵合硅膠)規(guī)格：500 mg/6 mL。用以上兩種小柱分別進行豬尿液回收率試驗，添加濃度2.0 μg/L，5個平行樣。經(jīng)實驗證明(表3)C18回收率整體水平較高，尤其是苯丙酸諾龍、丙酸諾龍回收率高于HLB，故采用C18小柱。

2.4 標準曲線、檢出限及定量限 按1.3.3項處理空白樣品后，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，以峰面積作為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。由表4可知，在濃度為1～500 μg/L濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，r2>0.99，取信噪比S/N=3的樣品濃度為方法檢出限(LOD)，取信噪比S/N=10的樣品濃度為方法定量限(LOQ)。

表4 18種同化激素的線性方程相關(guān)相關(guān)系數(shù)Tab 4 Linear equation correlation coefficients of 18 anabolic hormones

2.5 方法的回收率、精密度 在1.0、2.0、10.0 μg/L濃度添加水平下進行添加回收實驗，每個濃度設(shè)5個平行，重復(fù)3次。計算添加回收率及變異系數(shù)，結(jié)果見表5～表7。

表5 豬尿中18種同化激素的回收率(n=5)Tab 5 Recovery rate of 18 anabolic hormones in pig urine (n = 5)

表6 牛尿中18種同化激素的回收率(n=5)Tab 5 Recovery rate of 18 anabolic hormones in cattle urine (n= 5)

表7 羊尿中18種同化激素的回收率(n=5)Tab 6 Recovery rate of 18 anabolic hormones in sheep urine (n= 5)

2.6 實際樣品檢測 應(yīng)用建立的分析方法，對浙江省內(nèi)20家養(yǎng)殖場采集的50份動物尿液進行測定，其中1批次牛尿檢出孕酮，含量為12.3 μg/L；3批次羊尿檢出睪酮，含量分別為3.61、5.33、21.6 μg/L。該檢測結(jié)果表明，本方法能滿足對動物尿液中18種同化激素有效監(jiān)控的需求。

3 討論與結(jié)論

3.1 酶解條件的選擇 同化激素在動物組織中常以原形藥物存在，在動物尿液中部分同化激素卻以葡萄糖醛酸結(jié)合的形態(tài)存在[13]。因此本研究采用β-葡萄糖苷酶/芳基硫酸酯酶在37±0.5 ℃下酶解16 h進行處理，達到較好的效果。

3.2 樣品前處理方法的優(yōu)化 張怡[14]等針對豬血漿和尿液樣品，采用乙酸乙酯提取、C18固相萃取小柱凈化，對8種同化激素開展同時測定，定量限為1 ～1.5 μg/L，回收率在71.5%～92.3%之間；曹玉萍[15]等采用叔丁基甲醚和三氯甲烷提取馬尿中的同化激素，濃縮提取后，內(nèi)標法定量，定量限為0.5～50 μg/L，回收率在68.74%～120%之間。本研究通過比較不同pH值和固相萃取柱對待測物回收率的考察，確定了樣品調(diào)節(jié)pH值至7.0(±0.5)直接過C18固相萃取柱的前處理方法，省去有機相提取步驟，減少了檢測時間與成本，結(jié)果可見空白樣品基線清晰，加標樣品18種同化激素峰形銳利且無其他雜峰干擾，定量限為1.0 μg/L，回收率在79.2%～94.5%之間，滿足檢測要求。

本研究建立的動物尿液中18種同化激素HPLC-MS/MS檢測方法，回收率在70.9%～112%之間，日內(nèi)變異系數(shù)范圍為1.2%～13.1%，日間變異系數(shù)范圍為3.5%～16.7%，檢測限為0.5 μg/L，定量限為1.0 μg/L。本方法操作簡便，靈敏度高，適用于動物尿液中18種同化激素的同時測定。該方法優(yōu)化了前處理條件，操作簡便，檢測方法靈敏度高，重現(xiàn)性強，符合獸藥殘留分析性能要求，可用于日常樣品分析。