高效液相色譜法同時測定獸藥復(fù)方酮康唑軟膏中的酮康唑和甲硝唑的含量

尹伶靈，楊志昆，周 晶，商 菲，張含俠，章安源，門曉冬，李有志，田成國，陳 玲*

(1.山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心(山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，濟(jì)南 250100；2.青島歐博方醫(yī)藥科技有限公司，山東青島 266114；3.鄒平市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東濱州 256200)

獸藥復(fù)方酮康唑軟膏用于治療犬貓真菌病、厭氧菌等引起的細(xì)菌性皮膚病[1]。以酮康唑、甲硝唑?yàn)橹魉帲尤氡『赡X、助懸劑，抗氧化劑等制成?，F(xiàn)有檢測方法收錄在《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2017版)》化學(xué)藥品卷，酮康唑和甲硝唑的含量是通過分別提取后，采用紫外-可見分光光度法分別測定。該方法需要分別提取，且提取方法復(fù)雜，尤其是酮康唑的測定方法，需要先用0.1 mol/L鹽酸溶液提取3次，再用三氯甲烷萃取3次，操作繁瑣，耗時久，且有機(jī)溶媒使用量大(一次檢驗(yàn)需易制毒試劑三氯甲烷300多毫升)。中國藥典抗真菌感染藥復(fù)方酮康唑乳膏中酮康唑的含量測定采用液相色譜法[2-3]，但其處方中不含甲硝唑。陸國慶等[4]曾嘗試用高效液相色譜法等度洗脫同時檢測酮康唑乳膏中酮康唑與甲硝唑的含量，但甲硝唑出峰時間太早，不能與溶劑峰能很好地基線分離，且制劑處方相差較大。本試驗(yàn)擬采用反相高效液相色譜梯度洗脫方式，同時測定獸藥復(fù)方酮康唑軟膏制劑中酮康唑和甲硝唑2種藥效成分的含量，旨在為獸藥復(fù)方酮康唑軟膏的質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器 BT125D 型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；Agilent 1260 型高效液相色譜儀配帶二極管陣列檢測器(美國 Agilent 公司)。

1.2 藥品與試劑 酮康唑?qū)φ掌?(批號：100294-201904，含量99.8%)、甲硝唑?qū)φ掌?批號：100191-200305，含量99.6%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙醇均為色譜純，德國默克公司生產(chǎn)；水為符合 GB/T 6682 標(biāo)準(zhǔn)的超純水。

復(fù)方酮康唑軟膏(批號：20210110)及軟膏空白基質(zhì)均由青島歐博方醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.3 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse XDB C18柱(4.6×150 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min；檢測波長：239 nm；進(jìn)樣體積：10 uL，流動相為甲醇-水，梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Tab 1 HPLC gradient elution program

1.4 溶液的制備

1.4.1 對照品溶液的制備 酮康唑?qū)φ掌啡芤海悍Q取酮康唑?qū)φ掌芳s16 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

甲硝唑?qū)φ掌啡芤海悍Q取甲硝唑?qū)φ掌芳s32 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

混合對照品溶液:分別精密量取甲硝唑?qū)φ掌啡芤?、酮康唑?qū)φ掌啡芤焊? mL，置同一10 mL量瓶中，加溶劑(初始比例流動相)稀釋至刻度，搖勻即得(約含酮康唑0.16 mg/mL，甲硝唑唑0.32 mg/mL)。

1.4.2 供試品溶液的制備 取本品約4 g，精密稱定，加無水乙醇20 mL，置80 ℃水浴中加熱使樣品全部溶解[2,5]，轉(zhuǎn)移移至50 mL量瓶中，用適量無水乙醇沖洗燒杯3次，放冷至室溫，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。置冰浴中冷卻2 h[6-8]，過濾，棄去初濾液(約5 mL)，取續(xù)濾液放置至室溫。精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，用溶劑(初始比例流動相)稀釋至刻度，搖勻即得供試品溶液。(約含酮康唑0.16 mg/mL；甲硝唑0.32 mg/mL)。

1.4.3 軟膏基質(zhì)樣品溶液的制備 取處方中除去甲硝唑、酮康唑制成的軟膏基質(zhì)樣品，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、軟膏基質(zhì)樣品溶液各 10 μL，按1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，甲硝唑峰和酮康唑峰理論板數(shù)均大于4000，甲硝唑與酮康唑的分離度大于25，完全分離，且基質(zhì)無干擾。對照溶液、供試品溶液及軟膏基質(zhì)樣品溶液色譜圖見圖1。

A：甲硝唑、酮康唑混合對照品溶液色譜圖;B：軟膏基質(zhì)樣品溶液色譜圖；C：供試品溶液色譜圖。A:Chromatogram of metronidazole and ketoconazole mixed control substance solution;B:Chromatogram of ointment matrix sample solution;C:Chromatogram of sample solution.圖1 HPLC色譜圖Fig 1 HPLC Chromatogram

2.2 線性關(guān)系試驗(yàn) 將甲硝唑、酮康唑?qū)φ掌啡芤海謩e稀釋成含甲硝唑0.128、0.192、0.256、0.320、0.384、0.512 mg /mL，含酮康唑0.064、0.096、0.128、0.160、0.192、0.256 mg /mL的混合溶液(標(biāo)液濃度相當(dāng)于供試品含量相當(dāng)于標(biāo)示量的40%、60%、80%、100%、120%、160%)，照1.3項(xiàng) 下色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，甲硝唑的線性回歸方程為y=10.014x+40.29，R2=0.9997；酮康唑的線性回歸方程為y=15.337x+40.505，R2=0.9995。表明甲硝唑在0.128～0.512 mg/mL、酮康唑在0.064～0.256 mg/mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取含甲硝唑0.32 mg /mL、酮康唑0.16 mg /mL 的混合對照品溶液，按1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，甲硝唑峰面積的RSD為0.2%，酮康唑峰面積RSD為0.3%，證明本方法精密度良好。

2.4 溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液室溫放置，分別于0、4、8、12、18、24、36、48 h，進(jìn)樣測定，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。48 h內(nèi)兩組分含量的RSD分別為0.99%、0.94%，結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定復(fù)方酮康唑軟膏樣品(批號:20210110，實(shí)際投料量為標(biāo)示量的100%) 6 份，每份約4 g，按照 1.4.2項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，按1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以峰面積計算供試品中甲硝唑、酮康唑的含量，結(jié)果見表2，表明本方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 2 Results of repeated trials (n = 6)

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 稱取軟膏基質(zhì)樣品共 9 份，每份約4 g，精密加入含量相當(dāng)于標(biāo)示量80%、100%、120%的對照品溶液，按照1.4.2項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，按 1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以峰面積計算基質(zhì)添加樣品中甲硝唑、酮康唑的含量，計算回收率。甲硝唑平均回收率為100.0%，RSD為0.85%，酮康唑平均回收率為97.8%，RSD為1.28% (n=9)(表3)。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果及RSD(n=9)Tab 3 The results of recovery test and RSD(n=9)

2.7 實(shí)際樣品含量測定 取3批不同廠家的已經(jīng)檢驗(yàn)合格的報批檢驗(yàn)樣品進(jìn)行復(fù)檢，按照 1.4.2項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，按1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以峰面積計算供試品中甲硝唑、酮康唑的含量。結(jié)果表明，甲硝唑、酮康唑含量測定結(jié)果與《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2017版)》檢測結(jié)果相一致，進(jìn)一步證明了該方法的準(zhǔn)確性(表4)。

表4 不同生產(chǎn)廠家樣品含量測定結(jié)果Tab 4 Determination results of samples from different manufacturers

3 討 論

3.1 色譜條件的選擇 對于檢測波長的選擇，用乙醇做溶劑時，甲硝唑和酮康唑兩種組分的紫外吸收圖譜見圖2。通過二極管陣列檢測器，全波長掃描采集圖譜后，提取色譜圖，最終確定采集波長為239 nm，由圖2可以看出在該波長下甲硝唑和酮康唑均有一定的紫外吸收。二極管陣列檢測器中峰純度檢測表明，甲硝唑峰和酮康唑峰峰純度均在995以上，證明該波長和色譜條件下輔料不干擾主成分檢測。復(fù)方酮康唑軟膏中含有較復(fù)雜的基質(zhì)，且不同生產(chǎn)廠家的基質(zhì)組成不同，因此在供試品測定過程中應(yīng)避免空白基質(zhì)峰對樣品峰的影響。流動相選擇的過程中，通過參考文獻(xiàn)[2,9]，最終選擇甲醇-水體系，梯度洗脫方式，甲硝唑和酮康唑?qū)崿F(xiàn)了很好的分離，且基質(zhì)無干擾。與陸國慶等[4]所采用的等度洗脫方式相比，該方法專屬性更好，因甲硝唑和酮康唑極性差別大，在液相色譜柱上的保留差別比較大，不適合等度條件下檢測。

圖2 甲硝唑、酮康唑紫外光譜疊加圖譜Fig 2 Overlay ultraviolet spectrum of metronidazole and ketoconazole

3.2 提取溶劑的選擇 考慮到軟膏的油性基質(zhì)[10-11]，為了提高甲硝唑、酮康唑兩種主成分的提取效率，參考文獻(xiàn)[2,5]，本實(shí)驗(yàn)選擇了對軟膏基質(zhì)和甲硝唑、酮康唑均有一定溶解性，且對操作人和環(huán)境友好的乙醇作為提取溶劑。通過對提取溶劑體積、加熱溫度和時間以及冷卻時間的考察，最終確定樣品置 80 ℃ 水浴中加熱 5 min，振搖，能夠使基質(zhì)全部溶散，甲硝唑、酮康唑提取完全。冰浴冷卻又可以使基質(zhì)冷凝沉淀去除干擾，讓測定的專屬性更強(qiáng)。

本文建立了同時測定獸藥復(fù)方酮康唑軟膏中酮康唑、甲硝唑含量的高效液相色譜(HPLC)法，采用C18色譜柱，甲醇-水為流動相梯度洗脫，檢測波長239 nm。該方法與原標(biāo)準(zhǔn)方法相比，顯著縮短了檢驗(yàn)周期，減少了有機(jī)溶媒的使用，且操作簡單，分離度好，準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好，為該制劑的質(zhì)量控制提供了技術(shù)支撐。