藍(lán)莓葉斑病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性

楊秀梅， 王麗花， 張藝萍， 吳學(xué)尉， 周旭紅

1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心/云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650205；2. 云南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 昆明 650504； 3. 云南中醫(yī)藥大學(xué) 科技處科技實(shí)驗(yàn)中心， 昆明 650500

藍(lán)莓(Vaccinium)為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)藍(lán)果類型植物， 又名藍(lán)漿果， 是新興的小漿果類樹種． 藍(lán)莓果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值高， 除一般的果糖、 維生素外還富含抗氧化劑、 花青素和類黃酮， 其獨(dú)特的保健價(jià)值越來越被人們關(guān)注[1-2]． 我國從2000年開始規(guī)?；N植藍(lán)莓， 截至2020年底， 國內(nèi)有超過20個(gè)省(區(qū)、 市)開展產(chǎn)業(yè)化種植， 栽培面積達(dá)6.64萬hm2， 總產(chǎn)量34.72萬t， 我國已成為全球藍(lán)莓主產(chǎn)國之一[3-4]． 云南省具有海拔高、 紫外線強(qiáng)、 光照充足的特點(diǎn)， 藍(lán)莓果實(shí)成熟期較早， 甜度高， 耐貯運(yùn)， 產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢明顯， 目前已在玉溪、 麗江、 曲靖、 大理等地建立了規(guī)?；乃{(lán)莓種植區(qū)． 近年來， 隨著藍(lán)莓栽培面積的不斷擴(kuò)大， 病害也隨之傳播蔓延并逐年加重， 成為制約藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素．

葉斑病是為害藍(lán)莓較嚴(yán)重的病害之一， 主要發(fā)生在藍(lán)莓的營養(yǎng)生長期， 大部分病原菌會(huì)造成果實(shí)病害， 影響藍(lán)莓的產(chǎn)量和質(zhì)量． 國外報(bào)道藍(lán)莓葉斑病主要有兩種類型， 由Septoriaalbopunctata引起的殼針孢型， 以及由Gloeosporiumminus引起的炭疽型， 它們都會(huì)使花芽減少， 進(jìn)而降低果實(shí)產(chǎn)量[5]． 國內(nèi)藍(lán)莓葉部病害的病原鑒定結(jié)果各地不一致． 徐成楠等[6]對(duì)遼寧省部分地區(qū)疑似炭疽病的藍(lán)莓枝條及葉片進(jìn)行病原分離和鑒定， 明確是由尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)和膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)復(fù)合侵染所致． 余磊等[7]報(bào)道云南藍(lán)莓葉斑病普遍發(fā)病率為15%～20%， 嚴(yán)重果園可達(dá)75%以上， 其病原菌為細(xì)極鏈格孢菌(Alternariatenuissima)． 貴州省黔東南州臺(tái)江縣藍(lán)莓種植地發(fā)生的葉斑病， 經(jīng)鑒定病原菌為巨腔莖點(diǎn)霉(Phomamacrostoma)[8]． 石凌波[9]研究發(fā)現(xiàn)擬盤多毛孢(Pestalotiopsistrachicarpicola)是引起廣西桂林藍(lán)莓葉斑病的病原菌． 薛德勝等[10]報(bào)道， 山東半島藍(lán)莓種植基地發(fā)現(xiàn)的藍(lán)莓葉斑病的病原菌為棒狀擬盤多毛孢(Pestalotiopsisclavispora)． 藍(lán)莓葉部病害的癥狀相似度很高， 病原菌種類復(fù)雜多樣， 其為害在國內(nèi)藍(lán)莓種植基地有加重趨勢， 應(yīng)引起足夠重視．

2019年8月， 云南玉溪藍(lán)莓種苗繁育基地首次發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓葉斑病， 發(fā)病初期葉面或葉緣出現(xiàn)紅褐色的小圓斑， 隨著病害的發(fā)展葉斑面積不斷擴(kuò)大， 形成大面積的紅褐色病斑， 繼而葉片枯萎凋落， 植株枯萎死亡． 據(jù)調(diào)查， “綠寶石”發(fā)病最為嚴(yán)重， 發(fā)病率30%以上， 有些地塊甚至成片死亡， 嚴(yán)重影響藍(lán)莓種苗的質(zhì)量． 為明確該病的病原菌種類及生物學(xué)特性， 本研究采用形態(tài)學(xué)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定， 通過活體葉片接種測定病原菌的致病性， 同時(shí)研究病原菌的生物學(xué)特性， 為藍(lán)莓葉斑病的發(fā)生流行規(guī)律研究和綜合防治提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

2019年8月在云南玉溪藍(lán)莓種苗繁育基地采集發(fā)病植株， 帶回實(shí)驗(yàn)室并于4 ℃冰箱保存， 病株樣品及致病性測定試驗(yàn)所用藍(lán)莓品種均為“綠寶石”．

1.2 方法

1.2.1 藍(lán)莓葉斑病病原菌的分離與形態(tài)學(xué)鑒定

選取具有典型癥狀的藍(lán)莓病葉， 采用組織分離法[11]從病健交界處切取5 mm×5 mm的葉片， 在75%乙醇中浸泡3～5 s， 然后置于0.1%升汞中浸泡1～2 min， 用無菌水沖洗3次， 將其接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar， PDA)平板培養(yǎng)基上， 置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d， 挑取菌落邊緣的少量菌絲體進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)． 7 d后挑取菌絲鏡檢， 觀察到分生孢子產(chǎn)生后， 用無菌水配制成1×105個(gè)/mL的孢子懸浮液母液， 將母液稀釋1×104倍并充分混勻． 取0.1 mL孢子懸浮液均勻涂布在4%的水瓊脂平板培養(yǎng)基上， 將培養(yǎng)基切成0.4 cm×0.4 cm的小塊， 逐個(gè)鏡檢后挑取帶有單個(gè)分生孢子的瓊脂塊置于新的PDA平板上， 25 ℃條件下培養(yǎng)， 再接種至PDA斜面培養(yǎng)基上， 4 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定參照Lombard等[12]的方法， 挑取菌絲置于麥芽汁瓊脂(malt extract agar， MEA)培養(yǎng)基上， 于25 ℃培養(yǎng)7 d， 觀察菌落特征． 挑取菌絲置于香石竹葉片培養(yǎng)基上， 于25 ℃條件下培養(yǎng)， 待產(chǎn)孢后于光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子梗及囊泡的形狀． 隨機(jī)選取20個(gè)分生孢子， 觀察其形態(tài)、 隔膜數(shù)， 測量孢子大小．

1.2.2 藍(lán)莓葉斑病病原菌的分子生物學(xué)鑒定

按照生工生物工程(上海)股份有限公司的真菌基因組DNA提取試劑盒提供的方法提取菌株DNA． 參照Carbone等[13]的方法， 選取肌動(dòng)蛋白(actin)、 組蛋白H3(histone H3)、 翻譯延伸因子-1α(translation elongation factor 1-alpha)和β-微管蛋白(β-tubulin)4個(gè)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增所用引物序列見表1． PCR反應(yīng)體系： 2×TaqPCR Green Mix 12.5 μL， 10 μmol/L上游引物和下游引物各1 μL， DNA模板2 μL， ddH2O 8.5 μL， 總體積25 μL． PCR擴(kuò)增程序： 94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性30 s、 50 ℃退火30 s、 72 ℃延伸1 min， 35個(gè)循環(huán)； 最后72 ℃延伸10 min． 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至寶生物工程(大連)有限公司測序， 獲得的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比對(duì)， 并提交序列至GenBank． 從GenBank下載相似度高的Act，H3，EF-1α和β-tub基因序列作為參考序列(表1)， 通過MEGA7.0自舉法(Bootstrap)1 000次重復(fù)檢驗(yàn)， 鄰位相接法(Neighhor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行聚類分析．

表1 多位點(diǎn)基因所用引物序列

1.2.3 藍(lán)莓葉斑病病原菌的致病性測定

采用涂抹接種法[11]進(jìn)行病原菌的致病性測定． 將供試菌株轉(zhuǎn)接至MEA培養(yǎng)基， 25 ℃培養(yǎng)10 d后挑取菌絲鏡檢， 觀察到分生孢子產(chǎn)生后， 用無菌水配制成1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液． 用毛筆將懸浮液涂抹至一年生盆栽藍(lán)莓植株葉片上， 套袋保濕48 h， 去袋后植株在25 ℃、 12 h光照、 12 h黑暗的條件下培養(yǎng)， 觀察葉片發(fā)病情況． 以無菌水涂抹葉片為對(duì)照， 每處理5株． 待葉片發(fā)病后， 根據(jù)柯赫氏法則， 對(duì)病葉進(jìn)行病原分離， 觀察分離菌與原接種菌的形態(tài)學(xué)特征是否一致．

1.2.4 藍(lán)莓葉斑病病原菌的生物學(xué)特性測定

碳、 氮源對(duì)病原菌菌絲生長的影響： 以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 采用葡萄糖、 蔗糖、 麥芽糖、 果糖、 可溶性淀粉為碳源， 硝酸鈉、 甘氨酸、 尿素、 蛋白胨、 硫酸銨為氮源； 用直徑為5 mm的打孔器在活化7 d后的菌落邊緣打取菌餅， 分別接種至含有不同碳源和氮源的培養(yǎng)基上， 25 ℃培養(yǎng)， 7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑， 每處理重復(fù)4次．

溫度對(duì)病原菌菌絲生長的影響： 取直徑5 mm的菌餅轉(zhuǎn)接至PDA平板培養(yǎng)基上， 分別置于5，10，15，20，25，30，35 ℃溫度下培養(yǎng)， 7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑， 每處理重復(fù)4次．

pH值對(duì)病原菌菌絲生長的影響： 用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將PDA培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至4，5，6，7，8，9，10， 用直徑5 mm的打孔器在活化7 d后的菌落邊緣打取菌餅， 接種于不同pH值的PDA平板中央， 置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)， 7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑， 每處理重復(fù)4次．

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 2.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析， 應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)．

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓葉斑病的癥狀

發(fā)病初期葉面或葉緣出現(xiàn)紅褐色的斑點(diǎn)(圖1a)， 隨著病害的發(fā)展， 病斑面積不斷擴(kuò)大， 形成連片的紅褐色病斑(圖1b)， 最終葉片枯萎凋落， 植株枯萎死亡．

圖1 藍(lán)莓葉斑病癥狀

2.2 藍(lán)莓葉斑病病原菌的分離和形態(tài)學(xué)鑒定

從發(fā)病藍(lán)莓葉片上分離獲得3個(gè)菌株， 各菌株的菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性一致． 以菌株LC-1為供試菌株進(jìn)行研究． 菌株在MEA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)2 d即可長出白色至淺紅棕色的絲絨狀菌落(圖2a)． 菌落平伏， 邊緣不整齊， 后期產(chǎn)生褐色至深褐色的色素滲入至培養(yǎng)基內(nèi)部． 大分子孢子無色， 圓柱形， 兩端半圓形， 有1～3個(gè)隔膜， 大小為(48～82) μm×(4～7) μm(圖2b)． 大型分生孢子梗無色， 有分枝， 長303～410 μm， 頂端囊泡棍棒狀， 大小為(12～30) μm×(2～5) μm(圖2c)． 分生孢子梗分枝末端產(chǎn)生2～4個(gè)瓶梗， 頂端為產(chǎn)孢細(xì)胞， 瓶狀， 分生孢子從產(chǎn)孢細(xì)胞內(nèi)生出(圖2d)． 根據(jù)形態(tài)學(xué)特征， 將該病原菌初步鑒定為麗赤殼菌(Calonectriaspp.)．

圖2 病原培養(yǎng)物及病原菌形態(tài)特征

2.3 藍(lán)莓葉斑病病原菌的分子生物學(xué)鑒定

將菌株LC-1的Act，H3，EF-1α和β-tub基因序列提交至NCBI/GenBank(表2)， 獲得登錄號(hào)MZ872640(Act)， MZ872641(H3)， MZ872642(EF-1α)， MZ872643(β-tub)． Blast比對(duì)結(jié)果表明， 供試菌株與柯氏麗赤殼菌(Ca.colhounii)的覆蓋率、 相似度最高． 該菌株的Act，H3，EF-1α和β-tub序列與Ca.colhouniiCBS 293.79相關(guān)基因序列的同源性達(dá)99%以上． 基于4個(gè)基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明， 菌株LC-1與Ca.colhounii聚在同一分支(圖3)， 結(jié)合菌株形態(tài)特征和基因序列分析， 將藍(lán)莓葉斑病的病原菌鑒定為柯氏麗赤殼菌(Ca.colhounii)．

圖3 基于Act，H3，EF-1α和β-tub 4段基因建立的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 系統(tǒng)發(fā)育分析引用的GenBank序列

2.4 藍(lán)莓葉斑病病原菌的致病性測定

將供試菌株LC-1按柯赫氏法則接種， 2 d后葉片開始發(fā)病， 葉面產(chǎn)生紅褐色的小圓斑(圖4a)． 5 d后病斑面積不斷擴(kuò)大， 形成連片的紅褐色病斑， 葉片枯萎凋落(圖4b)， 對(duì)照植株葉片(圖4c)未發(fā)?。?從發(fā)病葉片分離獲得的病原菌與原接種菌性狀一致， 表明Ca.colhounii為藍(lán)莓葉斑病的病原菌．

圖4 病原菌致病性測定

2.5 藍(lán)莓葉斑病病原菌的生物學(xué)特性測定

2.5.1 病原菌對(duì)碳源和氮源的利用

供試菌株在5種碳源培養(yǎng)基上均能生長， 對(duì)可溶性淀粉的利用效果最好， 培養(yǎng)7 d時(shí)菌落直徑為5.18 cm， 其次為葡萄糖， 兩者對(duì)菌絲生長的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5a)． 在氮源利用試驗(yàn)中， 病原菌對(duì)甘氨酸和尿素的利用較好， 菌落直徑分別為5.00 cm和4.76 cm， 兩者對(duì)菌絲生長的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5b)．

2.5.2 不同溫度、 pH值對(duì)菌絲生長的影響

供試菌株在10～30 ℃范圍內(nèi)均能生長， 最適宜溫度為25 ℃， 菌落直徑為7.90 cm； 溫度為10～20 ℃時(shí)菌絲生長較緩慢， 溫度為5 ℃和35 ℃時(shí)菌絲停止生長(圖5c)． 病原菌對(duì)酸堿度適應(yīng)范圍較廣， 在pH值4～10范圍內(nèi)均能生長， 最適pH值為7(圖5d)．

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差， 小寫字母不同表示處理間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．

3 結(jié)論與討論

麗赤殼屬(Calonectria)真菌是一類重要的植物病原菌， 其寄主范圍廣泛， 可侵染桉樹、 花生、 大豆等農(nóng)作物以及綠巨人、 天南星、 睡蓮等園藝植物， 引起葉斑及葉片焦枯、 莖干腐爛、 根系或地下果實(shí)腐爛等癥狀， 造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[17-20]． 麗赤殼屬真菌形態(tài)學(xué)分類的重要依據(jù)是囊泡的形狀， 但是囊泡形狀不易區(qū)分， 因此在確定菌株種群分類時(shí)還需進(jìn)一步的分子生物學(xué)鑒定， 目前結(jié)合形態(tài)學(xué)和多基因系統(tǒng)學(xué)鑒定該屬真菌已成為發(fā)展趨勢[21-22]． Lombard等[12]根據(jù)形態(tài)學(xué)研究和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析， 鑒定了世界范圍內(nèi)的68種麗赤殼屬真菌， 建議對(duì)于未知的麗赤殼屬真菌的鑒定， 可應(yīng)用H3，EF-1α，β-tub3段基因聯(lián)合建樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析， 從而確定其分類地位． 本研究對(duì)云南省玉溪市藍(lán)莓種苗繁育基地發(fā)生的葉部病害進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征及Act，H3，EF-1α和β-tub多基因系統(tǒng)發(fā)育分析， 確定其病原菌為柯氏麗赤殼菌(Ca.colhounii)， 是國內(nèi)首次報(bào)道． 細(xì)極鏈格孢菌(Alternariatenuissima)、 巨腔莖點(diǎn)霉(Phomamacrostoma)、 棒狀擬盤多毛孢(Pestalotiopsisclavispora)等真菌均能侵染藍(lán)莓引起葉斑病， 且引起的癥狀相似度很高， 但與麗赤殼屬真菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)． 目前已發(fā)現(xiàn)麗赤殼屬的另外2個(gè)種群也可侵染藍(lán)莓引起病害， 費(fèi)諾亞等[23-24]報(bào)道湖北隨州藍(lán)莓枝枯病的病原菌為加拿大麗赤殼菌(Ca.canadensis)、 云南曲靖藍(lán)莓根腐病的病原菌為冬青麗赤殼菌(Ca.ilicicola)． 該屬真菌在國內(nèi)藍(lán)莓種植基地的種群分布及病害流行規(guī)律有待進(jìn)一步研究．

病原菌的生物學(xué)特性與病害發(fā)生和流行規(guī)律有著密切的關(guān)系[25]． 蓋云鵬等[26]研究結(jié)果表明， 引起花生黑腐病的冬青麗赤殼在10～30 ℃范圍內(nèi)均能生長， 溫度低于5 ℃或高于35 ℃時(shí)菌絲停止生長， 菌絲最適生長溫度為25～28 ℃； 費(fèi)諾亞等[23]對(duì)加拿大麗赤殼的生物學(xué)特性研究結(jié)果表明， 菌絲生長的最適溫度為25 ℃， 但在5 ℃與35 ℃條件下菌絲不能生長， 這與本研究結(jié)果一致． 生物學(xué)特性研究結(jié)果表明， 柯氏麗赤殼菌在pH值4～10范圍內(nèi)均能生長， 且對(duì)供試大部分碳、 氮源均可有效利用， 表明該菌有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性． 本研究對(duì)于藍(lán)莓葉斑病的鑒定和防治具有指導(dǎo)意義， 為開展該病的田間流行規(guī)律研究及病害防治工作提供了理論依據(jù)．