• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    重慶市部分超市雞肉中單增李斯特菌的耐藥性與分子特征分析

    2022-10-23 12:31:00涂聞君曾政趙明候峰清蔣兵方仁東蔣佳利
    關(guān)鍵詞:菌病單增李斯特

    涂聞君, 曾政, 趙明, 候峰清,蔣兵, 方仁東,4, 蔣佳利,

    1. 西南大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院/動物健康與動物性食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715;2. 重慶市動物疫病預(yù)防控制中心, 重慶 401120; 3. 重慶市江北區(qū)畜牧獸醫(yī)中心, 重慶 400020;4. 草食動物科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715

    單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)簡稱單增李斯特菌, 為兼性厭氧侵襲性胞內(nèi)菌, 為重要的食源性人畜共患病原菌. LM的致病性與毒力基因密切相關(guān), 主要由兩個毒力島群構(gòu)成: 毒力島1主要與胞內(nèi)感染有關(guān), 由6個主要的毒力基因(prfA-plcA-hly-mpl-actA-plcB)編碼組成; 毒力島2主要負(fù)責(zé)黏附與侵襲, 由內(nèi)化素家族(in1A,in1B,in1C到inlH)組成[1]. 病原菌在in1A和in1B的幫助下可穿越胎盤屏障、 血腦屏障和腸道屏障[2], 并在各毒力因子的協(xié)調(diào)下引發(fā)流產(chǎn)、 早產(chǎn)、 胎兒發(fā)育障礙以及腦膜炎、 胃腸炎和敗血癥等臨床癥狀. 雖然LM感染引起的疾病發(fā)生率不高, 但據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道李斯特菌病死亡率卻高達(dá)23.6%[3]. 目前, 臨床上主要應(yīng)用抗生素對李斯特菌病進(jìn)行治療, 但抗生素的廣泛應(yīng)用和不合理使用, 使得LM的耐藥現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重, 甚至出現(xiàn)多重耐藥菌株[4]. LM的致病性也與血清型和基因型的差異密切相關(guān). LM的血清型共分為13種, 其中 1/2a,1/2b,1/2c和4b血清型最易引起人類感染李斯特菌?。?MLST分型主要有16種, 包括ST9,ST1,ST2,ST3,ST5,ST87,ST121,ST8,ST7,ST59,ST4,ST6,ST122,ST155,ST101和ST199[5-6]. 其中, ST5,ST8,ST9和ST87既是引起李斯特菌病暴發(fā)的常見ST型, 又是我國耐藥菌株的常見ST型[7-8]. 致病性血清型、 MLST分型以及耐藥性之間是否具有一定的聯(lián)系, 還需進(jìn)一步的研究. 已有研究發(fā)現(xiàn)LM的進(jìn)化主要是菌株不斷突變的結(jié)果[9], 因此對發(fā)生在食品鏈中LM進(jìn)行生物學(xué)分型檢測, 并根據(jù)分離株的耐藥譜、 血清型和基因型的分布情況繪制進(jìn)化樹, 能有效對污染源進(jìn)行追蹤, 從根源上防止單增李斯特菌病的暴發(fā), 對保護(hù)人類身體健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義. 本研究關(guān)于重慶地區(qū)超市雞肉中LM的污染情況調(diào)查、 耐藥表型分析、 血清型分型和MLST分子分型方法的應(yīng)用將為監(jiān)測程序的建立提供一定的數(shù)據(jù)支撐.

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株

    2018年6月至7月之間, 24株來自重慶地區(qū)超市雞肉中分離到的LM, 均根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 4789.30-2010)中《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)—單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)方法檢測確認(rèn). 標(biāo)準(zhǔn)菌株是單增李斯特菌C53005, 大腸桿菌ATCC25922, 金黃色葡萄球菌ATCC25923, 沙門氏菌ATCC50115, 菌株購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心.

    1.1.2 試劑與儀器

    2×Taq PCR MasterMix(含染料), 100 bp DNA Ladder, ddH2O購自北京Tiangen公司; 單增李斯特菌分離所需各種肉湯和試劑, 均購自北京路橋技術(shù)有限公司; 19種抗生素藥敏紙片購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司; 10對毒力基因引物由重慶奧哲公司合成, 引物信息見表1.

    表1 單增李斯特菌毒力基因引物

    1.2 方法

    1.2.1 毒力基因的檢測

    煮沸法提取菌液DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR的反應(yīng)條件: ① 25 μL反應(yīng)體系: 2×Taq PCR MasterMix(含染料)10 μL, 正、 反向引物(5 μmol/L)各1 μL, DNA模板2 μL, 加ddH2O至25 μL; ② 反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性50 s; 退火(表1); 72 ℃延伸50 s (30個循環(huán)); 72 ℃終延伸10 min.

    1.2.2 藥物敏感性試驗(yàn)

    根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的單增李斯特菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn), 結(jié)合臨床用藥選擇青霉素(P, 10 units)、 苯唑西林(OX, 30 μg)、 氨芐西林(AMP, 10 μg)、 頭孢噻吩(KF, 30 μg)、 頭孢哌酮(CFP, 75 μg)、 頭孢噻肟(CTX, 30 μg)、 紅霉素(E, 15 μg)、 鏈霉素(S, 10 μg)、 慶大霉素(CN, 10 μg)、 萬古霉素(VA, 30 μg)、 多粘菌素B (PB, 300 units)、 四環(huán)素(TE, 30 μg)、 多西環(huán)素(DO, 30 μg)、 氯霉素(C, 30 μg)、 環(huán)丙沙星(CIP, 5 μg)、 阿米卡星(AK, 30 μg)、 磺胺/甲氧芐胺嘧啶(SXT, 25 μg)、 利福平(RD, 5 μg)及呋喃妥因(F, 300 μg)共19種抗生素, 采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn). 同時用大腸桿菌(ATCC25922)、 金黃色葡萄球菌(ATCC25923)和沙門氏菌(ATCC50115)作質(zhì)量控制, 對每種抗菌藥物敏感、 中敏和耐藥的結(jié)果判斷參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)(2013版)中葡萄球菌屬標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行.

    1.2.3 血清學(xué)分型

    采用M Doumith介紹的多重PCR法對LM的血清型進(jìn)行檢測[13].

    1.2.4 MLST分型

    采用法國巴斯德數(shù)據(jù)庫提供的用于單增李斯特菌的MLST分型方法[14]. 擴(kuò)增產(chǎn)物先經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證, 之后送往上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司純化并進(jìn)行測序, 測序結(jié)果利用DNAStar軟件進(jìn)行拼接, 剪取成對應(yīng)管家基因的長度, 提交MLST數(shù)據(jù)庫得到7個管家基因的等位基因編碼(http: //www.pasteur.fr/recherche/ genopole/ PF8/mlst/Lmono.html), 然后將每株菌7個管家基因等位基因編碼按相應(yīng)順序排列, 提交數(shù)據(jù)庫后便可獲得ST型.

    2 試驗(yàn)結(jié)果

    2.1 重慶地區(qū)雞肉中LM的分離情況

    2018年6月至7月之間, 從重慶江北區(qū)、 北碚區(qū)、 江津區(qū)、 南岸區(qū)、 合川區(qū)等5個區(qū)超市的雞肉中采集108份樣品, 共分離出24株LM, 分離率為22.2%.

    2.2 24株LM分離株毒力基因的檢測結(jié)果

    利用PCR法對24株LM進(jìn)行毒力基因檢測, 結(jié)果23株分離株均檢測出10個毒力基因, 僅1株在inlB基因上出現(xiàn)了基因缺失(表2), 菌株攜帶毒力基因普遍, 暗示超市雞肉中存在潛在威脅, 需引起重視.

    表2 24株LM分離株毒力基因分布情況

    2.3 24株LM分離株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

    藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明, 分離株對苯唑西林(96.0%)、 頭孢噻肟(41.7%)和多粘菌素B(37.5%)的耐藥率較高, 而對其余藥物耐藥率低, 其中對頭孢噻吩、 環(huán)丙沙星、 阿米卡星和呋喃妥因完全敏感. 24株LM中耐2種以上的抗生素有7株, 多重耐藥率為29.2%, 并發(fā)現(xiàn)1株對11種抗生素(AMP-OX-P-E-S-CN-VA-TE-C-SXT-RD)耐藥的超級耐藥菌, 具體結(jié)果見表3.

    表3 24株LM分離株對19種抗生素的藥敏結(jié)果

    2.4 24株LM分離株血清學(xué)分型結(jié)果

    血清學(xué)分型結(jié)果顯示, 24株LM共檢出4種血清型, 分別為1/2a,1/2b,1/2c和4b型(圖1). 1/2b型和4b型所占比例分別為25.0%和16.6%, 屬于譜系I, 共10株; 1/2a型和1/2c型所占比例均為29.2%, 屬于譜系II, 共14株. 多重PCR電泳圖(圖2)顯示: 泳道1為單增李斯特菌陽性對照C53005 4b型(4b, 4d, 4e); 泳道2為4b型于597 bp,474 bp,370 bp處有擴(kuò)增片段, 屬于單增李斯特菌血清組4b, 4d, 4e; 泳道3為1/2b型于474 bp,370 bp處有擴(kuò)增片段, 屬于單增李斯特菌血清組1/2b, 3b, 7; 泳道4為1/2c型于906 bp,691 bp,370 bp處有擴(kuò)增片段, 屬于單增李斯特菌血清組1/2c, 3c; 泳道5為1/2a型于691 bp,370 bp處有擴(kuò)增片段, 屬于單增李斯特菌血清組1/2a, 3a; 泳道6為陰性對照.

    圖1 24株LM分離株血清型分布圖

    圖2 分子血清型多重PCR電泳圖

    2.5 24株LM分離株MLST基因分型結(jié)果

    MLST分型共鑒定出11個序列型(Sequence type, ST), 其中易引起單增李斯特菌病的常見ST型(ST87, ST9, ST2)菌株占50%(12/24), 并發(fā)現(xiàn)1個新的ST型, 即ST1011, 目前已提交巴斯德研究所MLST數(shù)據(jù)庫. ST87分布最為廣泛, 其次是ST705, ST9和ST2, 具體分布見圖3.

    圖3 24株LM分離株ST型結(jié)果分布圖

    2.6 24株LM分離株耐藥譜與血清型、 ST型UPGMA tree分析結(jié)果

    進(jìn)化樹結(jié)果顯示: 血清型相同的菌株, 其親緣關(guān)系較近. 首先, 血清型和ST型之間對應(yīng)關(guān)系緊密, 如ST87與1/2b型單增李斯特菌對應(yīng), ST2與4b型LM對應(yīng). 此外, 部分ST型可對應(yīng)于同一血清型, 例如ST705和ST9對應(yīng)于1/2c型LM; ST155,ST11,ST101,ST121和ST8都對應(yīng)于1/2a型LM. 其次, 耐受苯唑西林和同時耐受苯唑西林—頭孢噻肟的單增李斯特菌MLST分型有明顯集中趨勢, 主要集中在 ST705,ST87和ST2上. 江北區(qū)(JB)、 江津區(qū)(JJ)、 南岸區(qū)(NA)、 合川區(qū)(HC)分離到的菌株同源性較高, 大多數(shù)耐受苯唑西林, 且血清型均為譜系II; 而北碚區(qū)(BB)分離到的菌株大多耐受苯唑西林—頭孢噻肟, 且血清型均為譜系I, 具體分布見圖4.

    圖4 耐藥譜與血清型、 ST型UPGMA tree 分析圖

    3 討論

    單增李斯特菌廣泛存在于自然界中, 食入被LM污染的食品是單增李斯特菌病暴發(fā)的主要原因. 在對國內(nèi)已報(bào)道的肉品中LM污染情況分析發(fā)現(xiàn), 雖然2010年后單增李斯特菌總體分離率較此前有所下降, 但肉品中LM的污染率仍然處在較高水平[15]. 且在各類肉品檢測結(jié)果中, 雞肉中LM污染率顯著高于其他各類肉品[16]. 因此, 鑒定和監(jiān)測超市雞肉中LM的污染情況, 可以確定適當(dāng)?shù)姆揽卮胧?最大限度地減少雞肉中LM的存在, 這對于公共衛(wèi)生安全極為重要. 在本研究中, LM的分離率為22.2%(24/108), 該結(jié)果低于蔣興祥等[17]的報(bào)道(53.3%, 16/30), 高于烏日娜等[18]的報(bào)道(8.33%, 10/120), 而與吳曉芳等[19]的報(bào)道基本一致(25%, 10/40).

    LM的血清型共分為13種. 其中, 血清型1/2a,1/2b,1/2c和4b最易引起人類感染李斯特菌病, 也是中國食品中分離LM菌株的優(yōu)勢血清型[20]. 有研究顯示, 超過95%的人類李斯特菌病是由血清型4b,1/2a和1/2b造成的[21]. 本試驗(yàn)中24株LM大多為1/2a,1/2b和1/2c型, 另有4株致病性較強(qiáng)的4b型菌株, 該結(jié)果與Sosnowski等[22]報(bào)道的基本一致. 雖然雞肉中致病性 LM 血清型污染率很高, 但目前我國李斯特菌病報(bào)道的較少, 可能與我國對該菌的監(jiān)測系統(tǒng)和檢測水平不高有關(guān).

    由于血清型對LM的分辨能力過低, 因此, 它不能對該菌進(jìn)行準(zhǔn)確溯源. 而多位點(diǎn)序列分型(MLST)方法, 是在多位點(diǎn)酶切電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上為研究菌群基因結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)的一種高分辨率分型技術(shù). 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道, ST5,ST8,ST9和ST87是引起食源性LM暴發(fā)的主要ST型, 常造成人類感染單增李斯特菌病[7-8]. 在本次試驗(yàn)中, 24株LM鑒定出11個ST型, 其中易引起單增李斯特菌病的常見ST型(ST87,ST9,ST2)菌株占50%(12/24), 并發(fā)現(xiàn)1個新的ST型, 即ST1011. 進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示分離株血清型相同的菌株, 親緣關(guān)系較近. 首先對比MLST與血清型發(fā)現(xiàn), LM血清型和ST型之間都有著十分緊密的對應(yīng)關(guān)系, 并且大部分ST型與血清型存在一一對應(yīng)的關(guān)系, 如ST87與1/2b型對應(yīng), ST2與4b型對應(yīng); 但也有2種或以上ST型可對應(yīng)于同一血清型, 例如ST705和ST9對應(yīng)于1/2c型, ST155,ST11,ST101,ST121和ST8都對應(yīng)于1/2a型. 其次, 耐受苯唑西林和同時耐受苯唑西林—頭孢噻肟的單增李斯特菌MLST分型有明顯集中趨勢, 主要集中在ST705,ST87和ST2上; 而Wu等[14]的結(jié)果與該試驗(yàn)不一致, 它主要集中在ST8,ST1和ST87上. MLST分型技術(shù)可以較好地用于肉品中單增李斯特菌污染的分子溯源, 但本研究僅從雞肉中分離到LM并做MLST分型分析其危害性, 未能對雞肉中LM污染的來源進(jìn)行深入研究. 后續(xù)可從超市環(huán)境中和雞的屠宰加工車間采樣分離LM, 與雞肉中分離的LM進(jìn)行分子分型研究, 找出雞肉中LM污染的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn), 為進(jìn)一步降低雞肉中LM的污染提供技術(shù)支持.

    近年來, 食品中分離出的LM對抗生素的耐藥現(xiàn)象愈加嚴(yán)重, 這無疑給食品安全帶來了潛在性威脅. 抗生素的廣泛使用會導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生, 刀麗梅等[23]和周瑤琴等[24]發(fā)現(xiàn)雞源和牛源分離株中耐藥菌占大部分, 且表現(xiàn)為多重耐藥現(xiàn)象. 本試驗(yàn)中 LM 主要耐受苯唑西林、 頭孢噻肟和多粘菌素B; 對四環(huán)素、 紅霉素、 氯霉素、 環(huán)丙沙星敏感性較高, 這與閆韶飛等[25]和趙悅等[26]的報(bào)道恰恰相反, 與Chen等[27]的報(bào)道結(jié)果不完全一致, 而與王紅等[28]報(bào)道的結(jié)果較一致. 另外, 在本試驗(yàn)中部分菌株已對一線藥物氨芐西林和青霉素產(chǎn)生了耐藥性. 24株分離株中耐2種以上抗生素的有7株, 多重耐藥率為 29.2%, 該結(jié)果與 Sosnowski等[22]的報(bào)道基本一致(27.4%, 40/146), 而高于 Wieczorek等[29]的報(bào)道(3.5%, 2/57). 值得注意的是, 這些耐藥菌株大多分布在我國常見LM的ST型(ST87,ST705,ST9和ST2)中. 其中, 在ST9型菌株中發(fā)現(xiàn)1株對11種抗生素耐藥的超級耐藥菌, 這與之前研究報(bào)道的ST9型菌株多重耐藥現(xiàn)象較嚴(yán)重相符[30]. 應(yīng)對該超級耐藥菌株做進(jìn)一步研究, 這將有助于闡明ST9型菌株與多重耐藥的關(guān)系. 本研究還發(fā)現(xiàn), 分離株血清型相同的菌株, 其耐藥株ST型和引起單增李斯特菌病常見ST型具有相近的流行趨勢, 均主要分布在ST87,ST9,ST705型中, 這三者之間是否具有一定的遺傳進(jìn)化關(guān)系, 還需要做進(jìn)一步研究.

    目前, 關(guān)于LM在雞肉中致病性的研究較少, 毒力基因編碼的毒力因子是LM致病的分子基礎(chǔ). 通過檢測毒力基因, 可以了解這些基因在重慶LM中的分布. LM感染宿主的每一步均有特定的毒力基因編碼的毒力因子的精確調(diào)控.prfA是毒力島上一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因, 對島上其他基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控, 它的缺失將直接導(dǎo)致LM毒力的下降[31]. 因此, LM毒力基因攜帶率越高, 其致病性也將越強(qiáng), 反之則導(dǎo)致致病性的消失或下降. 本試驗(yàn)24株分離株中, 23株均檢測出10個毒力基因, 僅1株在inlB基因上出現(xiàn)基因缺失. 這與宮照龍等[11]和廖興廣等[32]的研究結(jié)果基本一致. 但有文獻(xiàn)報(bào)道, LM為了更好地適應(yīng)環(huán)境, 其毒力基因在自然條件下都存在不同程度的缺失[10,33]. 因此, 我們在對LM毒力基因建立檢測時, 要考慮到毒力基因缺失導(dǎo)致檢測結(jié)果假陽性的問題, 從而更好地防控李斯特菌病的暴發(fā).

    猜你喜歡
    菌病單增李斯特
    冰箱囤貨要警惕這個“搗蛋分子”
    冰箱里的“殺手”
    黨員文摘(2022年1期)2022-04-03 21:37:19
    羔羊沙門菌病的中西藥治療方法
    播散型組織胞漿菌病研究進(jìn)展
    綿羊彎曲菌病的診斷與防治分析
    我請鴿子來吃飯
    幼兒園(2019年7期)2019-09-05 17:49:18
    基于PasteurMLST網(wǎng)站分析中國單增李斯特菌克隆復(fù)合體的多樣性
    肺組織胞漿菌病一例
    保持肅靜
    小小說月刊(2013年6期)2013-05-14 14:55:19
    三重LAMP法檢測食品中沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌
    特级一级黄色大片| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲人成电影免费在线| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 成人国产综合亚洲| 国产一级毛片七仙女欲春2| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲av成人av| 色av中文字幕| 色播亚洲综合网| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费看a级黄色片| 看黄色毛片网站| 久久久久久久精品吃奶| 丰满人妻一区二区三区视频av | 久久伊人香网站| 久99久视频精品免费| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久99久视频精品免费| 色综合站精品国产| av在线蜜桃| 最新在线观看一区二区三区| 90打野战视频偷拍视频| 我要搜黄色片| 国模一区二区三区四区视频| 香蕉丝袜av| 久久国产精品影院| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久午夜亚洲精品久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日本五十路高清| 一a级毛片在线观看| 国产av不卡久久| 欧美成人性av电影在线观看| 日本a在线网址| 久久久久久久久久黄片| 国产老妇女一区| 亚洲人成网站高清观看| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 99国产综合亚洲精品| av视频在线观看入口| 叶爱在线成人免费视频播放| 日韩欧美 国产精品| 国产av麻豆久久久久久久| xxxwww97欧美| 禁无遮挡网站| 最近视频中文字幕2019在线8| 午夜亚洲福利在线播放| 很黄的视频免费| 亚洲第一电影网av| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 国产三级在线视频| 久久精品国产综合久久久| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 午夜免费激情av| 性色avwww在线观看| 亚洲av电影在线进入| 国产精品免费一区二区三区在线| 精品人妻1区二区| 久久久久久人人人人人| 欧美不卡视频在线免费观看| 91在线观看av| 婷婷亚洲欧美| 国产真实伦视频高清在线观看 | 波野结衣二区三区在线 | 久久久国产成人免费| 亚洲国产精品成人综合色| 五月玫瑰六月丁香| 欧美成人a在线观看| 一级黄片播放器| 99热6这里只有精品| 嫩草影院入口| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美黑人巨大hd| 黄色女人牲交| 小说图片视频综合网站| 亚洲av电影不卡..在线观看| 午夜激情福利司机影院| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲片人在线观看| 亚洲av成人av| av女优亚洲男人天堂| 亚洲成a人片在线一区二区| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 十八禁网站免费在线| 91字幕亚洲| 亚洲专区国产一区二区| 天天一区二区日本电影三级| 色哟哟哟哟哟哟| 免费av毛片视频| а√天堂www在线а√下载| 国产亚洲精品久久久com| 最近在线观看免费完整版| 超碰av人人做人人爽久久 | 婷婷精品国产亚洲av| 丁香六月欧美| 国产在视频线在精品| 久9热在线精品视频| 欧美成人性av电影在线观看| 日韩高清综合在线| 色播亚洲综合网| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 午夜福利欧美成人| 国产三级中文精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲在线观看片| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 成年版毛片免费区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产av麻豆久久久久久久| 久久久久性生活片| 日本一二三区视频观看| 禁无遮挡网站| 久久精品91无色码中文字幕| 18美女黄网站色大片免费观看| 99久久综合精品五月天人人| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产私拍福利视频在线观看| 99热6这里只有精品| 国产免费男女视频| 国产91精品成人一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 免费看光身美女| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲最大成人手机在线| 真实男女啪啪啪动态图| 老司机深夜福利视频在线观看| av天堂中文字幕网| 网址你懂的国产日韩在线| 日韩大尺度精品在线看网址| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 桃色一区二区三区在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲av不卡在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲精品日韩av片在线观看 | h日本视频在线播放| 99久久精品一区二区三区| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 亚洲片人在线观看| 天天添夜夜摸| 长腿黑丝高跟| 久久精品国产自在天天线| 又粗又爽又猛毛片免费看| 欧美极品一区二区三区四区| 午夜视频国产福利| 欧美日韩精品网址| 国产av麻豆久久久久久久| 制服人妻中文乱码| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品日产1卡2卡| 国产精品久久电影中文字幕| 在线播放国产精品三级| 日日夜夜操网爽| 亚洲专区国产一区二区| 久久香蕉国产精品| 黄色片一级片一级黄色片| 精品久久久久久久久久免费视频| 制服人妻中文乱码| 中文在线观看免费www的网站| 特大巨黑吊av在线直播| 性欧美人与动物交配| 亚洲成人久久爱视频| 麻豆国产av国片精品| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美+日韩+精品| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲精品一区av在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲国产欧美网| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产色爽女视频免费观看| 波多野结衣巨乳人妻| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久久国产精品麻豆| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 欧美又色又爽又黄视频| 一区二区三区高清视频在线| 成年女人看的毛片在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 亚洲成人免费电影在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美zozozo另类| 国产日本99.免费观看| 欧美中文日本在线观看视频| 国产成人av激情在线播放| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品 国内视频| 国产精品野战在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 欧美一区二区亚洲| 国产精品久久视频播放| 久99久视频精品免费| 校园春色视频在线观看| 丁香六月欧美| 黄色日韩在线| 亚洲真实伦在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 99热只有精品国产| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲人成电影免费在线| 国产97色在线日韩免费| 亚洲男人的天堂狠狠| 午夜视频国产福利| 身体一侧抽搐| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲av免费高清在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 高清在线国产一区| 在线国产一区二区在线| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 一本久久中文字幕| 欧美乱色亚洲激情| 国产三级黄色录像| 男女那种视频在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久九九热精品免费| 亚洲无线观看免费| 久久久国产精品麻豆| 国产高清videossex| 午夜福利18| 亚洲五月婷婷丁香| 怎么达到女性高潮| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产不卡一卡二| 天堂√8在线中文| 国产精品 国内视频| 女警被强在线播放| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲成a人片在线一区二区| e午夜精品久久久久久久| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 麻豆成人av在线观看| 国产主播在线观看一区二区| aaaaa片日本免费| 久久精品91蜜桃| 99国产综合亚洲精品| 日本黄色片子视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久人人精品亚洲av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 69人妻影院| 熟女人妻精品中文字幕| 在线播放国产精品三级| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲av一区综合| 久久国产精品人妻蜜桃| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲性夜色夜夜综合| 51国产日韩欧美| 亚洲av成人精品一区久久| 看片在线看免费视频| 国产精品国产高清国产av| 免费看a级黄色片| 色综合站精品国产| 一级作爱视频免费观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲,欧美精品.| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 天堂动漫精品| 男插女下体视频免费在线播放| 最新在线观看一区二区三区| 99热精品在线国产| 国产精品1区2区在线观看.| 五月伊人婷婷丁香| 成人午夜高清在线视频| 美女高潮的动态| 99国产精品一区二区三区| 亚洲国产欧美人成| 国产探花在线观看一区二区| 男女午夜视频在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月 | 国产激情欧美一区二区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 欧美av亚洲av综合av国产av| 丰满乱子伦码专区| 国产视频内射| 日日夜夜操网爽| 国产av在哪里看| 久久精品91无色码中文字幕| 757午夜福利合集在线观看| 露出奶头的视频| 怎么达到女性高潮| 亚洲av成人av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 一级黄色大片毛片| 天堂√8在线中文| 高清毛片免费观看视频网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲av一区综合| 美女高潮的动态| 在线观看舔阴道视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产成人福利小说| 精品久久久久久久久久久久久| 国产真实伦视频高清在线观看 | 欧美激情在线99| 特级一级黄色大片| 日韩欧美三级三区| 99热6这里只有精品| 亚洲午夜理论影院| 亚洲七黄色美女视频| 久久精品91无色码中文字幕| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 久久久久久久午夜电影| 免费一级毛片在线播放高清视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 男女视频在线观看网站免费| 国产69精品久久久久777片| 中文字幕高清在线视频| 亚洲精品在线观看二区| 欧美一区二区亚洲| 真人做人爱边吃奶动态| a级毛片a级免费在线| 国产激情偷乱视频一区二区| 成人特级av手机在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产成人a区在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲精华国产精华精| 国产av一区在线观看免费| 久久香蕉精品热| 精品国产美女av久久久久小说| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美一级毛片孕妇| 两个人的视频大全免费| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 九九在线视频观看精品| 高清毛片免费观看视频网站| 成年女人看的毛片在线观看| 最近在线观看免费完整版| 亚洲精品在线美女| 亚洲最大成人手机在线| 国产高潮美女av| 午夜精品在线福利| 国产99白浆流出| 久久午夜亚洲精品久久| ponron亚洲| 成人av在线播放网站| 国产高潮美女av| 一级作爱视频免费观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产成人a区在线观看| 亚洲色图av天堂| 国产私拍福利视频在线观看| 日韩有码中文字幕| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产成人欧美在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 日本一本二区三区精品| 91字幕亚洲| 丰满乱子伦码专区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久国产精品人妻蜜桃| h日本视频在线播放| 天堂动漫精品| 久久久国产成人精品二区| 动漫黄色视频在线观看| 日本a在线网址| 免费看光身美女| 亚洲av熟女| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久亚洲真实| netflix在线观看网站| 国产精品一及| 无人区码免费观看不卡| 欧美精品啪啪一区二区三区| 美女免费视频网站| 天美传媒精品一区二区| 国产av一区在线观看免费| 亚洲成人久久性| 深爱激情五月婷婷| 国产精品久久电影中文字幕| 国产男靠女视频免费网站| 国产亚洲欧美98| 搡老岳熟女国产| 国产精品久久电影中文字幕| 丰满人妻一区二区三区视频av | 欧美+亚洲+日韩+国产| 女警被强在线播放| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲av免费高清在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美乱色亚洲激情| 国产91精品成人一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 亚洲精品日韩av片在线观看 | 欧美一区二区精品小视频在线| 51国产日韩欧美| 2021天堂中文幕一二区在线观| 免费看日本二区| 男人舔女人下体高潮全视频| 在线看三级毛片| 国产99白浆流出| 狠狠狠狠99中文字幕| 99热精品在线国产| 亚洲成人精品中文字幕电影| 啪啪无遮挡十八禁网站| 脱女人内裤的视频| 男女午夜视频在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产在视频线在精品| 91av网一区二区| 国产69精品久久久久777片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产精品久久电影中文字幕| 深夜精品福利| 人人妻人人看人人澡| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美不卡视频在线免费观看| 一区二区三区免费毛片| 全区人妻精品视频| 国产精品久久视频播放| 欧美激情久久久久久爽电影| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 色视频www国产| 久久国产精品影院| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 最近最新中文字幕大全电影3| av中文乱码字幕在线| 成人av在线播放网站| 精品人妻1区二区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 在线视频色国产色| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美最新免费一区二区三区 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品国产高清国产av| 少妇的逼好多水| 黄色丝袜av网址大全| av国产免费在线观看| 在线播放国产精品三级| 十八禁网站免费在线| 成人精品一区二区免费| 69av精品久久久久久| 欧美日韩精品网址| 好男人在线观看高清免费视频| 日韩精品青青久久久久久| 欧美黄色淫秽网站| 丰满的人妻完整版| 99久久精品一区二区三区| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 久久香蕉精品热| 成人av在线播放网站| 免费看a级黄色片| 国产精品 欧美亚洲| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 变态另类丝袜制服| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产成人福利小说| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久精品国产自在天天线| 男人的好看免费观看在线视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 黄色女人牲交| 免费在线观看亚洲国产| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 内地一区二区视频在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 18美女黄网站色大片免费观看| 一个人看的www免费观看视频| а√天堂www在线а√下载| 久久精品国产综合久久久| 九色成人免费人妻av| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久国产乱子伦精品免费另类| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精品国产高清国产av| 亚洲av电影在线进入| 欧美大码av| 国产高清激情床上av| 亚洲精品456在线播放app | 韩国av一区二区三区四区| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产综合懂色| 美女免费视频网站| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品1区2区在线观看.| 日本五十路高清| bbb黄色大片| 日韩人妻高清精品专区| 成年人黄色毛片网站| 九九在线视频观看精品| 国产高清有码在线观看视频| 国产熟女xx| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 中文字幕久久专区| 十八禁网站免费在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲美女黄片视频| 桃色一区二区三区在线观看| 午夜福利18| 国产美女午夜福利| 久久香蕉精品热| 国产精品 国内视频| 午夜日韩欧美国产| 18禁国产床啪视频网站| 99久久综合精品五月天人人| 此物有八面人人有两片| bbb黄色大片| 久久精品人妻少妇| 中亚洲国语对白在线视频| 看黄色毛片网站| 九九热线精品视视频播放| 成人欧美大片| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 小说图片视频综合网站| 国产亚洲欧美98| 99精品欧美一区二区三区四区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 一a级毛片在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产精品 国内视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日本免费a在线| 国产午夜精品论理片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费在线观看日本一区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 成人一区二区视频在线观看| av在线天堂中文字幕| 久久国产精品影院| 免费观看的影片在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 熟女人妻精品中文字幕| 国产免费一级a男人的天堂| 久久久色成人| 成人特级黄色片久久久久久久| 最近最新免费中文字幕在线| 老司机在亚洲福利影院| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美成狂野欧美在线观看| 日本黄大片高清| 久久久国产成人免费| 亚洲精品亚洲一区二区| 午夜久久久久精精品| 九色成人免费人妻av| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美黄色片欧美黄色片| 天堂网av新在线| 国产高清视频在线观看网站| 校园春色视频在线观看| 日韩欧美精品v在线| 免费在线观看成人毛片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 免费人成视频x8x8入口观看| 91九色精品人成在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 看片在线看免费视频| 久久久精品欧美日韩精品| 国产亚洲精品一区二区www| 九九热线精品视视频播放| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 亚洲av中文字字幕乱码综合| 精品乱码久久久久久99久播| 在线播放国产精品三级| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产亚洲欧美98| 最好的美女福利视频网| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品亚洲一区二区| 无人区码免费观看不卡| 99国产极品粉嫩在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 欧美黄色片欧美黄色片| 内射极品少妇av片p| 18美女黄网站色大片免费观看| 久久香蕉精品热| 久久久色成人| 久久久久久九九精品二区国产| 久久午夜亚洲精品久久| 国内精品美女久久久久久| www.www免费av|