乳酸菌發(fā)酵龍葵果工藝優(yōu)化及抗氧化性研究

夏秋霞，段騰飛，田元強，柳雅麗

宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州,234000

龍葵別名苦葵，水茄，是一年生草本植物[1]，廣泛分布于亞、歐、美洲的溫帶和熱帶地區(qū)。成熟的龍葵果中含有蛋白質(zhì)、有機酸、生物堿、皂苷、酚類物質(zhì)以及多糖等功能性成分[2-5],具有良好的抑菌、抗腫瘤和抗氧化功效[6-9]。乳酸菌極為廣泛地分布在自然界中，將乳酸菌應用于飲料制品具有較高研究價值[10]。研究結果表明食品經(jīng)發(fā)酵后抗氧化性增強[11]，主要是因為微生物的代謝會使食品中酚類化合物降解[12]，使得抗氧化性物質(zhì)增加。近年來對龍葵果發(fā)酵方面的研究日趨增加，研究開發(fā)龍葵果果酒、果醋和酸奶等發(fā)酵類產(chǎn)品越來越多[13-14]。實驗以成熟龍葵果為原料，選用嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)發(fā)酵龍葵果汁，先進行單因素實驗，通過測定感官評定和活菌數(shù)作為評定標準，對其進行響應面優(yōu)化，以期得到一種感官評分高，富含乳酸菌且具有抗氧化性的龍葵果汁，為今后在龍葵果食品中的研究提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗材料與試劑

材料：嗜酸乳桿菌CICC20250(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)，龍葵果(宿州市大潤發(fā)超市)。MRS肉湯、水楊酸鈉等均為分析純。

1.1.2 實驗儀器

722S型分光光度計(馳唐精密儀器有限公司)；ZXMP-R1150型恒溫培養(yǎng)箱(廣州番禺旭東坂田電子有限公司)；SW-CJ-1CU型超凈臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

龍葵果清洗→榨汁→過濾→調(diào)配→滅菌→接種→發(fā)酵→測定

1.2.2 單因素實驗

取保存的嗜酸乳桿菌CICC20250于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。測定活菌數(shù)達到2×108CFU/mL，置于-4 ℃冰箱下保存?zhèn)溆?。探究接菌量體積分數(shù)(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)、發(fā)酵時間(16 h，18 h，20 h，22 h，24 h)、發(fā)酵溫度(33 ℃，35 ℃，37 ℃，39 ℃，41 ℃)和可溶性固形物含量質(zhì)量分數(shù)(9%，11%，13%，15%，17%)對龍葵果汁品質(zhì)的影響。

1.2.3 實驗指標

感官評分。選擇15位專業(yè)評定人員組成評定小組，進行感官評定(表1)。

表1 感官評分標準[15-16]

活菌數(shù)測定。采用傾注平板計數(shù)法[17]，取發(fā)酵果汁稀釋到10-5、10-6、10-7，然后取1 mL稀釋果汁加入培養(yǎng)皿中，并倒入MRS固體培養(yǎng)基混勻，對每個梯度稀釋果汁進行三組平行實驗，37 ℃培養(yǎng)48 h，進行平板計數(shù)，記錄實驗數(shù)據(jù)。

1.2.4 響應面分析

以-1，0，1代表自變量水平，發(fā)酵龍葵果汁活菌數(shù)和感官評分為響應面值進行優(yōu)化處理(表2)。

表2 因素水平表

1.2.5 發(fā)酵龍葵果汁理化指標

在最優(yōu)發(fā)酵條件下每隔2 h取樣，測定發(fā)酵龍葵果汁中黃酮(硝酸鋁法測定)，總酚(福林酚法)，pH，活菌數(shù)等。

1.2.6 發(fā)酵龍葵果汁抗氧化性研究

(1)發(fā)酵龍葵果汁中羥自由基清除能力的測定

H2O2/Fe體系反應法：羥自由基清除能力={[A0-(A1-A2)/A0}×100%

(2)發(fā)酵龍葵果汁中超氧陰離子自由基清除能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法：超氧陰離子自由基清除能力={[A0-(A1-A2)]/A0}×100%

2 結果分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 接菌量對發(fā)酵龍葵果汁的影響

嗜酸乳桿菌發(fā)酵龍葵果汁在接菌量從0.5%～2.5%的區(qū)間里變化明顯(見圖1)，接入1.5%嗜酸乳桿菌時龍葵果汁中活菌數(shù)到達最大值9.0×107CFU/mL并且感官評分達到85分。在接菌量1.0%～1.5%的區(qū)間里，龍葵果汁中的活菌數(shù)增加12.5%，增加明顯。感官評分從72分增加到85分，增加18.1%，口感酸澀變化明顯，嗜酸乳桿菌發(fā)酵效果明顯，口感優(yōu)良。接菌量大于1.5%時，龍葵果經(jīng)過發(fā)酵后果汁酸度較高，果汁出現(xiàn)渾濁，部分乳酸菌死亡，活菌數(shù)下降，最終趨于穩(wěn)定，果汁口感變差且無果汁香氣。綜合考慮在接菌量1.5%時嗜酸乳桿菌發(fā)酵龍葵果汁的效果最好。

圖1 嗜酸乳桿菌接菌量對龍葵果汁發(fā)酵的影響

2.1.2 發(fā)酵時間對發(fā)酵龍葵果汁的影響

從圖2得到，發(fā)酵時間22 h時龍葵果汁中嗜酸乳桿菌菌數(shù)和感官評分達到最高值分別為1.58×108CFU/mL和88分，果汁口感酸甜清香。在20～22 h內(nèi)龍葵果汁中嗜酸乳桿菌從6.8×107CFU/mL增加到1.58×108CFU/mL提高32.7%，感官評分從78分增加到88分，增加了12.8%，感官評分差距顯著。隨著時間延長，龍葵果汁中嗜酸乳桿菌的活性下降，在24 h時活菌數(shù)下降，果汁渾濁口感粗糙。綜合考慮選擇發(fā)酵時間22 h進行后續(xù)實驗。

圖2 不同發(fā)酵時間對嗜酸乳桿菌發(fā)酵龍葵果汁的影響

2.1.3 溫度對發(fā)酵龍葵果汁的影響

從圖3得到，在37 ℃時龍葵果汁中嗜酸乳桿菌達到最大值1.58×108CFU/mL，嗜酸乳桿菌活性較佳，感官評分90分，龍葵果汁口感清香，回味酸甜可口。發(fā)酵龍葵果汁在35 ℃～37 ℃時，嗜酸乳桿菌從1.18×108CFU/mL增加到1.58×108CFU/mL，增加了33.9%，感官評分從75分增加到90分。在37 ℃～41 ℃，感官評分和活菌數(shù)逐漸降低，口感酸澀，顏色渾濁差距較為明顯，可能是在超過最適發(fā)酵溫度后嗜酸乳桿菌活性降低并且少量死亡，口味也逐漸下降，變得苦澀。綜合考慮選擇發(fā)酵溫度37 ℃進行后續(xù)實驗。

圖3 溫度對乳酸菌發(fā)酵龍葵果汁的影響

2.1.4 可溶性固形物對發(fā)酵龍葵果汁的影響

從圖4得到，可溶性固形物(Soluble solid content,SSC)為13%時，發(fā)酵龍葵果汁中嗜酸乳桿菌為1.93×108CFU/mL，感官評分91分，味感清甜，入口微酸，果香宜人。SSC為9%～11%時，發(fā)酵龍葵果汁中嗜酸乳桿菌由1.42×108CFU/mL增至1.74×108CFU/mL，增加22.5%。SSC在11%～13%里感官評分從74分增加到91分，味感變化明顯，果香清透，入口微酸，色澤明顯提高。SSC在13%～17%里龍葵發(fā)酵果汁感官評分以及嗜酸乳桿菌數(shù)下降，風味酸澀，整體口感變化較大。SSC為17%時果汁口感酸澀有明顯渾濁沉淀，綜合考慮SSC在13%時嗜酸乳桿菌發(fā)酵龍葵果汁最有優(yōu)勢。

圖4 可溶性固形物對乳酸菌發(fā)酵龍葵果汁影響

2.2 響應面試驗優(yōu)化結果

2.2.1 模型建立及其顯著性檢驗

自變量選擇接菌量、果汁發(fā)酵時間、果汁發(fā)酵溫度以及可溶性固形物含量，響應值選擇龍葵果汁中活菌數(shù)和感官評分(見表3)，進行龍葵果汁發(fā)酵工藝優(yōu)化。

表3 響應面實驗表

2.2.2 活菌數(shù)方差分析

依據(jù)分析，活菌數(shù)=190.40-2.17×A+5.92×B-8.92×C-5.00×D+25.50×A×B+5.75×A×C-6.75×A×D+6.00×B×C-5.25×B×D-6.00×C×D-40.41×A2-57.78×B2-53.28×C2-44.91×D2

依據(jù)表4所得，試驗模型P<0.000 1極顯著，失擬項P=0.489 1>0.05，差異不顯著，說明實驗模型可靠。同時R2=0.992 3，矯正R2=0.984 7，C.V=4.64%<5.00%，證明實驗誤差較小，實驗模型具有可信度。果汁中活菌數(shù)受4個不同因素干擾強弱程度為C>B>D>A，表明溫度對果汁中活菌數(shù)影響最為顯著。C、AB、A2、B2、C2、D2對龍葵果汁活菌數(shù)影響極顯著(P<0.01)，B、D、AC、AD、BC對龍葵果汁活菌數(shù)影響顯著(P<0.05)。

表4 活菌數(shù)方差分析表

2.2.3 感官評分方差分析

依據(jù)分析，感官評分=96.60-0.25×A+3.25×B-4.50×C-3.00×D+11.00×A×B+3.25×A×C-3.00×A×D+5.50×B×C-2.25×B×D-1.75×C×D-16.38×A2-23.13×B2-21.01×C2-17.76×D2

依據(jù)表5得，試驗模型極顯著(P<0.000 1)，失擬項P=0.178 3>0.05，差異不顯著，說明方程模擬的比較好，模型數(shù)據(jù)具有可靠性。同時R2=0.987 1，矯正R2=0.974 2，C.V=4.19%<5.00%，證明實驗誤差較小，實驗結果具有可信度。果汁感官評分受四個不同因素影響程度為C>B>D>A，表明溫度對果汁中感官評分影響最為顯著。C、AB、A2、B2、C2、D2對龍葵果汁感官評估干擾極顯著(P<0.05)，B、D、AC、AD、BC對龍葵果汁感官評估分數(shù)干擾顯著(P<0.05)。

表5 感官評分方差分析表

2.3 發(fā)酵龍葵果汁理化性質(zhì)研究

2.3.1 龍葵果汁pH值變化

從圖5看出，在0～22 h時，發(fā)酵龍葵果汁pH從4.51減少到3.48，減少22.8%。在0～4 h時，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)較少，發(fā)酵效果不明顯，產(chǎn)生乳酸較少，pH下降不明顯。在6～14 h時測得龍葵果汁pH下降顯著，這與嗜酸乳桿菌明顯增加產(chǎn)生大量乳酸有關。在18～24 h時，活菌數(shù)趨于穩(wěn)定，果汁pH下降不明顯。綜合得到，龍葵果汁發(fā)酵過程中pH值下降，符合果汁理化指標，果汁酸甜可口，風味改善明顯。

圖5 最優(yōu)發(fā)酵條件下龍葵發(fā)酵果汁pH變化

2.3.2 龍葵果汁總酚含量的變化

從圖6得到，在0～22 h發(fā)酵龍葵果汁中總酚含量從1.03 μg/mL增至1.29 μg/mL，增加了25.2%，上升明顯，22～24 h變化不明顯，趨于穩(wěn)定。這是由于嗜酸乳桿菌在代謝過程中積累的糖基水解酶將黃酮類相應的苷元等降解使得發(fā)酵的龍葵果汁中總酚含量上升[10]。最優(yōu)發(fā)酵條件下隨著嗜酸乳桿菌的代謝，果汁的總酚含量上升明顯，發(fā)酵效果良好。

圖6 最優(yōu)發(fā)酵條件下龍葵發(fā)酵果汁總酚變化

2.3.3 龍葵果汁黃酮含量的變化

從圖7得到，在龍葵發(fā)酵果汁發(fā)酵條件0～22 h黃酮從1.20 mg/g增至1.57 mg/g，增加了30.8%，增加效果明顯，24 h時變化不明顯，與活菌數(shù)增加和生物降解提高，產(chǎn)生酶類使得龍葵果細胞壁基質(zhì)分解使得黃酮增加有關。實驗結果表明最優(yōu)發(fā)酵條件下龍葵果汁黃酮含量增加明顯，發(fā)酵效果良好。

圖7 最優(yōu)發(fā)酵條件下龍葵發(fā)酵果汁黃酮變化

2.3.4 龍葵果汁中活菌數(shù)的變化

由圖8可知，在最優(yōu)發(fā)酵條件下，龍葵果汁中嗜酸乳桿菌活菌數(shù)在0～22 h，從2.2×107CFU/mL增加到1.91×108CFU/mL，22～24 h時趨于穩(wěn)定，增加效果明顯。在0～4 h發(fā)酵果汁中活菌數(shù)從2.2×107CFU/mL增加至4.2×107CFU/mL，這與嗜酸乳桿菌開始活性不高、繁殖速度較慢有關，增加不明顯。在4～22 h發(fā)酵果汁中活菌數(shù)增加十分明顯，這與嗜酸乳桿菌活性增加、繁殖速度加快有關。

圖8 最優(yōu)發(fā)酵條件下龍葵發(fā)酵果汁活菌數(shù)變化

2.4 龍葵果汁抗氧化性研究

從圖9中得到，未發(fā)酵龍葵果汁與最優(yōu)條件下發(fā)酵龍葵果汁羥自由基清除率分別為21.2%和54.5%，龍葵果發(fā)酵后羥自由基清除率提高33.3%，差異顯著(P<0.05)。未發(fā)酵龍葵果汁與最優(yōu)條件下發(fā)酵龍葵果汁超氧陰離子自由基清除率分別為18.6%和51.65%，差異顯著(P<0.05)，龍葵果發(fā)酵后超氧陰離子自由基清除率提高33.1%，與發(fā)酵龍葵果汁富含嗜酸乳桿菌，代謝增強和具有良好抗氧化性的酚類和黃酮物質(zhì)有關[16]。

圖9 發(fā)酵龍葵果汁中自由基清除能力

3 結 論

經(jīng)過龍葵果汁發(fā)酵單因素實驗和響應面分析表明最佳發(fā)酵工藝條件為：嗜酸乳桿菌接種量1.5%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間22 h，可溶性固形物含量13%。發(fā)酵后果汁中嗜酸乳桿菌活菌數(shù)為1.94×108CFU/mL，感官評分為97分。未發(fā)酵龍葵果汁與最優(yōu)條件下發(fā)酵龍葵果汁羥自由基清除率分別為21.2%和54.5%、超氧陰離子自由基清除率分別為18.6%和51.65%，發(fā)酵后果汁抗氧化性顯著提高，發(fā)酵改善果汁效果良好。此外，發(fā)酵后龍葵果汁總酚含量達到1.26 μg/mL，黃酮含量達到1.57 mg/g。實驗結果表明龍葵果汁接種乳酸菌發(fā)酵后活性成分含量和抗氧化性得到改善。