一株產(chǎn)紅色素沙雷氏菌基因表達(dá)譜差異分析

李靖宇， 張肖沖， 李艷楠， 袁存霞， 劉建利， 金 多， 馬志山

(1. 北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 銀川750021；2. 寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 銀川750021)

腸桿菌科沙雷氏菌屬(Serratia)細(xì)菌菌體為球狀或短桿狀，革蘭氏染色陰性，無莢膜，有鞭毛，具有運(yùn)動性，兼性厭氧菌，能產(chǎn)生多種胞外產(chǎn)物，包括脂肪酶、幾丁質(zhì)酶、核酸酶、蛋白酶和各種抗菌次級代謝產(chǎn)物，這些細(xì)菌廣泛分布于土壤、沉積物、水、植物根系、動物表面及其胃腸道等環(huán)境中[1-3]。沙雷氏菌屬包含30個種和4個亞種，其中許多成員可產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，如普城沙雷氏菌(S.plymuthica)、紅色沙雷氏菌(S.rubidaea)、黏質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)和嗜線蟲沙雷氏菌(S.nemadiphila)可產(chǎn)生一種脂溶性紅色素，被鑒定為靈菌紅素，是一種具有獨(dú)特三吡咯化學(xué)結(jié)構(gòu)的生物堿次級代謝產(chǎn)物，在環(huán)境生物修復(fù)或制藥工業(yè)中有潛在的應(yīng)用價值[3-4]。與傳統(tǒng)的化學(xué)方法相比，利用黏質(zhì)沙雷氏菌生產(chǎn)靈菌紅素具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，近年來受到廣泛關(guān)注。然而，通過優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)，如培養(yǎng)基組成、pH值、溫度以及培養(yǎng)周期以提高其天然菌株靈菌紅素的產(chǎn)量用于商業(yè)目的仍是一個挑戰(zhàn)[5]。研究表明黏質(zhì)沙雷氏菌在28 ℃時能有效產(chǎn)生靈菌紅素，在37 ℃或更高溫度時急劇減少，充分說明靈菌紅素的產(chǎn)生和溫度有關(guān)[6]。沙雷氏菌屬靈菌紅素的生物合成依賴于pigA-N或pigA-O組成的pig基因簇，同時受到群體感應(yīng)(Quorum sensing)的調(diào)控[3,7]。

群體感應(yīng)是一種基因調(diào)控系統(tǒng)，它是隨著種群密度的增加而受到激活[7]。在許多菌株中，色素的產(chǎn)生被群體感應(yīng)所激活，而這種調(diào)節(jié)越來越被認(rèn)為會對整體的細(xì)胞代謝產(chǎn)生重要影響[8]。由沙雷氏菌菌株產(chǎn)生的許多活性代謝物受到群體感應(yīng)的調(diào)控，包括丁二醇發(fā)酵、胞外酶的產(chǎn)生、核酸酶，以及次級代謝產(chǎn)物，如生物表面活性劑、碳青霉烯、oocydin A和靈菌紅素。此外，一系列重要的過程，如生物發(fā)光、運(yùn)動性、產(chǎn)孢、毒力和生物膜的形成，也受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控[3]。以往的研究主要集中在群體感應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，以確定在靈菌紅素產(chǎn)生中起重要作用的調(diào)節(jié)機(jī)制[6]。本文以一株產(chǎn)紅色素沙雷氏菌為研究對象，在28 ℃能有效產(chǎn)生靈菌紅素，對該溫度條件下不同生長階段該菌的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測序分析，以期在轉(zhuǎn)錄組水平下探究產(chǎn)紅色素沙雷氏菌的產(chǎn)色素相關(guān)基因表達(dá)譜差異。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

產(chǎn)紅色素沙雷氏菌(Serratiasp. L1) 菌株由本實(shí)驗(yàn)室從北方民族大學(xué)校園土壤中分離所得。

LB固體培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，瓊脂15.0 g/L加蒸餾水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min 后備用(液體培養(yǎng)基不含瓊脂)。

1.2 生長曲線的測定

Serratiasp. L1菌株液體培養(yǎng)濃度達(dá)到OD600約1.070～1.122，按照1%接種量加入裝有250 mL液體LB培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中(5個重復(fù))，另外設(shè)置1個不加菌LB液體培養(yǎng)基作為對照，在28 ℃和150 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2 h在無菌條件下從錐形瓶中取5 mL培養(yǎng)液測定OD600值，取樣完畢后立即將錐形瓶放回氣浴恒溫振蕩器中繼續(xù)培養(yǎng)，每次測定時用對照進(jìn)行調(diào)零。用GraphPad Prism 5繪制生長曲線圖。

1.3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將液體培養(yǎng)菌株涂布于LB固體培養(yǎng)基上，在28 ℃條件下過夜培養(yǎng)，刮取適量菌種于無菌離心管中，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行菌種鑒定。16S rDNA PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：1.6 μL 2.5 mmoI/L dNTPs，1 μL 5 μmol/L 27F引物(5′-AGAGTTTGATCCT-GGCTCAG-3′)，1 μL 5 μmol/L 1492R引物(5′- GGT-TACCTTGTTACGACTT -3′)，2.0 μL 10 × ExTaq緩沖液，0.5 μL模板以及 0.2 μL 5 U ExTaq，最后加ddH2O到20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。電泳條件：1%瓊脂糖凝膠，120 V 電壓電泳30 min。16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物使用ABI 3730XL基因測序儀進(jìn)行雙末端測序，根據(jù)abi測序峰圖文件，手工去除兩端低質(zhì)量堿基序列，使用Seqman拼接兩條序列，將拼接的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast比對，選擇相似性高的序列與本研究序列保存為fasta格式文件，用MEGA-X做Maximum parsimony系統(tǒng)發(fā)育樹(參數(shù)設(shè)置：Bootstrp method為999)。序列NCBI登錄號：MT434357。

1.4 Serratia sp. L1不同生長階段總RNA提取

取固體培養(yǎng)基上生長5 h的Serratiasp. L1菌體作為不產(chǎn)色素階段的代表樣品，3個重復(fù)分別記為Sam_1、Sam_2和Sam_3，取培養(yǎng)24 h的菌體作為產(chǎn)色素階段的代表樣品，3個重復(fù)分別記為Sam_4、Sam_5和Sam_6。收集菌體時，在無菌操作條件下用無菌水分別將2個培養(yǎng)時間點(diǎn)的固體平板培養(yǎng)基表面的菌體收集于1.5 mL離心管中，6 000 r/min離心10 min。收集的菌體立即放入液氮罐低溫處理30 min后，置于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)總RNA的提取。

按照TRIzol?試劑使用說明書(Invitrogen)，從菌體樣品中提取總RNA，使用DNase I (TaKara)去除基因組DNA。用Agilent2100生物分析儀測定RNA質(zhì)量，使用ND-2000(NanoDrop Technologies)進(jìn)行定量。高質(zhì)量的RNA樣品(OD260/280=1.8～2.0、OD260/230≥2.0、RIN≥6.5、23S∶16S≥1.0、總量≥100 ng/μL、濃度≥2 μg)用于后續(xù)的建庫(表1)。

1.5 構(gòu)建cDNA文庫與Illumina Hiseq測序

使用Illumina(San Diego，CA)的TruSeqTM RNA sample preparation Kit進(jìn)行RNA文庫構(gòu)建。使用Ribo-Zero Magnetic kit (epicenter)去除rRNA，將mRNA隨機(jī)斷裂成200 bp左右的小片段，以mRNA為模板，利用隨機(jī)引物和SuperScript double-stranded cDNA synthesis kit(Invitrogen，CA)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。在合成cDNA第二鏈時，用dUTP代替dTTP進(jìn)行合成，合成的雙鏈cDNA加入End Repair Mix將其補(bǔ)成平末端，5′端磷酸化，3′末端加上一個A堿基，連接Y字形測序接頭。然后用UNG酶消除含有dUTP的cDNA第二鏈，從而使文庫中只包含cDNA的第一鏈。然后用Phusion DNA polymerase(NEB)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增15個循環(huán)。TBS380(Picogreen)定量后，使用Illumina HiSeq X Ten(2×150 bp)進(jìn)行RNA-seq雙端測序。

1.6 Illumina Hiseq測序數(shù)據(jù)處理與分析

Illumina測序數(shù)據(jù)使用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司(Shanghai Majorbio Biopharm Technology Co.,Ltd)云平臺(www.majorbio.com)進(jìn)行分析。首先對Illumina Hiseq測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和剪切，具體步驟如下：(1)去除 reads 中的adapter 序列；(2) 剪切去除5′端含有非A、G、C、T的堿基；(3) 剪掉reads末端測序質(zhì)量低于Q20的堿基；(4)去除含N的比例達(dá)到10%的reads；(5) 舍棄去除adapter 及質(zhì)量修剪后長度小于25 bp的序列。使用Bowtie(http:∥bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml)軟件基于Burrows-Wheeler方法對得到的高質(zhì)量reads與Serratiamarcescens(https:∥www.ncbi.nlm. nih.gov/ genome/?term=Serratia+marcescens)參考基因組進(jìn)行比對，通過對字符串轉(zhuǎn)換后得到的字符矩陣進(jìn)行排序和變換來建立索引，將序列比對到參考基因組上，使用默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行比對，獲得用于后續(xù)分析的mapped reads，同時對比對結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評估。將參考基因組與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，進(jìn)行基礎(chǔ)功能注釋，得到相應(yīng)的功能注釋信息。利用軟件RSEM (http:∥deweylab.github.io/RSEM/)對基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，定量指標(biāo)為每百萬讀段中來自于某轉(zhuǎn)錄本的讀段數(shù)，即Transcripts Per Million reads(TPM)。TPM的均一化過程使得不同樣本中的總表達(dá)量一致，這樣可以更直觀地進(jìn)行基因間表達(dá)量的比較。然后使用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq2 (http:∥bioconductor. org/packages/stats/bioc/DESeq2/)軟件對原始計(jì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得組間表達(dá)差異基因，默認(rèn)參數(shù)：P-adjust<0.05和|log2FC|≥2?；诖耍瑯?gòu)建產(chǎn)色階段顯著上調(diào)基因集和顯著下調(diào)基因集，并通過KEGG數(shù)據(jù)庫對基因集中的基因進(jìn)行功能分類注釋，同時對基因集中的基因進(jìn)行KEGG Pathway富集分析，當(dāng)校正的P值(P-adjust)<0.05時，認(rèn)為此KEGG Pathway功能存在顯著富集情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)紅色素沙雷氏菌菌株鑒定、進(jìn)化樹構(gòu)建和生長曲線繪制

結(jié)果表明該菌在28 ℃培養(yǎng)5 h的條件下沒有產(chǎn)生色素[圖1(a)]，培養(yǎng)24 h可在固體培養(yǎng)基形成產(chǎn)色素菌落[圖1(b)]，而溫度提高到37 ℃后在固體培養(yǎng)基上不形成產(chǎn)色素菌落。在實(shí)驗(yàn)室液體培養(yǎng)條件下，28 ℃時會產(chǎn)生色素，但產(chǎn)色素不明顯。其生長曲線見圖1(c)，基于生長曲線對數(shù)期和穩(wěn)定期為后續(xù)分析該菌不同生長階段，即不產(chǎn)色素和產(chǎn)色素，提供了取樣時間參考。

(a)培養(yǎng)5 h；(b)培養(yǎng)24 h；(c)生長曲線。圖1 Serratia sp. L1在28 ℃條件下菌落形態(tài)特征和生長曲線Figure 1 Morphological characteristics of colonies and growth curve of Serratia sp. L1 at 28 ℃

根據(jù)16S rDNA序列分析結(jié)果表明該菌與Serratiamarcescens相似性高達(dá)99%。通過對相似序列構(gòu)建Maximum parsimony系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示菌株L1與Serratiamarcescens其他菌株聚類在一起(圖2)。

圖2 基于16S rDNA產(chǎn)紅色素Serratia sp. L1的Maximam Parsimony進(jìn)化樹Figure 2 The Maximam Parsimony phylogenetic tree of Serratia sp. L1 producing red pigment based on 16S rDNA

2.2 Serratia sp. L1菌株不同生長階段轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

為探究Serratiasp. L1菌株不同生長階段基因表達(dá)譜差異特征，選取28 ℃條件下固體培養(yǎng)5 h菌體作為不產(chǎn)色素階段的代表樣品，24 h菌體為產(chǎn)色素階段的代表樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。不產(chǎn)色素和產(chǎn)色素階段轉(zhuǎn)錄組分別平均獲得40 386 475和38 944 075條原始reads。質(zhì)控后分別平均獲得40 000 741和38 081 085條高質(zhì)量reads。與參考基因組比對后，不產(chǎn)色素和產(chǎn)色素階段匹配上的reads數(shù)在clean reads中的平均百分比分別為90.66%和96.32%，CDS注釋平均百分比分別為85.36%和90.94%，見表2。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的PCA分析可知，第一軸(PC1)可解釋91.99 %的組間差異，說明不產(chǎn)色素和產(chǎn)色素兩個階段的重復(fù)取樣具有代表性，見圖3(a)。在此前提下，分析了Serratiasp. L1菌株不同生長階段基因表達(dá)譜差異特征，共獲得顯著差異基因2 512個，其中，上調(diào)基因1 317個，下調(diào)基因1 195個，見圖3(b)。

圖3 基于Serratia sp. L1不同生長階段轉(zhuǎn)錄組的PCA分析(a)和差異基因表達(dá)譜(b)Figure 3 PCA analysis (a) and differential gene expression profile (b) based on transcriptome of Serratia sp. L1 at different growth stages

2.3 Serratia sp. L1菌株不同生長階段差異基因表達(dá)譜KEGG注釋分析

基于Serratiasp. L1菌株不同生長階段差異基因集，對其進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫注釋。結(jié)果(圖4)表明：差異基因集中有141個基因?qū)儆诎被岽x途徑；有13個基因?qū)儆谄渌渭壌x產(chǎn)物生物合成途徑；有178個基因?qū)儆谔妓衔锎x途徑；有95個基因?qū)儆谀芰看x途徑；有36個基因?qū)儆诰厶巧锖铣珊痛x途徑；有100個基因?qū)儆诰S生素和輔因子代謝途徑；有42個基因?qū)儆谄渌被岽x途徑；有23個基因?qū)儆谳祁惡途弁衔锎x途徑；有54個基因?qū)儆诤塑账岽x途徑；有17個基因?qū)儆诋惿锼厣锝到夂痛x途徑。在差異基因集中，功能分類屬于遺傳信息處理、環(huán)境信息處理以及細(xì)胞過程的基因變化情況(圖4)。

圖4 基于Serratia sp. L1產(chǎn)色素階段和不產(chǎn)色素階段差異基因集的KEGG代謝通路注釋Figure 4 KEGG metabolic pathway annotation based on differential gene set of Serratia sp. L1 between pigment producing stage and non-pigment producing stage

2.4 Serratia sp. L1菌株不同生長階段差異基因表達(dá)譜KEGG功能富集分析

基于Serratiasp. L1菌株產(chǎn)色素階段顯著下調(diào)基因集進(jìn)行KEGG Pathway富集分析，結(jié)果表明參與核糖體、鞭毛組裝、TCA循環(huán)、肽聚糖生物合成、氨酰tRNA生物合成、原核生物碳固定、陽離子抗菌肽耐藥性、細(xì)菌趨化性、細(xì)菌分泌系統(tǒng)、氧化磷酸化以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等基因存在顯著功能富集趨勢(圖5、表3)?；赟erratiasp. L1菌株產(chǎn)色素階段顯著上調(diào)基因集進(jìn)行KEGG Pathway富集分析，結(jié)果表明參與群體感應(yīng)的基因存在功能顯著富集趨勢(圖6、表3)。其中，一些與群體感應(yīng)相關(guān)的基因注釋信息見表4。雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)組氨酸激酶NarX和NarQ來感知硝酸鹽/亞硝酸鹽的含量，并將響應(yīng)調(diào)節(jié)子NarL磷酸化，從而影響硝酸鹽還原酶的表達(dá)(圖7)，這些基因的高表達(dá)表明沙雷氏菌L1生長后期局部環(huán)境中硝酸鹽的含量可能會顯著增加。然而，菌株之間對營養(yǎng)物質(zhì)的需求受到局部環(huán)境可利用氮的限制，該菌生長后期感知外界環(huán)境低氮可利用性的GlnL組氨酸激酶以及響應(yīng)調(diào)節(jié)子NarG表達(dá)量顯著下降，導(dǎo)致參與硝酸鹽同化的谷氨酰胺合成酶基因產(chǎn)物GlnA表達(dá)量顯著下降(圖7)，說明該菌生長后期局部環(huán)境中氮源供應(yīng)不足。

*** 表示P<0.001，** 表示P<0.01，* 表示P<0.05。圖5 基于Serratia sp. L1產(chǎn)色素階段顯著下調(diào)基因集對基因進(jìn)行KEGG pathway富集分析Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis based on the significantly down regulated gene set of Serratia sp. L1 during the pigment production stage

*** 表示P<0.001，** 表示P<0.01，* 表示P<0.05。圖6 基于Serratia sp. L1產(chǎn)色素階段顯著上調(diào)基因集對基因進(jìn)行KEGG pathway富集分析Figure 6 KEGG pathway enrichment analysis based on the significantly up regulated gene set of Serratia sp. L1 during the pigment production stage

圖7 Serratia sp. L1產(chǎn)色素階段雙組分系統(tǒng)顯著變化相關(guān)基因Figure 7 Genes related to significant changes in two component system of Serratia sp.L1 during pigment production

3 討論與結(jié)論

Serratiasp. L1菌株能夠在28 ℃固體培養(yǎng)基上生長產(chǎn)生紅色色素，此過程受到溫度的調(diào)控，同時也受到群體感應(yīng)的調(diào)控。靈菌紅素的生產(chǎn)受到一系列環(huán)境信號的調(diào)節(jié)，如溫度、磷酸鹽限制和培養(yǎng)基成分[9]。群體感應(yīng)是一種常見的調(diào)節(jié)細(xì)菌生理過程的機(jī)制，通過感知種群密度來控制各種生物功能，包括毒力因子的表達(dá)、次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、共生、生物膜的形成、生物發(fā)光、胞外多糖水平、抗生素產(chǎn)生、群集運(yùn)動、細(xì)胞代謝、細(xì)胞表面電動特性、結(jié)合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移、個體的生存策略以及對變化環(huán)境的適應(yīng)[10-11]。在其生長后期，固體培養(yǎng)基上的菌落局部環(huán)境變得不利于菌株生長，外界環(huán)境的改變刺激菌株高表達(dá)雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)以及群體感應(yīng)系統(tǒng)的相關(guān)基因，如qseB、qseC、glrK、sdiA、lsrK、expR等(表4)。在沙雷氏菌中，已經(jīng)描述了許多不同的LuxIR型系統(tǒng)，包括SwrIR(SerratialiquefaciensMG1)、SmaIR(Serratiasp. ATCC 39006)、SprIR (Serratiaproteamaculans)和SpnIR(SerratiamarcescensSS-1)[10]。在這些系統(tǒng)中，LuxI同源物是一種自誘導(dǎo)物合成酶，它催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)與酰基載體蛋白(ACP)之間的反應(yīng)，從而產(chǎn)生自由擴(kuò)散的?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)作為自誘導(dǎo)物(AI)[12]。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)是由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的一種群體感應(yīng)信號分子。LuxI蛋白家族合成AHL、LuxR蛋白家族結(jié)合AHL并調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)，這些基因負(fù)責(zé)生物發(fā)光、色素或抗生素的產(chǎn)生等[9]。研究表明AHL自誘導(dǎo)物在高含量條件下會與同源細(xì)胞質(zhì)LuxR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合激活luxI表達(dá)。當(dāng)不被AI結(jié)合時，LuxR蛋白質(zhì)會迅速降解[12]。本研究中沙雷氏菌L1在產(chǎn)色素階段高表達(dá)自誘導(dǎo)物AI-2激酶lsrK，同時也高表達(dá)LuxR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子sdiA說明該菌在產(chǎn)生色素階段啟動了LuxIR型群體感應(yīng)系統(tǒng)。這些基因的改變會影響沙雷氏菌整體細(xì)胞過程中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平，特別是涉及能量代謝三羧酸循環(huán)的一些關(guān)鍵基因表達(dá)下調(diào)，如檸檬酸合成酶基因(gltA)、NADP依賴性異檸檬酸脫氫酶基因(icd)、2-酮戊二酸脫氫酶E1組分基因(sucA)等，參與氧化磷酸化過程的電子鏈蛋白編碼基因顯著下調(diào)，如細(xì)胞色素C泛醌氧化酶(cyoB、cyoA、cyoC)、F0F1 ATP合酶(atpB、atpA、atpF、atpD、atpH、atpC、atpG)、NADH醌氧化還原酶(nuoL、nuoM、nuoE、nuoF、nuoG、nuoH、nuoN)、琥珀酸脫氫酶(sdhC、sdhA、sdhB、sdhD)等。

綜上所述，該菌能夠在固體培養(yǎng)條件下受溫度調(diào)控產(chǎn)生色素，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明產(chǎn)色素過程同時受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。然而，具體如何調(diào)節(jié)有待開展進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。