棉花GhVTC2基因促進(jìn)煙草BY2懸浮細(xì)胞和擬南芥主根伸長(zhǎng)

董祥雨， 陳麗華， 涂澤行， 曹愛(ài)萍,2,3， 王 斐,2,3， 李鴻彬,2,3

(1. 石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 石河子832003； 2. 綠洲城鎮(zhèn)與山盆系統(tǒng)生態(tài)兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 石河子832003； 3. 新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 石河子832003)

抗壞血酸(AsA)是植物中含量最豐富的抗氧化小分子物質(zhì)，與植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)密切相關(guān)[1]。AsA能夠調(diào)控植物種子萌發(fā)[2]、根系生長(zhǎng)[3]、開(kāi)花[4]、成熟[5]、衰老[6]、細(xì)胞延展和伸長(zhǎng)[7]等過(guò)程。在植物細(xì)胞中，D-Man/L-Gal途徑被認(rèn)為是植物AsA合成的主要途徑，該途徑中的許多酶已經(jīng)被鑒定。該途徑一些基因的突變?nèi)笔?dǎo)致AsA水平顯著降低，一些基因的過(guò)量表達(dá)顯著增加了AsA含量[8]。L-半乳糖磷酸化酶(又稱為VTC2)是D-Man/L-Gal途徑中的第二個(gè)關(guān)鍵酶，能夠催化L-半乳糖(L-Gal)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-半乳糖-1-磷酸(L-Gal-1-P)。擬南芥中編碼GDP-L-半乳糖磷酸化酶的兩個(gè)同源基因?yàn)閂TC2和VTC5，vtc2/vtc5雙突變體在沒(méi)有外源AsA的情況下不能正常生長(zhǎng)[9]。當(dāng)對(duì)水稻幼苗外源施加L-半乳糖后，地上部分AsA含量增加了5倍[10]。

棉纖維是由胚珠表皮的單細(xì)胞毛狀體發(fā)育而來(lái)，是紡織工業(yè)中的重要原材料，纖維長(zhǎng)度和比強(qiáng)度是纖維品質(zhì)的重要參數(shù)，決定著纖維品質(zhì)的優(yōu)劣及其在紡織工業(yè)中的利用價(jià)值[11]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)AsA的合成與代謝與纖維發(fā)育緊密相關(guān)。調(diào)控AsA生物合成的D-Man/L-Gal途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵基因VTC1基因[12]、參與AsA代謝的抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)[13]、抗壞血酸氧化的抗壞血酸氧化酶(AO)[14]、抗壞血酸再生的單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)[15]均與纖維伸長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。目前，D-Man/L-Gal途徑中的VTC2基因及其調(diào)控的AsA生物合成在棉花纖維發(fā)育中的功能和作用機(jī)制仍不清楚。

本研究從陸地棉中克隆獲得GhVTC2基因，研究其在棉花纖維發(fā)育及細(xì)胞伸長(zhǎng)過(guò)程中的功能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為深入研究VTC2基因的表達(dá)調(diào)控及其參與細(xì)胞發(fā)育的生物學(xué)功能提供理論參考，為利用基因工程技術(shù)培育出高品質(zhì)棉花奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

在試驗(yàn)田中種植陸地棉徐州142(X142)及其無(wú)長(zhǎng)絨無(wú)短絨突變體(Fuzzless-lintless，fl)，按照開(kāi)花后的不同時(shí)間收集纖維、胚珠等實(shí)驗(yàn)材料。煙草BY2懸浮細(xì)胞在含有30 g蔗糖、200 mg/L磷酸二氫鉀、0.2 mg/L 2,4-D、100 mg/L肌醇、1 mg/L硫胺和1 mg/L甘氨酸的固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，固體培養(yǎng)基中添加7.5 g/L瓊脂粉，pH值為5.8。將野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)和轉(zhuǎn)基因株系在22 ℃光/暗循環(huán)12 h的白色熒光燈下盆栽生長(zhǎng)。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆與植物過(guò)量表達(dá)載體構(gòu)建

用CTAB法從棉花葉片中提取總RNA。設(shè)計(jì)引物克隆GhVTC2基因的CDS序列(表1)。將PCR產(chǎn)物連接到pMD-19T載體中，通過(guò)測(cè)序分析證實(shí)載體構(gòu)建是否成功。雙酶切pMD-19T-GhVTC2后，將CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子調(diào)控的全長(zhǎng)cDNA克隆到pCAMBIA2300載體上，構(gòu)建35S:GhVTC2過(guò)量表達(dá)載體。

1.2.2 qRT-PCR表達(dá)分析

使用SYBR Green qPCR試劑盒(Takara)通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)對(duì)棉花基因表達(dá)模式進(jìn)行檢測(cè)。以GhUBQ7(GenBank登錄號(hào)：XM_016855110)作為參考基因，采用2-ΔΔCt法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.3煙草BY2轉(zhuǎn)基因懸浮細(xì)胞及其檢測(cè)

煙草BY2細(xì)胞懸浮液在改良的Linsmaier和Skoog(LS)培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長(zhǎng)，利用根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化。將鑒定后的1mL BY2懸浮細(xì)胞置于1.5mL EP管中，加入8μL5mg/L氟代吲哚乙酸(FDA)，避光染色10min，在熒光顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞長(zhǎng)度等表型觀察統(tǒng)計(jì)。

1.2.4AsA含量的測(cè)定

煙草BY2懸浮細(xì)胞和擬南芥根組織樣品在液氮中研磨成粉末，每次測(cè)定取約20mg樣品，用0.1mol/L HCl和1mmol/L EDTA勻漿混勻，4℃下12000r/min離心5min，用聯(lián)吡啶分光光度法在534nm處測(cè)定總AsA含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhVTC2基因的表達(dá)分析

從陸地棉中克隆獲得GhVTC2基因，該基因的開(kāi)放讀碼框序列為1 350 bp，編碼含有450個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，理論分子量為50.47 ku、理論等電點(diǎn)為5.14。采用qRT-PCR方法研究GhVTC2在不同組織和不同纖維發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，分別收集X142棉花開(kāi)花后0、3、5、10、15、20和25 d的纖維、10 d的無(wú)長(zhǎng)絨無(wú)短絨fl突變體胚珠，以及根、莖、葉等材料，檢測(cè)GhVTC2基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在不同的纖維發(fā)育時(shí)期中，GhVTC2基因在10 d的纖維材料中表達(dá)量達(dá)到頂峰，暗示其在纖維快速伸長(zhǎng)發(fā)育中的潛在重要作用。在不同組織中，GhVTC2基因在根中顯著累積，表明其可能對(duì)根的發(fā)育具有重要作用(圖1)。

采集0 d和3 d胚珠、5～25 d的纖維、10 d fl變體胚珠，以及棉花根、莖和葉進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。將10 d fl突變體胚珠的qRT-PCR數(shù)據(jù)人工設(shè)為1，以棉花GhUBQ7為內(nèi)參基因。圖1 GhVTC2基因的表達(dá)分析Figure 1 Expression analysis of GhVTC2 gene

2.2 GhVTC2促進(jìn)BY2懸浮細(xì)胞伸長(zhǎng)

為研究GhVTC2對(duì)煙草BY2懸浮細(xì)胞發(fā)育的影響，擴(kuò)增獲得GhVTC2基因[圖2(a)]，并構(gòu)建35S:GhVTC2載體[圖2(b)]，將經(jīng)鑒定后的載體遺傳轉(zhuǎn)化煙草BY2懸浮細(xì)胞，將鑒定后的轉(zhuǎn)基因株系和野生型細(xì)胞在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察分析[圖3(a)]。結(jié)果顯示：與野生型BY2懸浮細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)GhVTC2基因煙草懸浮細(xì)胞的長(zhǎng)度顯著增加，野生型BY2懸浮細(xì)胞長(zhǎng)度為(67.112±0.081)μm，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)GhVTC2基因煙草懸浮細(xì)胞的長(zhǎng)度為(89.980±0.239)μm，長(zhǎng)度增加了約34%[圖3(b)]。進(jìn)一步AsA含量測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞中的AsA含量顯著增加[圖3(c)]。這些結(jié)果表明GhVTC2基因可能通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)AsA的含量促進(jìn)煙草細(xì)胞的伸長(zhǎng)。

(a)GhVTC2基因PCR擴(kuò)增；(b)35S:GhVTC2過(guò)量表達(dá)載體雙酶切驗(yàn)證。圖2 35S:GhVTC2過(guò)量表達(dá)載體構(gòu)建Figure 2 Construction of overexpression vector 35S:GhVTC2

(a)野生型和轉(zhuǎn)基因煙草BY2懸浮細(xì)胞的表型分析；(b)野生型和轉(zhuǎn)基因煙草BY2懸浮細(xì)胞的測(cè)量與統(tǒng)計(jì)；(c)抗壞血酸含量測(cè)定。隨機(jī)選取生長(zhǎng)成熟的BY2細(xì)胞約500個(gè)，分別測(cè)量其長(zhǎng)和寬，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。* 表示P<0.05，*** 表示P<0.001。圖3 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)GhVTC2基因煙草懸浮細(xì)胞的表型分析Figure 3 Phenotype analysis of transgenic tobacco BY2 cells overexpressing GhVTC2

2.3 GhVTC2促進(jìn)擬南芥主根伸長(zhǎng)發(fā)育

GhVTC2在快速伸長(zhǎng)的纖維中顯著累積，且在根組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá)(圖1)，暗示其可能對(duì)植物根發(fā)育具有重要作用。將35S:GhVTC2遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥研究其對(duì)植物根發(fā)育的重要功能。選擇生長(zhǎng)10 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的根部進(jìn)行表型觀察，如圖4(a)所示，轉(zhuǎn)基因擬南芥的主根顯著伸長(zhǎng)。野生型擬南芥主根長(zhǎng)為(3.23±0.035)cm，轉(zhuǎn)基因擬南芥主根長(zhǎng)度為(3.75±0.064)cm[圖4(b)]，表明GhVTC2的過(guò)量表達(dá)顯著促進(jìn)擬南芥主根的伸長(zhǎng)發(fā)育。抗壞血酸含量檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥主根中的AsA含量顯著增加[圖4(c)]。結(jié)果表明，GhVTC2基因可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)AsA的累積進(jìn)而促進(jìn)擬南芥主根的伸長(zhǎng)發(fā)育。

(a)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型分析；(b)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥主根長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)分析；(c)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥主根中的AsA含量測(cè)定。** 表示P<0.01。圖4 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)GhVTC2基因擬南芥主根表型分析與統(tǒng)計(jì)Figure 4 Phenotype and statistics analysis of main roots of transgenic Arabidopsis plant lines overexpressing GhVTC2

2.4 GhVTC2啟動(dòng)子的克隆及其響應(yīng)乙烯處理的表達(dá)活性分析

為了深入研究GhVTC2基因的調(diào)控機(jī)制，克隆獲得該基因5′端上游2 461 bp的啟動(dòng)子序列PGhVTC2，該啟動(dòng)子包含多個(gè)順式作用元件，尤其是乙烯響應(yīng)元件ERE，暗示該基因的表達(dá)可能受到激素乙烯的調(diào)控。根據(jù)PGhVTC2所包含的ERE元件，按照?qǐng)D5 (a)所示的構(gòu)建示意圖，分別構(gòu)建包含ERE元件的P1(-2 464～-1)、P2(-1 820～-1)、P3(-1 336～-1)3個(gè)載體，及不包含ERE元件的P4(-868～-1)、P5(-416～-1)2個(gè)載體。將不同載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片并利用外源ACC處理，結(jié)果顯示，與非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照相比，轉(zhuǎn)化了含有ERE元件的啟動(dòng)子P-1336、P-1820、P-2464的轉(zhuǎn)基因煙草葉片在ACC處理后，表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)的活性[圖5 (b)]。進(jìn)一步將不同長(zhǎng)度的5′端缺失載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片，利用外源乙烯前體ACC處理分析不同啟動(dòng)子片段的活性。結(jié)果顯示，不同5′端缺失的啟動(dòng)子表現(xiàn)出不同驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)的活性，隨著啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度變短其活性呈逐漸降低的趨勢(shì)[圖5 (c)]。結(jié)果表明，GhVTC2的功能發(fā)揮可能受激素乙烯的調(diào)控。

(a)含有不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子序列的5′端缺失載體構(gòu)建示意圖；(b)ACC處理下不同的5′端缺失載體的表達(dá)活性分析；(c)含有不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子序列的5′端缺失載體的表達(dá)活性分析，啟動(dòng)子所包含的不同元件用不同顏色的實(shí)心方框表示。** 表示P<0.01，*** 表示P<0.001。圖5 GhVTC2的啟動(dòng)子活性分析Figure 5 Promoter activity analysis of GhVTC2

3 討論與結(jié)論

AsA在植物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分裂和增殖、響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。AsA的合成路徑中，VTC2是重要的關(guān)鍵酶，目前已在擬南芥[8]、番茄[16]、煙草[17]、大豆[18]等多種植物中鑒定分離出VTC2基因。通過(guò)轉(zhuǎn)基因研究表明在多個(gè)物種中過(guò)量表達(dá)VTC2基因可提高植物體內(nèi)抗壞血酸的含量。研究表明在擬南芥突變體中敲除GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GGPase)基因后AsA含量只有野生型的30%[19]。L-半乳糖途徑是合成AsA的主要途徑，VTC1和VTC2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控與AsA的積累量關(guān)系非常密切，如不施加外源AsA，vtc2/vtc5雙突變體就不能正常生長(zhǎng)[20]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，植物在逆境條件下可以調(diào)節(jié)AsA的含量和相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。在光照條件下，轉(zhuǎn)基因西紅柿葉片中AsA含量比遮陰條件下的AsA含量增加近2倍[18]，當(dāng)植物移至強(qiáng)光下，抗壞血酸合成相關(guān)基因VTC2的表達(dá)量和相對(duì)應(yīng)的GGPase酶活性極具增強(qiáng)[21]。萊茵衣藻細(xì)胞在氧脅迫下GGP轉(zhuǎn)錄水平和AsA含量都有所增加[22]。本研究從陸地棉中克隆獲得1個(gè)GhVTC2基因[圖2(a)]，其在纖維快速伸長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)，并在根組織中顯著累積(圖1)，表明其可能與根發(fā)育及細(xì)胞伸長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。

AsA可以通過(guò)一系列途徑促進(jìn)細(xì)胞的伸長(zhǎng)發(fā)育。抗壞血酸氧化酶主要分布在植物細(xì)胞壁中，尤其在迅速生長(zhǎng)的細(xì)胞中表達(dá)活性較高。細(xì)胞壁內(nèi)的抗壞血酸和脫氫抗壞血酸(DHA)通過(guò)影響蛋白和多糖的交聯(lián)互通從而使細(xì)胞壁疏松。脫氫抗壞血酸可以轉(zhuǎn)變成細(xì)胞壁草酸鹽，后者與Ca2+結(jié)合形成的結(jié)合體可間接調(diào)節(jié)細(xì)胞壁Ca2+的水平[23]。植物體內(nèi)抗壞血酸和過(guò)氧化氫的平衡可以影響木質(zhì)素單體的聚合作用進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的木質(zhì)化過(guò)程。AsA可以通過(guò)影響細(xì)胞周期和細(xì)胞伸長(zhǎng)來(lái)影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，在細(xì)胞周期的G1期至S期參與細(xì)胞壁代謝和細(xì)胞膨大[24]。AsA在植物根端區(qū)代謝較活躍區(qū)域的積累量高，研究發(fā)現(xiàn)AsA可以通過(guò)抑制細(xì)胞壁木質(zhì)化或增強(qiáng)根細(xì)胞的新陳代謝能力這兩種方式來(lái)調(diào)節(jié)根系的生長(zhǎng)[25]。另外，外源添加2 mmol/L AsA能降低丙二醛含量，增加可溶性蛋白含量，促使BY2煙草懸浮細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)速度進(jìn)一步增強(qiáng)[26]，這些結(jié)果說(shuō)明AsA在促進(jìn)植物細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)以及調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育方面起著重要的作用。本研究中，過(guò)量表達(dá)GhVTC2基因顯著促進(jìn)煙草BY2懸浮細(xì)胞的伸長(zhǎng)發(fā)育和擬南芥主根的伸長(zhǎng)(圖3、4)，且轉(zhuǎn)基因煙草懸浮細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因擬南芥根中的AsA顯著增加，表明GhVTC2可能通過(guò)提升細(xì)胞內(nèi)AsA的含量進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)發(fā)育。

AsA作為細(xì)胞內(nèi)的抗氧化小分子物質(zhì)，其功能的發(fā)揮受到多種植物激素的調(diào)控。乙烯與AsA的合成及代謝緊密相關(guān)。ABA不敏感4(ABI4)通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制擬南芥中的ACS介導(dǎo)AsA調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)和乙烯產(chǎn)生[27]。AsA是植物細(xì)胞中主要的氧化還原緩沖液。在兩個(gè)獨(dú)立的AsA缺失擬南芥突變體(vtc2-1和vtc2-4)中，AsA生物合成基因GDP-L-半乳糖磷酸化酶產(chǎn)生的乙烯量比野生型植物高。AsA缺乏改變植物的激素信號(hào)傳導(dǎo)與乙烯氧化還原之間的相互作用，提供一個(gè)控制生物量積累的調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)[28]。乙烯在鹽脅迫反應(yīng)中起著重要作用。越來(lái)越多的研究表明乙烯通過(guò)活性氧(ROS)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)耐鹽性。AsA是一種非酶抗氧化劑，有助ROS清除和耐鹽性[29]。Ca2+信號(hào)作為第二信使，可由ROS和AsA介導(dǎo)的ROS平衡誘導(dǎo)，并參與AsA生物合成調(diào)節(jié)。乙烯對(duì)鹽脅迫下ROS合成和清除的拮抗作用是由于ROS在不同發(fā)育階段和不同組織中的作用不同[30]。另外研究發(fā)現(xiàn)乙烯生物合成抑制劑的應(yīng)用導(dǎo)致了鎘暴露的枸杞中GSH的低積累，并且在轉(zhuǎn)基因煙草中過(guò)度表達(dá)其乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(ERF)基因增強(qiáng)GSH生物合成基因的表達(dá)并減少了ROS的產(chǎn)生，從而賦予鎘耐受性[31]。GhVTC2基因的啟動(dòng)子中包含多個(gè)乙烯響應(yīng)元件ERE，且包含有ERE的啟動(dòng)子顯著受到外源乙烯前體的誘導(dǎo)表達(dá) (圖5)，表明VTC2功能的發(fā)揮與乙烯之間的密切聯(lián)系。VTC2與乙烯及ROS之間是否存在互作及可能的調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

本研究克隆獲得一個(gè)在纖維快速伸長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)的GhVTC2基因，該基因能夠通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)AsA的累積及響應(yīng)乙烯信號(hào)進(jìn)而促進(jìn)煙草BY2懸浮細(xì)胞和擬南芥主根的伸長(zhǎng)發(fā)育。研究結(jié)果為解析VTC2基因的功能及調(diào)控的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。