粒毛盤菌多糖在不同消化階段的生物活性

張鑫淼， 何雅玲， 葉 明

(合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院， 合肥230009)

真菌多糖是一類天然高分子碳水化合物，主要存在于發(fā)酵液、菌絲體及子實體中，因其所具有的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等一系列顯著的藥理學活性，在食品、藥品等領(lǐng)域有較好的應(yīng)用潛能[1-2]。多糖的生物活性很大程度上取決于其理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特性，但胃腸消化的復雜環(huán)境如pH、溫度、酶等都可能對活性結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響。因此，確定多糖在胃腸道消化過程中的變化對準確評估其生物活性和生物可及性具有重要意義[3]。

近年來，關(guān)于多糖消化特性的研究引起國內(nèi)外研究人員廣泛的關(guān)注[4]。消化是人體代謝吸收的重要生理過程，它能將生物大分子轉(zhuǎn)化為能被機體吸收的小分子物質(zhì)，進而通過代謝發(fā)揮功能。然而，體內(nèi)試驗由于技術(shù)難度大，成本昂貴和倫理限制等難以進行。靜態(tài)體外消化模型是通過模擬真實生理消化條件預(yù)測食物或藥物在體內(nèi)的變化及生物可及性的有效方法[5]，因其高效、經(jīng)濟、安全等顯著優(yōu)勢逐漸應(yīng)用于多糖消化特性的評估。

粒毛盤菌(Lachnum)屬于晶杯菌科(Hyaloscyphaceae)，是腐生類的高等真菌，其物種豐富，深層發(fā)酵可以產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物[6]。近年來，研究主要從不同種粒毛盤菌的發(fā)酵液中提取得到多糖，對其結(jié)構(gòu)、生物活性等進行表征及探究。研究表明，粒毛盤菌多糖具有抗氧化[7]、抗腫瘤[8]、肝保護[9]等多種重要的生物活性，有較好的研究開發(fā)前景。然而，粒毛盤菌多糖在模擬唾液及胃腸道消化條件下的消化特性、生物活性變化尚未有相關(guān)報道。

研究通過體外消化模型在接近真實生理消化條件下探究粒毛盤菌多糖的消化特性，如分子質(zhì)量、還原糖、微觀結(jié)構(gòu)等變化，并探究其在消化過程中抗氧化活性的變化及其對脂解的影響，為粒毛盤菌多糖體內(nèi)消化吸收的探究提供理論基礎(chǔ)，有助于其在功能食品添加劑方面的開發(fā)應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材料

粒毛盤菌(Lachnum)YM40菌株子實體分離自黃山(安徽，中國)，保藏在合肥工業(yè)大學微生物資源與應(yīng)用實驗室。DEAE Cellulose-52購自合肥博美生物；Sephadex G-100購自北京索萊寶科技有限公司；單糖標品、葡聚糖標品購自美國Sigma公司；3，5-二硝基水楊酸(DNS)、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS+)、胰酶(來自豬胰腺)購自阿拉丁科技有限公司；胃蛋白酶購自德國BioFroxx公司；研究中使用的所有其他試劑均為分析純級試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-10A高效液相色譜儀(配有RI-502示差檢測器和BRT105-104-102串聯(lián)凝膠柱)，日本島津公司生產(chǎn)；ICS5000+離子色譜儀和6700傅里葉紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)；723N(PC)可見分光光度計，上海悅豐儀器儀表有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 粒毛盤菌多糖的提取純化

粒毛盤菌多糖的提取純化參考文獻[6]。粒毛盤菌發(fā)酵液經(jīng)抽濾、減壓濃縮后醇沉。沉淀復溶后用Sevage法除蛋白、H2O2脫色、透析、冷凍干燥即得粗多糖LEP。將LEP溶液以0.1 mol/L NaCl作為洗脫液用DEAE Cellulose-52柱(2.6 cm×40 cm)洗脫得LEP-2。用Sephadex G-100柱(1.5 cm×60 cm)對LEP-2進一步純化得到主要組分，冷凍干燥得純多糖LEP-2a。

1.3.2 LEP-2a的體外模擬消化

(1)唾液對LEP-2a的消化作用。唾液由4名20～30歲的健康志愿者提供[10]。收集的唾液在6 400 r/min下離心10 min得上清液。將LEP-2a溶液(4 mg/mL)與人唾液，唾液與蒸餾水分別按照1∶1混合，37 ℃水浴中孵育消化。分別在5、30、60 min取樣，采用沸水浴滅酶5 min。調(diào)整消化液的pH值為7，然后9 700 r/min離心10 min取上清液。取唾液消化60 min的樣品透析后冷凍干燥，命名為LEP-2aG。

(2)模擬胃液對LEP-2a的消化作用。模擬胃液的配置參考文獻[11]。配制2 L胃液電解質(zhì)溶液，包含2.2 g KCl，6.2 g NaCl，0.3 g CaCl2·2H2O和1.2 g NaHCO3。取1 500 g胃電解質(zhì)溶液加入400 mg胃蛋白酶及3 mL CH3COONa溶液(1 mol/L，pH 5)，0.1 mol/L HCl將其pH值調(diào)至3得到配制的胃液。將模擬胃液與 LEP-2a溶液(4 mg/mL)，蒸餾水與模擬胃液分別以1∶1的比例混合，37 ℃水浴振蕩。消化期間保持pH值為2.5。分別在5、30、60、120、180、240 min時取樣。取胃液消化240 min的樣品命名為LEP-2aS。樣品處理方法與(1)相同。

(3)模擬腸液對LEP-2a消化作用。模擬腸液的配置參考文獻[11]。1 L腸電解質(zhì)溶液包含0.65 g KCl，5.4 g NaCl和0.33 g CaCl2·2H2O。取500 g腸電解質(zhì)溶液加入500 g胰酶溶液(質(zhì)量分數(shù)為7%)、1 000 g膽酸鹽溶液(質(zhì)量分數(shù)為4%)和0.13 g胰蛋白酶，充分攪拌混勻之后，用NaOH (0.1 mol/L) 調(diào)pH值為7.0。將LEP-2a、蒸餾水模擬胃液消化得到的混合物用NaOH調(diào)整pH值為7后，分別與模擬腸液以10∶3的比例混合，37 ℃水浴中孵育。消化期間，保持反應(yīng)溶液pH值為7.0。分別在消化的5、30、60、120、180、240 min時取樣。腸液消化240 min的樣品命名為LEP-2aI。樣品處理方法與(1)相同。

1.3.3 LEP-2a及其消化過程中理化性質(zhì)分析

(1)主要化學成分分析?？偺堑暮坎捎帽椒?硫酸法[12]測定。Bradford法[13]測定蛋白質(zhì)含量。糖醛酸含量用間羥基聯(lián)苯法[14]測得。單糖組成參考文獻[15]對樣品處理并通過賽默飛ICS-5000+ HPIC高壓離子色譜色譜系統(tǒng)測定。

(2)分子量測定。在島津LC-10A高效液相色譜上采用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)法[16]測定多糖分子量。柱溫保持在40 ℃，以0.05 mol/L NaCl為流動相，流速為0.6 mL/min，樣品進樣量為20 μL。根據(jù)葡聚糖標品的校正曲線計算樣品分子量。

(3)模擬消化過程中還原糖含量測定。分別取1.3.2節(jié)唾液、胃液、腸液不同階段的消化樣品的上清液，用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法[17]測定還原糖含量。取0.5 mL DNS溶液加入0.5 mL樣品溶液中搖勻，沸水浴5 min，冷卻后加入4 mL蒸餾水，測定540 nm處的吸光度。以蒸餾水替代多糖在不同階段的消化液作參比溶液。還原糖標準曲線以葡萄糖為標品按照上述方法測得。根據(jù)不同階段消化液中LEP-2a含量計算相對還原糖含量(%)。

(4)形態(tài)特性。用原子力顯微鏡(AFM)觀察多糖組分的微觀構(gòu)象。取5 μL完全溶解的樣品溶液(20 μg/mL)滴在新切割的云母表面并在室溫下干燥。采用輕敲模式獲得AFM 圖像[18]。

1.3.4 模擬消化過程中LEP-2a抗氧化活性

根據(jù)前人報道的方法測定多糖體外模擬消化過程中對DPPH[19]和ABTS+[20]自由基的清除活性及其還原能力[21]變化。分別以不同消化階段的消化液作為參比溶液以消除消化液自身抗氧化活性的影響。

1.3.5 模擬消化條件下LEP-2a對脂質(zhì)分解的影響

用參考文獻[22]的方法，將20%的玉米油、吐溫80溶液(質(zhì)量分數(shù)為2.5%)與不同含量的多糖溶液混合，高速均質(zhì)制備多糖-脂質(zhì)乳液(0.5%、1.0%)。同時，以去離子水代替多糖溶液作空白對照。體外模擬消化模型測定多糖對消化脂解的影響。胃液和腸液的制備及對多糖-脂質(zhì)乳液的體外模擬消化過程均采用1.3.2所述方法實施。其中，模擬胃和腸消化均為100 r/min連續(xù)攪拌2 h。反應(yīng)過程中監(jiān)測并維持唾液消化時恒定pH 6.8、胃消化時pH 2.5和腸消化時pH 7.0所需的NaOH溶液的量。根據(jù)NaOH的消耗量計算反應(yīng)過程中游離脂肪酸(FFA)的釋放量：

其中：VNaOH表示NaOH消耗的體積；CNaOH表示NaOH的濃度，即0.1 mol/L；MWlipid表示玉米油的平均分子質(zhì)量，即872 g/mol；Wlipid表示反應(yīng)液中玉米油的質(zhì)量。

1.3.6 統(tǒng)計學分析

所有實驗重復3次，數(shù)據(jù)表示方式：平均值±標準差。采用SPSS軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，評價差異顯著性。P<0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 LEP-2a及其消化組分的化學組成

LEP-2a及其消化組分的化學組成如表1所示。LEP-2a是分子質(zhì)量約為50.3 ku的雜聚糖，總糖含量超過99%，糖醛酸含量約為1.48%±0.16%，未檢測到蛋白質(zhì)。模擬消化后糖醛酸含量升高，Yuan等[3]對Holothurialeucospilota多糖消化研究中也觀察到了這一現(xiàn)象。單糖測定結(jié)果表明，LEP-2a及其消化組分主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖及半乳糖醛酸組成，但胃腸消化后葡萄糖及甘露糖相對含量降低，可能與其獨特化學結(jié)構(gòu)有關(guān)。此外，LEP-2a的單糖組成和分子量與以前的研究均不相同[6,9,23-24]，表明它是一種新的多糖。

2.2 LEP-2a及消化組分的分子質(zhì)量分析

LEP-2a及其消化組分的分子質(zhì)量(Mw)如圖1所示。以不同分子質(zhì)量的葡聚糖作標品，得到分子質(zhì)量校正曲線方程：y=-0.220 8x+13.29(R2=0.9905)，其中y為lgMw，x為保留時間。唾液消化后LEP-2a的保留時間及平均分子質(zhì)量未發(fā)生明顯變化，表明LEP-2a不能被唾液消化降解。胃腸消化后，LEP-2a的保留時間由38.897 min延長到39.02 min和39.235 min，其分子質(zhì)量也從50.30 ku下降到47.25 ku和42.36 ku，表明胃腸消化使LEP-2a發(fā)生了降解[25]。

圖1 LEP-2a及其消化組分的分子質(zhì)量分布Figure 1 Molecular weight distribution of LEP-2a and its digestive components

2.3 消化過程中還原糖變化

多糖通常作為聚合物存在于水溶液中，糖苷鍵斷裂可使其還原端數(shù)量增加，分子質(zhì)量降低[26]。因此，測定消化過程中還原糖含量變化判定LEP-2a的降解原因。以葡萄糖為標品測得還原糖標準曲線為y=1.607 4x+0.002 6，R2=0.998 2；其中，x為葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)，y為OD540。如圖2所示，唾液消化過程中LEP-2a的還原糖含量無顯著性差異，分子質(zhì)量也未發(fā)生明顯變化，表明LEP-2a不能被唾液消化。還原糖含量在模擬胃液消化過程中緩慢增加，在腸液消化階段迅速且顯著增加(P<0.05)。在模擬腸液消化180 min時，還原糖含量增至10.55%±0.33%。這些結(jié)果與胃腸消化后分子質(zhì)量顯著降低相一致，表明LEP-2a主要在胃腸中被降解。

誤差線為標準差；不同字母表示顯著性差異(* P<0.05)。圖2 體外唾液、模擬胃和腸液消化對LEP-2a還原糖含量的影響Figure 2 Effects of in vitro digestion (saliva, simulated gastric and intestinal) on reducing sugar content of LEP-2a

2.4 微觀形貌變化

原子力顯微鏡(AFM)是表征多糖微觀形貌的工具。LEP-2a及其消化產(chǎn)物的AFM平面及三維圖像如圖3所示。AFM檢測到LEP-2a的微觀高度為2.5 nm，高于單個多糖鏈(0.1～1.0 nm)[27]，表明具有分支結(jié)構(gòu)。唾液消化物LEP-2aG的高度為2.4 nm，與LEP-2a相比未發(fā)生明顯變化，推測其受唾液消化影響較小。胃消化產(chǎn)物LEP-2aS和腸消化產(chǎn)物LEP-2aI的高度顯著降低，高度分別為1.8 nm和0.8 nm。結(jié)合還原糖及分子質(zhì)量變化，推測可能是胃腸消化使LEP-2a的糖苷鍵斷裂，從立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變?yōu)殒湢罱Y(jié)構(gòu)，分支程度降低。微觀形貌更直觀地反映了LEP-2a主要在胃腸消化階段被消化分解。

圖3 LEP-2a及其消化組分的原子力顯微鏡圖像Figure 3 Atomic force microscopy images of LEP-2a and its digestive component

2.5 消化過程中多糖抗氧化活性的變化

胃腸消化過程中多種因素如pH、溫度、酶等可能使多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進而影響其抗氧化活性。如圖4所示，LEP-2a對ABTS+和DPPH自由基的清除能力及其還原能力在唾液消化過程中無顯著變化，這與其還原糖及分子質(zhì)量在唾液消化階段保持穩(wěn)定相一致。LEP-2a對ABTS+的清除能力[圖4(a)]隨著模擬胃液和腸液消化的時間延長緩慢增強，在腸液消化階段120 min時達22.5%±0.47%，隨后趨于穩(wěn)定(P<0.05)。LEP-2a對DPPH[圖4(b)]具有良好的清除能力且胃液和腸液的消化對清除能力的影響較顯著(P<0.05)，在胃液反應(yīng)240 min時清除能力達52.6%±1.36%。還原能力通常與防止過氧化物的某些前體反應(yīng)和過氧化物的形成有關(guān)[28]，是評估多糖潛在抗氧化活性的重要指標。LEP-2a具有一定的還原力且隨著胃液消化時間的增加而增強[圖4(c)]，在腸液消化60 min時趨于穩(wěn)定。因此，LEP-2a在體內(nèi)依然保持較好的抗氧化活性，受唾液消化影響較小，但模擬胃腸消化階段隨消化時間的延長，抗氧化活性增強。

(a)ABTS自由基清除活力；(b)DPPH自由基清除活力；(c)還原力。誤差線為標準差；不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。圖4 體外唾液、模擬胃和腸液消化對LEP-2a抗氧化活性的影響Figure 4 Effects of in vitro digestion (saliva, simulated gastric and intestinal) on antioxidant activities of LEP-2a

2.6 消化脂解

不同含量的LEP-2a溶液(0、0.5%、1.0%)對胃腸消化階段脂質(zhì)分解的影響如圖5所示。不添加LEP-2a時，脂質(zhì)乳液在胃液消化環(huán)境下[圖5(a)]被迅速分解釋放游離脂肪酸(FFA)。在胃消化120 min時，空白組有6.30%±0.12%的游離脂肪酸釋放并仍呈上升趨勢。相比之下，LEP-2a組的脂質(zhì)分解在胃消化40 min時即趨于穩(wěn)定，且消化120 min時加入1% 多糖的乳液僅有0.34%±0.03%的脂質(zhì)被分解。此外，模擬腸液消化120 min時，空白對照組有25.73%±0.26%的游離脂肪酸釋放，但加入1%多糖的實驗組僅有17.01%±0.29%的脂質(zhì)分解。盡管實驗中在消化過程中FFA釋放相對較低，但結(jié)果與以前的工作一致[29]，釋放的FFA量低可能與脂質(zhì)乳液粒徑及玉米油的添加量有關(guān)。因此，LEP-2a的加入可以有效抑制脂質(zhì)在胃腸中的消化分解。

(a)模擬胃消化過程中FFA釋放；(b)模擬腸消化過程中FAA釋放。圖5 模擬消化條件下多糖對脂質(zhì)分解的影響Figure 5 Effect of polysaccharides on lipolysis under simulated digestion

3 討論與結(jié)論

研究采用體外模擬消化模型(唾液、胃液及腸液)探究粒毛盤菌YM40多糖(LEP-2a)的消化特性及不同消化階段的生物活性。研究表明，LEP-2a在體外唾液消化階段理化性質(zhì)及微觀結(jié)構(gòu)變化不顯著，張冠亞等[30]在對鐵皮石斛多糖的研究中也觀察到了這一現(xiàn)象。事實上，大多數(shù)天然非淀粉多糖都不能被人唾液消化[26]。但在胃液和腸液消化過程中分子質(zhì)量降低、還原糖含量增加(P<0.05)、糖醛酸含量升高、微觀高度明顯降低，表明胃腸消化使LEP-2a發(fā)生降解。這一變化可能是模擬胃液的酸性pH及腸液中的酶、溫度等因素使糖苷鍵斷裂[31]。不同真菌多糖的消化特性存在差異，Ding等[32]將靈芝多糖在體外模擬消化和體內(nèi)發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)該多糖在消化道中不能完全降解，主要在大腸中被分解和利用。Wang等[25]發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌(Inonotusobliquus)多糖經(jīng)胃腸模擬消化后分子質(zhì)量由105.02 ku降低至36.74 ku，抗氧化及降血脂活性增強。對多糖消化特性的研究有利于探究其益生元特性，為進一步體內(nèi)活性的研究提供基礎(chǔ)。

多糖的抗氧化活性通常與其分子質(zhì)量、糖醛酸含量、鏈構(gòu)象等密切相關(guān)[3]。LEP-2a在模擬胃液和腸液消化過程中抗氧化活性隨時間延長而增強，但受唾液消化影響較小。Miao等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在一定程度上降低分子質(zhì)量可以增強多糖的抗氧化活性。此外，多糖中存在的醛酸基團可以激活異構(gòu)碳的氫原子進而增強多糖的供氫能力[20]。因此，模擬胃腸消化過程中LEP-2a抗氧化能力升高，可能歸因于消化條件下糖苷鍵斷裂使還原端數(shù)量增加，分子質(zhì)量降低[34]，糖醛酸含量增加，提高了供氫能力。

此外，LEP-2a可以較好地抑制脂質(zhì)在模擬胃腸消化環(huán)境中迅速分解，可能由于多糖的加入增加了消化液的黏度，促進脂滴絮凝，從而限制脂肪酶與脂滴的接觸[22]。但多糖對脂質(zhì)消化影響的確切機制有待進一步研究。LEP-2a對脂質(zhì)消化分解的抑制能力有利于降低餐后血脂水平的迅速升高，增強飽腹感，可以應(yīng)用于富含油脂的食品中以促進健康。

LEP-2a主要在胃腸消化階段因糖苷鍵斷裂發(fā)生降解，經(jīng)胃腸消化后抗氧化性增強且該多糖能有效抑制脂肪的消化分解。研究探索了粒毛盤菌多糖的消化特性，為其體內(nèi)活性研究及進一步開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。后續(xù)將對該多糖進行結(jié)構(gòu)鑒定并分析構(gòu)效關(guān)系，進一步揭示粒毛盤菌多糖在人胃腸消化過程中的消化及吸收特點。