厭氧條件下群體感應(yīng)系統(tǒng)對銅綠假單胞菌表型的影響*

唐秀家，葉柳镅，張文淑，李金壟，王 可

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，南寧 530021）

銅綠假單胞菌（P.a）是一種常見的條件致病菌，當(dāng)人體組織屏障遭受破壞或免疫力低下時(shí)可引起感染等嚴(yán)重疾病[1]。其致病性主要?dú)w因于生物被膜形成以及細(xì)胞外毒力因子的產(chǎn)生，例如彈性蛋白酶、綠膿菌素、鼠李糖脂等[2]，而這些均受群體感應(yīng)系統(tǒng)（QS）所調(diào)控[3]。P.a的QS系統(tǒng)分為LasR-LasI、RhlR-RhlI、假單胞菌喹諾酮信號（PQS）[4]。LasRLasI 系統(tǒng)主要是促進(jìn)毒力基因的表達(dá)[5]，RhlR-RhlI系統(tǒng)主要是促進(jìn)蛋白酶的合成以及綠膿菌素等毒素的分泌[6]，而PQS 系統(tǒng)除了調(diào)節(jié)生物被膜形成及毒力因子的產(chǎn)生外，還可以通過鐵螯合調(diào)控反硝化作用[7]。反硝化是指在缺氧條件下，P.a利用氮氧化物通過異源硝酸鹽呼吸生長的過程[8]。因此，QS在P.a厭氧生長過程中發(fā)揮著重要作用。已有報(bào)道，P.a以厭氧生長的方式存活于肺囊性纖維化（CF）患者的肺部氣道內(nèi)[9]。而在CF患者肺中的黏液中，P.a根據(jù)氧濃度的不同而變換不同的生長形態(tài)以適應(yīng)環(huán)境[10]。由此可見，氧環(huán)境的不同也會影響P.a的生長以及致病性。

膿胸是臨床常見疾病。有研究報(bào)道，假單胞菌屬是膿胸常見的致病菌之一[11]。而P.a在膿胸患者胸腔積液中的生長特征是否與CF 患者相似，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究主要探討P.a在體外有氧和厭氧條件下的生長、生物被膜形成及毒力因子產(chǎn)生的變化，為以后開展膿胸胸膜腔內(nèi)P.a的生長特征研究奠定基礎(chǔ)；并利用兩種QS 基因缺陷型菌株P(guān)AO1 lasIrhlI和PAO1 lasRrhlR研究QS系統(tǒng)對有氧、厭氧環(huán)境下P.a生長、生物被膜形成及毒力因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 菌株

PAO1 菌株、PAO1 lasIrhlI 和PAO1 lasRrhlR 基因缺陷型菌株，由新加坡南洋理工大學(xué)生命科學(xué)院惠贈。

1.2 主要試劑

LB瓊脂粉、LB肉湯、胰蛋白大豆肉湯（TSB）均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；蛋白胨購自北京鴻潤寶順科技有限公司；Tris試劑、PBS均購自北京索萊寶科技有限公司；偶氮酪蛋白、氯化鈉、結(jié)晶紫均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；地衣酚購自北京酷爾化學(xué)科技有限公司；濃硫酸購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；彈性蛋白—剛果紅購自上海北諾生物科技有限公司；綠膿菌素測定用培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；無水葡萄糖購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 P.a菌液濃度調(diào)整

將P.a復(fù)蘇后，挑取單個(gè)菌落接種于培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。將菌懸液離心后去上清液，重懸3 次后使用紫外分光光度計(jì)測定600 nm 處的吸光度（OD）值為0.1，此菌液濃度約為108CFU/mL。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)設(shè)立PAO1 組、PAO1 lasIrhlI 組、PAO1 las-RrhlR組和對照組（無菌株）。分別在有氧和厭氧條件下比較P.a的生長、生物被膜形成和毒力因子產(chǎn)生能力。

1.5 生長曲線的測定

1.5.1 有氧條件下 取上述PAO1、PAO1 lasIrhlI、PAO1 lasRrhlR 菌株108CFU/mL 菌液以0.1 mol/L NaNO3的LB 肉湯培養(yǎng)液（LBN）作為溶劑稀釋至106CFU/mL，接種于24孔板中，無菌同量LBN作為對照組，每隔2 h分別測定570 nm處的OD值（OD570）。

1.5.2 厭氧條件下 將3種菌株按照上述方法稀釋至106CFU/mL，接種于24孔板中，以LBN作為對照組。將24 孔板放置于已放入?yún)捬醴磻?yīng)包的厭氧反應(yīng)袋中。每隔4 h測定OD570。

1.6 生物被膜形成實(shí)驗(yàn)

按“1.5 項(xiàng)”制備有氧和厭氧所需的P.a菌液，并接種到96孔板中。放入生化培養(yǎng)箱（厭氧組保證厭氧條件），培養(yǎng)24 h后，吸出菌液，用無菌PBS洗滌，自然干燥后加入0.1%結(jié)晶紫染液，室溫下染色20 min，去除染色液，用PBS 洗滌后自然干燥，并加入33%冰乙酸溶液，測定OD570。

1.7 厭氧對毒力因子表達(dá)的影響

1.7.1 綠膿菌素試驗(yàn)（熒光法）按“1.3 項(xiàng)”方法調(diào)整菌液濃度至108CFU/mL。將菌液以含0.1 mol/L硝酸鈉的PTSB 作為溶劑稀釋至107CFU/mL，將3 種菌株接種到含0.1 mol/L 硝酸鈉的PTSB 的錐形瓶中，將錐形瓶分別置于有氧和厭氧環(huán)境中，再置于振蕩器上，37 ℃培養(yǎng)24 h。對照組設(shè)置如前所述。24 h后取出錐形瓶，混勻菌液，吸取部分菌液離心10 min，取過濾后上清液加入96 孔板中測定695 nm處的OD值（OD695）。

1.7.2 蛋白水解酶檢測 取“1.7.1 項(xiàng)”制備的24 h菌懸液離心。取部分過濾后上清液加入含等量偶氮酪蛋白混合溶液（5 mg/mL偶氮酪蛋白，0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液），37 ℃孵育1 h后，加入10%三氯乙酸終止反應(yīng)，靜置，離心，取上清液加入96 孔板中，再加入等量625 mmol/L NaOH，測定420 nm 處的OD值（OD420）。

1.7.3 彈性蛋白酶測定 取“1.7.1 項(xiàng)”制備的24 h菌懸液部分離心10 min。取部分過濾后上清液與適量彈性蛋白—剛果紅緩沖液（5 mg/mL 彈性蛋白—剛果紅，0.1 mol/L Tris-HCl，1 mmol/L CaCl2）混勻，37 ℃孵育16 h后，離心，吸取上清加入96孔板測定490 nm處的OD值（OD490）。

1.7.4 鼠李糖脂測定 取“1.7.1 項(xiàng)”所制備的24 h菌懸液，離心，取過濾后上清液加入等量乙酸乙酯萃取兩次；取有機(jī)相并室溫下自然干燥，加入去離子水溶解混勻；取溶解液、0.16%地衣酚和750 μL 60%濃硫酸混勻，水浴加熱30 min，待冷卻至室溫后測定421 nm處的OD值（OD421）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。根據(jù)資料的正態(tài)性，如符合正態(tài)性采用方差分析，如不符合采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QS 基因缺陷型菌株和PAO1 菌株在有氧及厭氧環(huán)境下的生長曲線

在有氧培養(yǎng)時(shí)，PAO1、PAO1 lasIrhlI 基因缺陷型和PAO1 lasRrhlR 基因缺陷型菌株24 h 生長總菌量相近，均在2～3 h 后開始進(jìn)入對數(shù)期，在約12 h左右到達(dá)平臺期。3種菌株無明顯差異。在厭氧培養(yǎng)時(shí)，PAO1、PAO1 lasIrhlI 基因缺陷型和PAO1 lasRrhlR基因缺陷型菌株生長明顯受限，生長減緩，約在3～4 h后進(jìn)入對數(shù)增長期，12 h到達(dá)平臺期，平臺期菌量低于有氧條件，見圖1。

圖1 3種P.a菌株在有氧、厭氧環(huán)境下的生長曲線

2.2 PAO1 和QS 基因缺陷型菌株在有氧及厭氧環(huán)境下的生物被膜形成能力

在有氧條件下，PAO1 菌株生物被膜形成量高于兩種基因缺陷型菌株（P＜0.05），兩種基因缺陷型菌株生物被膜形成量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在厭氧條件下，PAO1菌株生物被膜形成量低于有氧條件（P＜0.05），PAO1 菌株生物被膜形成量與兩種基因缺陷型菌株生物被膜形成量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；有氧、厭氧條件下，兩種基因缺陷型菌株生物被膜形成比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 3種P.a菌株在有氧和厭氧環(huán)境下的生物被膜形成

2.3 厭氧條件抑制P.a綠膿菌素的產(chǎn)生

在有氧條件下，兩種基因缺陷型菌株僅產(chǎn)生少量綠膿菌素，PAO1 產(chǎn)生的綠膿菌素含量約為基因缺陷型菌株的4倍（P＜0.05）；在厭氧條件下，3種P.a菌株幾乎沒有產(chǎn)生綠膿菌素，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 3種P.a菌株在有氧和厭氧環(huán)境下的綠膿菌素形成

2.4 厭氧條件減少鼠李糖脂含量

在有氧、厭氧條件下，PAO1、PAO1 lasIrhlI 和PAO1 lasRrhlR基因缺陷型菌株均產(chǎn)生鼠李糖脂，鼠李糖脂含量均高于對照組（均P＜0.05）；在有氧、無氧條件下，PAO1 菌株產(chǎn)生的鼠李糖脂含量均高于兩種基因缺陷型菌株（P＜0.05）；在厭氧條件下，PAO1 菌株鼠李糖脂含量低于有氧條件（P＜0.05），見圖4。

圖4 3種P.a菌株在有氧和厭氧環(huán)境下的鼠李糖脂形成

2.5 厭氧抑制彈性蛋白酶活性

在有氧條件下，PAO1 彈性蛋白酶活性高于兩種基因缺陷型菌株（P＜0.05）；厭氧條件下，PAO1彈性蛋白酶活性受到明顯抑制，僅為有氧條件下的1/5左右（P＜0.05）；兩種基因缺陷型菌株無論在有氧還是厭氧條件下彈性蛋白酶活性均較低，見圖5。

圖5 3種P.a菌株在有氧、厭氧環(huán)境下的彈性蛋白酶形成

2.6 厭氧條件下蛋白水解酶活性減弱

在有氧條件下，PAO1 蛋白水解酶活性高于兩種基因缺陷型菌株蛋白水解酶活性（P＜0.05）；與有氧條件比較，厭氧條件下PAO1 蛋白水解酶活性降低（P＜0.05）；有氧、厭氧條件下，兩種基因缺陷型菌株蛋白水解酶活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 3種P.a菌株在有氧和厭氧環(huán)境下的蛋白水解酶形成

3 討論

P.a是一種反硝化細(xì)菌，具有一套完整的反硝化酶[8]，在厭氧條件下，可以利用N-氧化物作為末端電子受體進(jìn)行厭氧生長。臨床P.a感染中存在許多厭氧條件，比如慢性CF 患者的氣道、痰液[9]及傷口損傷[12]等，而這些感染都是較難清除的。因此，闡明其在缺氧環(huán)境中的生長和致病性，不僅能更好地了解P.a的厭氧代謝及相應(yīng)的生理特性，也有助于發(fā)現(xiàn)新的抗生素靶點(diǎn)及治療方案。

P.a在有氧環(huán)境下可產(chǎn)生彈性蛋白酶、蛋白酶、鼠李糖脂、綠膿菌素等多種毒力因子，而這些毒力因子主要是由QS 控制的。研究表明，與有氧條件相比，厭氧條件下，P.a的QS 系統(tǒng)調(diào)節(jié)能力是減弱的，其致病力也明顯下降[13-14]。為了解P.a在有氧或厭氧條件下表達(dá)毒力因子的能力，我們研究了QS雙突變菌株和PAO1分別在有氧或厭氧條件下的彈性蛋白酶和蛋白酶活性以及產(chǎn)生綠膿菌素和鼠李糖脂能力的差異。與之前的報(bào)道[14]一致，當(dāng)PAO1在厭氧條件下生長時(shí)，彈性蛋白酶活性明顯受到抑制，僅為有氧條件下的20%左右，僅略高于雙突變菌株在厭氧條件下的彈性蛋白酶活性。此外，與有氧條件相比，蛋白酶活性下降至20%，鼠李糖脂含量下降至1/3，綠膿菌素幾乎不產(chǎn)生。PAO1 lasIrhlI和PAO1 lasRrhlR 基因缺陷型菌株中在有氧條件下僅檢測到微弱的彈性蛋白酶和蛋白酶活性，鼠李糖脂和綠膿菌素僅有少量產(chǎn)生，而厭氧條件下幾乎不表達(dá)毒力因子。本研究證實(shí)了無論在有氧還是厭氧環(huán)境下，QS對PAO1中的這些細(xì)胞外毒力因子均有重要的調(diào)節(jié)作用，但在厭氧環(huán)境中調(diào)節(jié)能力減弱。然而，即使PAO1、QS基因缺陷株產(chǎn)生毒力因子的能力極弱，但其依舊能引起臨床感染[15]。

P.a的慢性感染與生物被膜形成有關(guān)。細(xì)胞與細(xì)胞之間的交流在生物被膜中的組織和分化中起著作用，而QS 系統(tǒng)在細(xì)菌細(xì)胞間通信中起著尤為重要的作用，這些作用因P.a的不同生活環(huán)境而表現(xiàn)不同[16]。本研究中，PAO1的生物被膜形成能力在厭氧條件下明顯下降，僅為有氧條件下的40%左右。PAO1 lasIrhlI 和PAO1 lasRrhlR 雙突變體在有氧和厭氧條件下生物被膜形成能力相近，似乎并沒有受到厭氧環(huán)境的影響。在3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，均觀察到在厭氧條件下PAO1 生物被膜形成量明顯減少，且?guī)缀跖c雙突變菌株相同，與以往研究[17]結(jié)果相一致，但既往也有研究表明厭氧條件下PAO1 會形成更多生物被膜[18-21]。由于缺乏進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)，本研究無法準(zhǔn)確解釋這一現(xiàn)象。P.a厭氧生物被膜形成的增加，這種不同于有氧條件下的生物被膜形成，其關(guān)鍵是細(xì)胞的伸長[21]。Hao 等[14]研究了包括PAO1在內(nèi)的7株臨床分離菌株，發(fā)現(xiàn)盡管一些臨床菌株有氧條件下生物被膜形成能力與PAO1 相近，但在厭氧條件下，這些菌株生物被膜形成能力明顯減弱，意味著可能存在著另一種不同于QS 的機(jī)制也在調(diào)節(jié)生物被膜形成的過程。影響生物被膜形成的因素有很多。在厭氧條件下生物被膜的形成涉及多種調(diào)控機(jī)制，且具有菌株依賴性，不同菌株在相同條件下其所形成生物被膜的能力不一定相同[14]。這些差異可能由實(shí)驗(yàn)參數(shù)不同所致，不同的實(shí)驗(yàn)參數(shù)也會影響生物被膜的形成[16]。

綜上，P.a在厭氧條件下產(chǎn)生毒力因子的能力減弱，而QS 系統(tǒng)在厭氧條件下也明顯受到抑制。但本研究P.a的生物被膜形成減少，因此，針對這一現(xiàn)象，今后將繼續(xù)探究P.a在厭氧條件下致病性機(jī)制及其在膿胸胸膜腔內(nèi)的表型變化。