Rasal2在肺動脈平滑肌細胞增殖及遷移中的作用機制

王芳，何思毅，陳杰*

(西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院：1燒傷科，2心臟外科，成都610083)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種病因多變、病理機制復雜、死亡率較高的綜合征，發(fā)生機制包括異常的肺動脈收縮、肺血管重塑，從而引起肺動脈阻力增高、最終導致右心衰竭及終末死亡[1,2]，而低氧是引起PAH的關鍵因素[3]。肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)在生理狀況下保持著增殖和凋亡的動態(tài)平衡。然而在慢性低氧刺激下，PASMCs增殖和遷移能力過度增強，造成血管狹窄甚至閉鎖，最終導致PAH[4]。目前基于傳統(tǒng)機制的藥物仍不能完全有效地降低PAH的致死率、致殘率，因此，探索新的調控PASMCs增殖、遷移的分子機制勢在必行。

Ras家族蛋白在調控平滑肌細胞增殖和遷移中發(fā)揮重要作用[3,5]。Ras蛋白激活類似物2(Ras protein activator like 2, Rasal2)屬于Ras GTP酶活化蛋白家族[6]，最初被認為是一種抑制腫瘤的蛋白[7]。然而，近期研究發(fā)現(xiàn)Rasal2還可以促進多種腫瘤的生長[6,8]。此外，Rasal2還可以抑制腎癌組織的血管新生過程[9]，提示其在血管生理病理中發(fā)揮潛在作用。然而，Rasal2在肺動脈高壓中的作用目前尚不清楚。本研究利用缺氧條件干預細胞模型，探討Rasal2是否能調控PASMCs增殖與遷移并探討其可能的機制。本研究拓寬了肺動脈高壓發(fā)病機制的研究思路，為肺動脈高壓的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要材料

C57BL/6J小鼠購自成都達碩實驗動物有限公司，共30只，8～10周齡，體質量22 g左右。小鼠飼養(yǎng)在12 h光暗交替、溫度24 ℃的無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級動物房中。小鼠肺動脈高壓模型造模方法：低氧組的小鼠皮下注射SU5416，濃度20 mg/kg，每周注射1次；與此同時，小鼠飼養(yǎng)在恒溫培養(yǎng)箱的低氧(10%氧氣)環(huán)境中，飼養(yǎng)21 d。而常氧組的小鼠每周1次注射等量的溶劑。

SU5416(美國Sigma公司)，DMEM細胞培養(yǎng)基(美國HyClone公司)，10%胎牛血清(美國Invitrogen公司)，雷帕霉素(中國皓元生物)，siRasal2試劑(中國銳博生物公司), Lip2000(美國Invitrogen公司), 二脒基苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)胞核熒光染料(美國Roche公司)，增殖細胞相關抗原(Ki-67)抗體(中國博奧森生物公司)，Rasal2、p-S6Ser235/236、S6、p-4EBP1Thr37/46、4EBP1抗體(美國CST公司)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Gapdh)抗體(美國CST公司)，siRasal2試劑(中國銳博生物公司)，Transwell試劑盒(德國默克公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及干預 從野生型小鼠的肺動脈中獲得PASMCs，并分為6組：常氧對照組(常氧+siCon)、常氧轉染組(常氧+siRasal2)、低氧對照組(低氧+siCon)、低氧轉染組(低氧+siRasal2)、常氧干預組(常氧+siRasal2+胰島素)、低氧干預組(低氧+siRasal2+胰島素)。每組約1×106～2×106個細胞，待細胞長到40%左右時，予以siCon和siRasal2轉染并培養(yǎng)24 h，其中，常氧組細胞在21%氧氣環(huán)境中培養(yǎng)，低氧組細胞在3%氧氣環(huán)境中培養(yǎng)。為進一步研究Rasal2通過mTOR蛋白復合體1(mammalian target of rapamycin complex 1, mTORC1)調控細胞增殖和遷移，同時加入胰島素(5 mg/L)繼續(xù)孵育24 h。

1.2.2 細胞siRasal2的轉染 使用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)沉默PASMCs中Rasal2的表達水平。在細胞生長至40%時，使用Lip2000與siRNA在細胞中共培養(yǎng)48 h。siRasal2序列是5′-CTGCATCAGATGCCATCTA-3′。

1.2.3 實時定量PCR 使用Trizol法提取總RNA，使用Bestar qPCR逆轉錄試劑盒逆轉錄cDNA，使用ABI Prism 7700完成實時定量PCR反應。引物：Rasal2(F: 5′-TGTTCTGTCCTTGAGCCAGT-3′; R: 5′-TCCACCTCAGACATCACCAA-3′);Gapdh(F: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′；R: 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′)[10]。

1.2.4 CCK-8試驗 細胞與10 μl CCK-8染色劑在37 ℃共培養(yǎng)2 h，使用分光光度計測量A450 nm，取其相對值表示細胞活力。

1.2.5 Ki-67免疫熒光染色 在6孔板中放入小玻片，倒入細胞懸液，按上述分組干預完成后倒掉培養(yǎng)液固定細胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)清洗3次，用0.3%～0.5% TritonX-100處理穿透15 min，PBS清洗3遍，血清室溫封閉30 min。Ki-67抗體以1∶1 000在4℃濕盒孵育過夜，PBS清洗3遍，二抗室溫暗室孵育1 h，PBS清洗3遍，DAPI復染核，使用熒光顯微鏡拍片，Ki-67染色呈綠色，DAPI染色呈藍色，計算Ki-67陽性細胞率。

1.2.6 Transwell實驗 將上述分組的各組PASMCs接種在8 μm孔的transwell上層小室中，小室置于含無血清培養(yǎng)基的24孔板中，分別置于常氧和低氧環(huán)境中繼續(xù)孵育8 h。將未遷移的小室內膜一面細胞擦除，而留有遷移細胞的外膜使用多聚甲醛固定，并用PBS沖洗3次，之后將膜剪下置于玻璃片并使用1%結晶紫染液染色，遷移的細胞數(shù)目比例通過光鏡進行圖像采集和計算。

1.2.7 免疫印跡實驗 提取各組小鼠肺動脈組織和PASMCs蛋白，通過8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白電轉到聚偏二氟乙烯膜上。5%胎牛血清封閉1 h，使用相應一抗4 ℃過夜孵育。充分洗膜后，常溫下二抗孵育1 h。繼續(xù)洗膜，通過化學發(fā)光液顯色，并用凝膠圖像分析系統(tǒng)對條帶進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 Rasal2蛋白在慢性低氧小鼠肺動脈組織和缺氧處理的PASMCs中的表達水平變化

為探索Rasal2在肺動脈高壓中的作用，我們利用慢性低氧小鼠構建肺動脈高壓模型，發(fā)現(xiàn)與常氧組小鼠相比，慢性低氧組小鼠肺動脈組織中Rasal2mRNA[(2.57±0.15)和(1.02±0.09)，P<0.001；圖1A]和蛋白[(2.18±0.36)和(0.97±0.14)，P<0.001；圖1B]水平明顯增高。缺氧所致的PASMCs異常增殖和遷移在PAH中發(fā)揮重要作用，我們也檢測了Rasal2在缺氧處理PASMCs中的表達變化，發(fā)現(xiàn)與常氧組相比，低氧處理12 h與24 h的mRNA[(2.41±0.20)，(2.86±0.24)和(1.03±0.12)，P<0.001；圖1C]和蛋白表達明顯升高[(2.50±0.32)，(2.79±0.38)和(1.13±0.1)，P<0.01；圖1D]。

圖1 各組Rasal2 mRNA與蛋白表達情況比較Figure 1 mRNA and protein expression of Rasal2 in different groupsCompared with Normoxic group, ***P<0.001; compared with 0 h group, ##P<0.01, ###P<0.001. CH-PH: chronic hypoxia-pulmonary hypertension; PASMCs: pulmonary arterial smooth muscle cells.

2.2 Rasal2沉默對低氧所致PASMCs增殖的影響

我們利用Rasal2 siRNA(siRasal2)沉默Rasal2的表達。轉染siRasal2后，Rasal2表達明顯下降[(1.09±0.09)和(0.33±0.04)，P<0.001，圖2]。與常氧組相比，低氧組Ki-67陽性細胞百分比明顯升高[(62.75±7.54)%和(13.90±2.35)%，P<0.001]；在低氧處理的PASMCs中，轉染siRasal2后Ki-67陽性細胞百分比顯著下降[(19.25±5.34)%和(62.75±7.54)%，P<0.001；圖3]。

圖2 各組Rasal2表達情況比較Figure 2 Rasal2 protein expression in different groupsCompared with siCon group,***P<0.001. siRasal2: Rasal2 siRNA; siCon: control siRNA.

圖3 各組PASMCs Ki-67免疫熒光染色比較Figure 3 Immunofluorescence staining of Ki-67 in different groups (×400)Compared with Normoxic+siCon group,***P<0.001; compared with Hypoxic+siCon group, ###P<0.001. PASMCs: pulmonary arterial smooth muscle cells; siRasal2: Rasal2 siRNA; siCon: control siRNA; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.3 沉默Rasal2對低氧所致PASMCs遷移的影響

我們利用transwell實驗評估PASMCs遷移能力。與常氧組相比，低氧組遷移細胞百分比明顯升高[(305.25±58.28)%和(88.90±13.67)%，P<0.05]；在低氧處理的PASMCs中，轉染siRasal2后遷移細胞百分比顯著下降[(115.25±19.00)%和(305.25±58.28)%，P<0.05；圖4]。

圖4 各組PASMCs Transwell分析Figure 4 Transwell assay of PASMCs in different groups (×100)Compared with Normoxic+siCon group,*P<0.05; compared with Hypoxic+siCon group, #P<0.05. PASMCs: pulmonary arterial smooth muscle cells; siRasal2: Rasal2 siRNA; siCon: control siRNA.

2.4 沉默Rasal2對PASMCs中mTORC1下游效應蛋白表達的影響

mTORC1可被Ras蛋白激活，從而通過下游效應分子S6和4EBP1誘導SMC增殖、遷移[11,12]。我們發(fā)現(xiàn)與常氧組相比，低氧組PASMCs中S6、4EBP1磷酸化水平明顯增強[(3.27±0.24)和(1.06±0.14)，(2.95±0.15)和(1.07±0.06)，均P<0.001]；在低氧處理的PASMCs中，轉染siRasal2后S6、4EBP1磷酸化水平顯著減弱[(1.90±0.06)和(3.27±0.24)，(1.70±0.13)和(2.95±0.15)，均P<0.001；圖5]。

圖5 各組mTORC1下游通路蛋白表達情況Figure 5 Expression of mTORC1-associated proteins in different groupsCompared with Normoxic+siCon group, ***P<0.001; compared with Hypoxic+siCon group, ###P<0.001. mTORC1: mammalian target of rapamycin complex 1; siRasal2: Rasal2 siRNA; siCon: control siRNA.

2.5 恢復mTORC1活性對PASMCs增殖的影響

我們利用胰島素處理細胞恢復mTORC1活性從而探索其在Rasal2調控PASMCs功能中的作用。沉默了Rasal2表達的基礎上，使用胰島素恢復mTORC1活性后S6[(0.94±0.16)和(0.36±0.11)，P<0.01；圖6]、4EBP1[(0.99±0.09)和(0.61±0.03)，P<0.01；圖6]磷酸化水平顯著回升、細胞活力明顯升高[(1.24±0.06)和(1.61±0.10)，P<0.001；圖7A]、Ki-67陽性細胞百分比增多[(61.25±3.10)%和(27.00±3.46)%，P<0.001；圖7B]。

圖6 各組mTORC1下游通路蛋白表達情況Figure 6 Expression of mTORC1-associated proteins in different groupsCompared with Vehicle+siCon group, **P<0.01; compared with Vehicle+siRasal2 group, ##P<0.01. mTORC1: mammalian target of rapamycin complex 1; siRasal2: Rasal2 siRNA; siCon: control siRNA.

圖7 各組PASMC CCK-8活性及Ki-67免疫熒光染色Figure 7 CCK-8 assay and immunofluorescence staining of Ki-67 in different groups (×400)Compared with Normoxic+siCon group, ***P<0.001; compared with Hypoxic+siCon group, ###P<0.001; compared with Hypoxic+siRasal2 group, △△△P<0.001. PASMCs: pulmonary arterial smooth muscle cells; siCon: control siRNA.

2.6 恢復mTORC1活性對PASMCs遷移的影響

為了探索mTORC1在Rasal2調控PASMCs遷移中的作用，我們利用胰島素處理細胞恢復mTORC1活性。在沉默了Rasal2表達的基礎上，使用胰島素恢復mTORC1活性后遷移細胞百分比明顯升高[(315.00±21.49)%和(141.00±15.30)%P<0.001]；而在胰島素恢復mTORC1活性的基礎上，siRasal2對低氧所致PASMCs遷移的抑制作用消失了[(315.00±21.49)%和(111.25±16.09)%，P<0.001；圖8]。

圖8 各組PASMCs Transwell分析Figure 8 Transwell assay of PASMCs in different groups (×100)Compared with Normoxic+siCon group,***P<0.001; compared with Hypoxic+siCon group, ###P<0.001; compared with Hypoxic+siRasal2 group, △△△P<0.001. PASMCs: pulmonary arterial smooth muscle cells; siRasal2: Rasal2 siRNA; siCon: control siRNA.

3 討 論

本研究旨在探索Rasal2在低氧所致PASMCs增殖和遷移中的作用機制研究，主要發(fā)現(xiàn)總結如下：(1)Rasal2蛋白表達水平在慢性低氧小鼠的肺動脈組織和低氧處理的PASMCs中均明顯增高；(2)沉默Rasal2表達抑制低氧所致PASMCs過度增殖和遷移；(3)沉默Rasal2表達抑制低氧所致PASMCs中mTORC1過度活化，主要體現(xiàn)在下游效應分子S6和4EBP1的去磷酸化；(4)胰島素恢復mTORC1活性后，Rasal2沉默對低氧所致PASMCs增殖和遷移的抑制作用消失。這些發(fā)現(xiàn)表明Rasal2可能成為防治PAH的新的關鍵靶分子。

Rasal2是屬于RAS GTP酶活化蛋白家族的一員，參與調控細胞增殖、糖脂代謝活動等[7]。有文獻報道Rasal2參與血管生理病理方面的調控，例如血管新生過程[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)受Rasal2調控的包含撕裂元活化蛋白激酶在內的多種蛋白也在PAH發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13]。我們當前研究也發(fā)現(xiàn)Rasal2在血管組織中表達豐富。然而，Rasal2在PAH中的作用鮮有研究。在PAH的發(fā)生發(fā)展中，PASMCs的表型轉換作用十分關鍵，主要表現(xiàn)為過度的異常遷移和增殖。我們當前的研究中，使用低氧的條件刺激PASMCs，Rasal2的表達水平顯著提升。低氧明顯促進了PASMCs的增殖和遷移，而通過siRNA外源性沉默了Rasal2的表達后，低氧對增殖、遷移的促進效應消失了。本實驗中Rasal2對PASMCs增殖、遷移的促進效應也與文獻報道中對多種腫瘤細胞增殖、遷移的促進作用相似[6,8]。以上研究結果表明，Rasal2升高是低氧所致PASMCs異常增殖、遷移的分子機制之一。然而，Rasal2如何調控PASMCs的增殖和遷移尚不清楚。

mTORC1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其可以調控包括增殖、生長、存活及遷移等多種生物過程[14,15]。既往研究已經(jīng)明確mTORC1是PAH發(fā)生發(fā)展中的核心調控因子之一[16]。也有研究報道了mTORC1可誘導PASMCs表型轉換，從而參與PAH發(fā)生發(fā)展。例如，慢性缺氧誘導mTOR和S6(mTORC1下游核心效應分子)磷酸化增強，并促進大鼠PASMCs增殖過程[17]。此外，另有研究報道m(xù)TOR信號參與血管內膜增生過程中的SMC遷移調控[18]。然而，mTORC1信號在PASMCs中是否受Rasal2調控并不清楚。在本研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)低氧可以激活mTORC1信號，而沉默Rasal2表達后則顯著抑制了mTORC1活性。因此，我們猜測mTORC1可能是Rasal2調控PASMCs增殖、遷移的重要分子機制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，使用胰島素恢復mTORC1活性后，siRasal2對PASMCs增殖、遷移的抑制作用消失了。該結果提示Rasal2調控的PASMCs表型轉換是mTORC1依賴型的。

綜上，本研究表明，Rasal2可能通過mTORC1途徑加重肺血管重構。本研究尚有以下不足：一是mTORC1的機制在體外得到證實，但在體內是否能復制尚需進一步研究；二是Rasal2調節(jié)mTORC1活性的上游機制尚未明確。我們的發(fā)現(xiàn)也許能夠為研發(fā)改善肺動脈高壓患者的臨床預后情況的藥物提供借鑒和參考。