• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    葛根芩連湯抑制TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷配伍規(guī)律研究

    2022-10-21 07:58:52董文敏張倩蕓劉王振祖王新宏
    中草藥 2022年20期
    關(guān)鍵詞:連湯葛根芩葛根

    林 川,董文敏,張倩蕓,劉王振祖,梁 琨,王新宏,安 叡*

    葛根芩連湯抑制TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷配伍規(guī)律研究

    林 川1,董文敏2,張倩蕓1,劉王振祖1,梁 琨1,王新宏1,安 叡1*

    1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,上海 201203 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院,上海 201200

    探討葛根芩連湯緩解腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷作用及其配伍規(guī)律。將Caco-2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、TNF-α(80 μg/L)組、小檗堿(6.73 μg/mL)組及葛根芩連湯配伍組(全方組、去甘草組、去葛根組、葛根甘草組和黃芩黃連組,18.75 μg/mL)。除對(duì)照組外,其余各組細(xì)胞給予TNF-α預(yù)處理2 h,再給予相應(yīng)藥物處理24 h。MTT檢測(cè)Caco-2細(xì)胞活力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;比色法檢測(cè)細(xì)胞中總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平;qRT-PCR和Western blotting分別檢測(cè)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,)、還原型輔酶I/II醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinine oxidoreductase 1,]和血紅素氧合酶-1(heme oxygenase 1,)mRNA和蛋白表達(dá);熒光顯微鏡觀察Nrf2蛋白入核情況。5.0~25.0 μg/mL的含藥培養(yǎng)基和10~80 μg/L的TNF-α對(duì)Caco-2細(xì)胞活性無明顯影響。與TNF-α組比較,各給藥組Caco-2細(xì)胞ROS水平顯著降低(<0.01);除去葛根組和黃芩黃連組外,其余各組MDA水平顯著降低(<0.01),GSH水平明顯升高(<0.01);除去葛根組外,其余各給藥組基因表達(dá)明顯升高(<0.01),全方組和去甘草組基因表達(dá)明顯升高(<0.05、0.01),全方組和葛根甘草組基因表達(dá)明顯升高(<0.05、0.01);除黃芩黃連組外,其余各組Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)顯著升高(<0.01);除去葛根組和黃芩黃連組外,其余各組NQO1蛋白水平顯著升高(<0.05、0.01),Nrf2蛋白入核明顯增加(<0.05、0.01)。缺少葛根對(duì)葛根芩連湯抑制Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有較大影響。

    葛根芩連湯;葛根;配伍規(guī)律;氧化應(yīng)激;結(jié)腸癌細(xì)胞

    氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài),傾向于氧化,中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn),蛋白酶分泌增加,產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。氧化應(yīng)激是自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用,是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。葛根芩連湯出自《傷寒論》,為醫(yī)圣張仲景的名方之一。方中葛根為君,以其甘辛而涼,主入陽明經(jīng),外解肌表之邪、內(nèi)清陽明之熱,使表解里和;臣以黃芩、黃連苦寒清熱,堅(jiān)陰止利;佐使以甘草甘緩和中,調(diào)和諸藥;四藥合用,外疏內(nèi)清,表里同治。研究表明,葛根芩連湯對(duì)氧化應(yīng)激損傷有一定的緩解作用[1-2]。本課題組前期從化學(xué)成分[3]、入血成分[4]、在人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞模型中的吸收特征[5]、對(duì)肝臟細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)具體亞型酶活性的影響[6]、腸外翻吸收[7-9]、在體腸道灌流吸收及對(duì)急性腸炎大鼠腸道菌群多樣性的影響[10-11]等方面對(duì)葛根芩連湯的配伍機(jī)制進(jìn)行了大量研究。本研究以人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)為刺激因素[12-13],激活Caco-2細(xì)胞炎癥反應(yīng),觀察葛根芩連湯及不同配伍組對(duì)Caco-2細(xì)胞的影響,以及對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞因子和通路的作用,以闡釋葛根芩連湯抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制及其配伍的合理性,為更全面地揭示該復(fù)方配伍規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料

    1.1 細(xì)胞

    Caco-2細(xì)胞購(gòu)自賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。

    1.2 藥材

    葛根、黃芩、黃連和炙甘草飲片均購(gòu)自上??禈蛑兴庯嬈邢薰?,批號(hào)分別為201016、201103、201118、201109,經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)倪梁紅副教授鑒定分別為豆科植物野葛(Willd.) Ohwi的干燥根、唇形科植物黃芩Georgi的干燥根、毛茛科植物黃連Franch的干燥根莖和豆科植物甘草Fisch.的干燥根和根莖,符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定。

    1.3 藥品與試劑

    小檗堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,批號(hào)Y18N8S48598)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;MEM培養(yǎng)基(批號(hào)20210706)、青鏈霉素混合液(批號(hào)20211119)、0.25%胰蛋白酶(批號(hào)2021060105)均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS,批號(hào)2217479CP)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;MTT(批號(hào)CR2107085)、β-actin抗體(批號(hào)AC2102050A)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(批號(hào)CR2104079)購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;TNF-α(批號(hào)021825)購(gòu)自PeproTech公司;總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)測(cè)定試劑盒(批號(hào)20201231)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)測(cè)定試劑盒(批號(hào)20210106)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測(cè)定試劑盒(批號(hào)20210105)購(gòu)自南京建成生物工程研究所;活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)01152120319)、總RNA抽提試劑Trizol(批號(hào)030221211216)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號(hào)031519190503)、Triton X-100(批號(hào)120921220118)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI,批號(hào)091720210121)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司;ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(批號(hào)027E1280LB)、HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR(批號(hào)017E2232BA)購(gòu)自諾唯贊公司;RIPA裂解液(批號(hào)R1001221)、BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)B1001231)購(gòu)自上海翊圣生物公司;核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)抗體(批號(hào)00102781)、還原型輔酶I/II醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinine oxidoreductase 1,NQO1]抗體(批號(hào)10017852)、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)抗體(批號(hào)00083458)購(gòu)自Proteintech公司;濃縮型正常山羊血清(批號(hào)17G04A09)、熒光(Cy3)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(批號(hào)BST16L31C17G32)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

    1.4 儀器

    SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)(蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司);FlexStation3型多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司);cytoFLEX型流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司);BioPhotometer D30型核酸蛋白檢測(cè)儀,Mastercycler pro型梯度PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司);StepOnePlus型qRT-PCR儀(美國(guó)ABI公司);PowerPac Basic型電泳儀及Mini Transblot型濕轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)Bio-Rad公司);AI 600型超靈敏多功能成像儀(美國(guó)GE公司);BX53型生物顯微鏡(日本Olympus公司)。

    2 方法

    2.1 葛根芩連湯的制備

    設(shè)置全方(GQ)組、去甘草(WGC)組(葛根、黃芩、黃連)、去葛根(WG)組(黃芩、黃連、甘草)、葛根甘草(GG)組、黃芩黃連(QL)組,將葛根、黃芩、黃連、甘草按照5∶3∶2∶2的比例混合(各組中缺味藥材按0計(jì)算),分別加10倍量水,葛根先煎20 min,余藥共煎30 min,煎煮2次,濾過,合并濾液,采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定成分及含量[1,3],GQ組、WGC組和GG組葛根素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.86、3.78和3.14 mg/g,GQ組、WGC組、WG組和QL組小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.76、0.73、6.91和1.79 mg/g。濾液于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,放至室溫后于?20 ℃冰箱預(yù)凍,轉(zhuǎn)入凍干機(jī),真空冷凍干燥,取出并碾壓得到凍干粉。以二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解凍干粉[14],經(jīng)微孔濾膜濾過,使用時(shí)以培養(yǎng)基稀釋。

    2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    Caco-2細(xì)胞用含20% FBS和1%青鏈霉素混合液的MEM培養(yǎng)基[15-16],于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    2.3 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,以5×103個(gè)/孔接種至96孔板,培養(yǎng)過夜。設(shè)置對(duì)照組、GQ組、WGC組、WG組、GG組和QL組,各給藥組分別以5.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的相應(yīng)藥物處理24 h,對(duì)照組給予等體積培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL MTT,37 ℃培養(yǎng)4 h;棄去培養(yǎng)基,加入150 μL DMSO振蕩10 min,采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度()值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

    細(xì)胞存活率=給藥/對(duì)照

    2.4 TNF-α對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,以5×103個(gè)/孔接種至96孔板,培養(yǎng)過夜。設(shè)置對(duì)照組和TNF-α組,TNF-α組分別以10、20、40、80、100 μg/L的TNF-α處理26 h,對(duì)照組給予等體積培養(yǎng)基培養(yǎng)26 h。按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定各組值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

    2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的測(cè)定

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,以2×105個(gè)/孔接種至6孔板,培養(yǎng)過夜。設(shè)置對(duì)照組、TNF-α組、小檗堿組和葛根芩連湯及其配伍組,TNF-α組給予80 μg/L TNF-α處理26 h,各給藥組給予80 μg/L TNF-α預(yù)處理2 h后,BBR組給予6.73 μg/mL小檗堿[2,17],葛根芩連湯及其配伍組分別給予18.75 μg/mL藥液[2],與TNF-α共同作用24 h,對(duì)照組給予等體積培養(yǎng)基培養(yǎng)26 h,按照試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

    2.6 細(xì)胞T-SOD活性和MDA、GSH水平的檢測(cè)

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,按“2.5”項(xiàng)下方法分組并給藥,收集細(xì)胞,按照試劑盒說明書檢測(cè)T-SOD活性和MDA、GSH水平。

    2.7 qRT-PCR檢測(cè)Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA表達(dá)

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,按“2.5”項(xiàng)下方法分組并給藥,收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌。按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA,進(jìn)行qRT-PCR分析[17]。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成,引物序列見表1。

    2.8 Western blotting檢測(cè)Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,按“2.5”項(xiàng)下方法分組并給藥,收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌。加入100 μL含1%磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度,加入Loading buffer混勻,95 ℃加熱使蛋白變性,分裝后于?80 ℃保存。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉后,分別加入Nrf2(1∶2000)、NQO1(1∶10 000)、HO-1(1∶1000)和β-actin(1∶3000)抗體,4 ℃孵育過夜;加入相應(yīng)二抗(1∶3000),室溫孵育2 h,顯影后,用Image J軟件分析目的條帶灰度值[18]。

    表1 引物序列

    Table 1 Primer sequences

    基因序列 (5’-3’) Nrf2F: GACAATGAGGTTTCTTCGGCTACG R: GGAGAGGATGCTGCTGAAGGAATC NQO1F: CGCAGACCTTGTGATATTCCAG R: CGTTTCTTCCATCCTTCCAGG HO-1F: CAGCATGCCCCAGGATTTG R: AGCTGGATGTTGAGCAGGA β-actinF: CCTGACTGACTACCTCATGAAG R: GACGTAGCACAGCTTCTCCTTA

    2.9 免疫熒光染色檢測(cè)Caco-2細(xì)胞Nrf2入核作用

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,接種于細(xì)胞爬片上,按“2.5”項(xiàng)下方法分組并給藥,24 h后吸棄培養(yǎng)板中液體,加入PBS洗滌,于4%多聚甲醛中固定,加入0.5% Triton X-100室溫通透,滴加正常山羊血清,室溫封閉。吸干封閉液,滴加Nrf2抗體(1∶50),放入濕盒,4 ℃孵育過夜。浸洗,吸干,滴加熒光(Cy3)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶100),于37 ℃濕盒中孵育1 h。滴加DAPI,避光孵育染核。洗滌,吸干液體,加入含抗熒光淬滅劑的封片液封片,于熒光顯微鏡下觀察,采集圖像,使用IPP 6.0軟件對(duì)免疫熒光照片進(jìn)行分析。

    2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    3 結(jié)果

    3.1 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

    如表2所示,葛根芩連湯及其配伍在5.0~25.0 μg/mL時(shí),Caco-2細(xì)胞存活率基本在80%及以上,說明Caco-2細(xì)胞未受到明顯影響。根據(jù)前期研究,GQ為18.75 μg/mL時(shí)[2],對(duì)Caco-2細(xì)胞損傷緩解作用較好,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中葛根芩連湯及其配伍組的質(zhì)量濃度設(shè)定為18.75 μg/mL。

    3.2 TNF-α對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

    如表3所示,Caco-2細(xì)胞給予10~80 μg/L的TNF-α處理時(shí),細(xì)胞存活率均大于80%,活性基本未見明顯影響。根據(jù)前期研究[2],80 μg/L TNF-α顯著誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,)mRNA的表達(dá),因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇80 μg/L TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。

    3.3 葛根芩連湯及配伍對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

    如表4所示,與對(duì)照組比較,TNF-α誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高(<0.01);經(jīng)藥物干預(yù)后,Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平均顯著降低(<0.01);與GQ組比較,WG組和QL組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(<0.01)。

    組別劑量/(μg·mL?1)細(xì)胞存活率/%組別劑量/(μg·mL?1)細(xì)胞存活率/% GQ5.091.29±1.49GG5.0110.36±1.07 12.592.65±0.85 12.5103.39±0.82 25.079.76±0.53 25.090.46±1.22 50.060.08±0.51 50.074.03±1.74 100.048.23±0.53 100.043.23±0.48 200.09.62±0.03 200.013.20±1.09 WGC5.094.79±0.33QL5.095.21±1.17 12.597.92±1.04 12.595.83±1.06 25.080.59±1.36 25.079.74±1.43 50.067.43±0.55 50.058.20±0.30 100.048.02±0.71 100.033.20±0.43 200.08.41±0.05 200.09.37±0.03 WG5.094.65±2.28 12.583.99±1.71 25.080.42±0.32 50.064.47±0.44 100.048.34±0.82 200.09.46±0.17

    表3 TNF-α對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響(, n = 3)

    表4 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響(, n = 3)

    與對(duì)照組比較:**<0.01;與TNF-α組比較:#<0.05##<0.01;與GQ組比較:&<0.05&&<0.01,下表同

    **< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01TNF-α group;&< 0.05&&< 0.01GQ group, same as below tables

    3.4 葛根芩連湯及配伍對(duì)細(xì)胞內(nèi)T-SOD活性和MDA、GSH水平的影響

    如表5所示,與對(duì)照組比較,TNF-α組細(xì)胞中MDA水平顯著升高(<0.01),T-SOD活性和GSH水平顯著降低(<0.01);與對(duì)照組比較,小檗堿組、GQ組、WGC組和GG組MDA水平顯著降低(<0.01),GSH水平顯著升高(<0.01);與GQ組比較,WG組和QL組MDA水平顯著升高(<0.01),GSH水平顯著降低(<0.01)。

    3.5 葛根芩連湯及配伍對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA表達(dá)的影響

    如表6所示,與對(duì)照組比較,TNF-α組mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì),和mRNA表達(dá)水平均明顯降低(<0.01);與TNF-α組比較,小檗堿組、GQ組、WGC組、GG組和QL組mRNA表達(dá)水平均顯著升高(<0.05、0.01),GQ組和WGC組mRNA表達(dá)水平均顯著升高(<0.05、0.01),GQ組和GG組mRNA表達(dá)水平均顯著升高(<0.05、0.01);與GQ組比較,WGC組、WG組、GG組和QL組和mRNA表達(dá)水平均明顯降低(<0.01),WGC組、WG組和QL組mRNA表達(dá)水平均明顯降低(<0.01)。

    表5 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞中T-SOD活性和MDA、GSH水平的影響(, n = 3)

    表6 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

    3.6 葛根芩連湯及配伍對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)的影響

    如圖1和表7所示,與對(duì)照組比較,TNF-α組NQO1蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì),Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平均明顯降低(<0.01);與TNF-α組比較,小檗堿組、GQ組、WGC組、WG組和GG組Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高(<0.01),小檗堿組、GQ組、WGC組和GG組NQO1蛋白表達(dá)水平顯著升高(<0.05、0.01);與GQ組比較,QL組Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)水平均明顯降低(<0.05、0.01)。

    圖1 各組Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)情況

    3.7 葛根芩連湯及配伍對(duì)Nrf2蛋白入核影響

    如圖2和表8所示,與對(duì)照組比較,TNF-α組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白陽性表達(dá)呈下降趨勢(shì);與TNF-α組比較,小檗堿組、GQ組、WGC組和GG組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白陽性表達(dá)明顯增加(<0.05、0.01)。

    表7 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

    圖2 各組Caco-2細(xì)胞中Nrf2蛋白入核情況 (×400)

    表8 各組Caco-2細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá) (, n = 3)

    4 討論

    研究發(fā)現(xiàn),葛根芩連湯可上調(diào)Nrf2信號(hào)通路緩解TNF-α誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和潰瘍性結(jié)腸炎大鼠病理損傷[1-2]。本課題組在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中初步探討了葛根芩連湯抗氧化應(yīng)激作用的配伍規(guī)律,發(fā)現(xiàn)組方中缺少君藥葛根或僅有臣藥黃芩和黃連對(duì)減輕氧化應(yīng)激損傷作用有較大影響[1]。因此,本研究以TNF-α誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷,進(jìn)一步探討葛根芩連湯抗氧化應(yīng)激作用的配伍規(guī)律。

    TNF-α可以激活炎癥反應(yīng),引起氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致ROS產(chǎn)生大量增加[19-20]。ROS的增加會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸氧化,進(jìn)而造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞毒性。MDA為ROS與細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物[21],其含量可以間接反映脂質(zhì)過氧化程度。本研究結(jié)果顯示,葛根芩連湯及不同配伍組均可以顯著降低TNF-α引起的ROS含量增加,但去葛根組和黃芩黃連組降低ROS含量的作用比全方組弱且有顯著性差異。去葛根組和黃芩黃連組對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MDA含量增加無明顯降低作用。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[1]中,去葛根組對(duì)大鼠血清中MDA含量的降低明顯弱于全方組。表明全方中君藥葛根對(duì)于降低過氧化物含量起重要作用。

    SOD可以清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的超氧化陰離子和自由基[22],GSH可以保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能免受過氧化氫的氧化損傷[23]。SOD活性和GSH水平降低會(huì)導(dǎo)致自由基堆積[24]。本研究結(jié)構(gòu)顯示,給予藥物干預(yù)后,TNF-α引起的T-SOD活性和GSH水平下降得到了改善,但去甘草組和去葛根組T-SOD活性與對(duì)照組相比具有顯著性差異,去葛根組和黃芩黃連組對(duì)GSH的作用明顯低于全方組。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[1]中,去葛根組大鼠血清中T-SOD活性明顯低于對(duì)照組,黃芩黃連組GSH活性與全方組相比具有顯著性差異,與本研究結(jié)果基本一致。提示葛根芩連湯能夠促進(jìn)抗氧化酶活性,其中君藥葛根的作用較大。

    Nrf2是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)控因子,Nrf2的激活可以抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),減少細(xì)胞凋亡[12,23-24]。NQO1同時(shí)也是輔酶Q(泛醌)和維生素E的還原酶,可通過維持輔酶Q和維生素E的還原狀態(tài)來發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[1-2]。HO-1是血紅素生成膽綠素、一氧化碳和鐵離子的限速酶[22-23]。NQO1和HO-1是體內(nèi)重要的II相解毒酶和抗氧化劑,在體內(nèi)發(fā)揮著重要的抗氧化作用。本研究結(jié)果顯示,葛根芩連湯及配伍對(duì)TNF-α引起的、和mRNA和蛋白表達(dá)降低均有一定的恢復(fù)作用。其中對(duì)mRNA的促進(jìn)作用,其他配伍組均弱于全方組,黃芩黃連組Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)明顯低于全方組,與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[1]。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究藥物對(duì)Nrf2蛋白入核的影響,發(fā)現(xiàn)去葛根組和黃芩黃連組對(duì)TNF-α導(dǎo)致的Nrf2蛋白入核減少?zèng)]有明顯改變。上述結(jié)果證實(shí)缺少葛根的配伍組激活Nrf2信號(hào)通路作用較弱。

    本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),對(duì)于TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷,葛根素、黃芩苷、小檗堿和甘草苷均具有一定的抑制作用,其中葛根素和小檗堿的抗氧化應(yīng)激作用相對(duì)較好[2]。本研究以小檗堿為陽性對(duì)照藥物,質(zhì)量濃度為6.73 μg/mL,但去葛根組和黃芩黃連組中所含小檗堿僅有0.13和0.03 μg/mL,因此去葛根組和黃芩黃連組盡管含小檗堿成分,由于含量低導(dǎo)致其抗氧化應(yīng)激作用與全方組相比有明顯差異,同時(shí)這2個(gè)配伍組又不含有葛根素,這也是抗氧化應(yīng)激作用弱的又一原因。

    以上研究結(jié)果表明,葛根芩連湯及不同配伍對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷均有一定的抑制作用。綜合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[1]結(jié)果,方中缺少君藥葛根對(duì)抗氧化應(yīng)激作用有明顯影響。然而葛根芩連湯抑制氧化應(yīng)激損傷的配伍規(guī)律及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還有待通過在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。本課題組將進(jìn)一步展開葛根芩連湯抗氧化應(yīng)激損傷的有效成分研究,深入探討葛根芩連湯配伍規(guī)律的物質(zhì)基礎(chǔ)。

    利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

    [1] 林川, 王菲, 王鴻卿, 等. 葛根芩連湯及配伍調(diào)控Nrf2/NQO1信號(hào)通路抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠氧化應(yīng)激損傷 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2022, 28(13): 19-27.

    [2] Lin C, Zhou Z H, Zhang L J,. Gegen Qinlian Decoction relieves ulcerative colitis via adjusting dysregulated Nrf2/ARE signaling [J]., 2022, 2022: 2934552.

    [3] 王婷婷, 安叡, 梁琨, 等. 基于UPLC-LTQ-Orbitrap高分辨質(zhì)譜的葛根芩連湯的化學(xué)成分分析 [J]. 中草藥, 2020, 51(6): 1498-1507.

    [4] 張藝竹, 安叡, 袁瑾, 等. 基于藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析比較葛根芩連湯的不同配伍腸吸收特性 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 48(10): 1611-1617.

    [5] 顧青青, 邵以諾, 安叡, 等. 葛根芩連湯有效成分對(duì)黃芩苷在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 [J]. 中成藥, 2015, 37(4): 694-699.

    [6] 陳燁, 袁瑾, 王新宏, 等. 葛根芩連湯及不同配伍對(duì)肝細(xì)胞色素P450酶的影響 [J]. 中成藥, 2013, 35(8): 1593-1598.

    [7] 張華, 安叡, 徐冉馳, 等. 葛根芩連湯及不同配伍組中生物堿類成分的腸外翻吸收研究 [J]. 中成藥, 2012, 34(4): 620-625.

    [8] 張華, 安叡, 徐冉馳, 等. UPLC快速測(cè)定葛根芩連湯腸外翻囊樣品中6個(gè)黃酮類成分含量 [J]. 藥物分析雜志, 2012, 32(1): 15-19.

    [9] 張華, 安叡, 徐冉馳, 等. 葛根芩連湯及不同配伍組中黃酮類成分的腸外翻吸收研究 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2011, 36(23): 3332-3337.

    [10] 陳陽, 陸杰, 朱思敏, 等. 基于高通量測(cè)序技術(shù)研究葛根芩連湯及其配伍對(duì)急性腸炎大鼠腸道菌群多樣性的影響 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2020, 45(6): 1406-1417.

    [11] 安叡, 張華, 張藝竹, 等. 采用在體單向腸灌流模型研究葛根芩連湯不同配伍組主要指標(biāo)成分的腸吸收特性 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 47(12): 1696-1702.

    [12] 秦劭晨, 王愛梅, 李若瑜. 茯苓酸對(duì)TNF-α誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞炎癥氧化應(yīng)激反應(yīng)和凋亡的拮抗作用研究 [J]. 中國(guó)中醫(yī)藥科技, 2019, 26(6): 854-858.

    [13] 鄭曉珂, 劉彩霞, 翟英英, 等. 卷柏中穗花杉雙黃酮對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 48(9): 1503-1509.

    [14] 王雪純, 陳麗, 曹旭梅, 等. 落地生根凍干粉對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響 [J]. 中藥材, 2022, 45(3): 726-731.

    [15] 陳曉雷, 陳思如, 修光輝, 等. 高遷移率族蛋白B1在脂多糖誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞上皮屏障損傷中的作用 [J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志, 2021, 30(3): 287-292.

    [16] 何萍萍, 鄭雅君, 鄭明靜, 等. 紅毛藻多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 [J]. 食品科學(xué), 2021, 42(17): 113-120.

    [17] Lu J Z, Ye D, Ma B L. Constituents, pharmacokinetics, and pharmacology of Gegen-Qinlian Decoction [J]., 2021, 12: 668418.

    [18] Chen Y R, Zhang P, Chen W R,. Ferroptosis mediated DSS-induced ulcerative colitis associated with Nrf2/HO-1 signaling pathway [J]., 2020, 225: 9-15.

    [19] Wang X H, Dai C, Wang J,. Therapeutic effect of neohesperidin on TNF-α-stimulated human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes [J]., 2021, 19(10): 741-749.

    [20] 賀佳林, 胡瑞成, 戴愛國(guó). COPD大鼠肺組織和骨骼肌中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量變化 [J]. 國(guó)際呼吸雜志, 2020, 40(20): 1537-1542.

    [21] He M H, Pan H, Chang R C C,. Activation of the Nrf2/HO-1 antioxidant pathway contributes to the protective effects ofpolysaccharides in the rodentafter ischemia-reperfusion-induced damage [J]., 2014, 9(1): e84800.

    [22] Weerachayaphorn J, Mennone A, Soroka C J,. Nuclear factor-E2-related factor 2 is a major determinant of bile acid homeostasis in the liver and intestine [J]., 2012, 302(9): G925-G936.

    [23] Hu T X, Wei G, Xi M M,. Synergistic cardioprotective effects of Danshensu and hydroxysafflor yellow A against myocardial ischemia-reperfusion injury are mediated through the Akt/Nrf2/HO-1 pathway [J]., 2016, 38(1): 83-94.

    [24] Li J Q, Ichikawa T, Janicki J S,. Targeting the Nrf2 pathway against cardiovascular disease [J]., 2009, 13(7): 785-794.

    Combination rule of Gegen Qinlian Decoction on inhibiting oxidative damage stimulated by TNF-α in Caco-2 cells

    LIN Chuan1, DONG Wen-min2, ZHANG Qian-yun1, LIU Wang-zhenzu1, LIANG Kun1, WANG Xin-hong1, AN Rui1

    1. School of Pharmacy, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 2. Pudong Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 201200, China

    To investigate the effect of Gegen Qinlian Decoction (葛根芩連湯) on relieving tumor necrosis factor-α (TNF-α)-induced oxidative stress injury in human colon cancer Caco-2 cells and its compatibility.Caco-2 cells were randomly divided into control group, TNF-α (80 μg/L) group, berberine (6.73 μg/mL) group and Gegen Qinlian Decoction compatibility group [Gegen Qinlian group (GD), Gancao (et) absent group (WGC), Gegen () absent group (WG),-etgroup (GG), Huangqin ()-Huanglian () group (QL), 18.75 μg/mL]. Except for the control group, cells in other groups were pretreated with TNF-α for 2 h, and then treated with corresponding drugs for 24 h. Caco-2 cell viability was detected by MTT; Intracellular reactive oxygen species (ROS) level were detected by flow cytometry; Total superoxide dismutase (T-SOD) activity and malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) levels were detected by colorimetry; qRT-PCR and Western blotting were used to detect nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), NAD(P)H quinine oxidoreductase 1 (NQO1) and heme oxygenase-1 (HO-1) mRNA and protein expressions; Fluorescence microscope was used to observe nuclear penetration of Nrf2 protein.5.0—25.0 μg/mL drug-containing medium and 10—80 μg/L TNF-α had no significant effect on the viability of Caco-2 cells. Compared with TNF-α group, ROS level in Caco-2 cells of each administration group were significantly decreased (< 0.01). Except for WG group and QL group, MDA level in the other groups were significantly decreased (< 0.01), and GSH level was significantly decreased (< 0.01).gene expression was significantly increased in all drug-administered groups except WG group (< 0.01), andgene expression was significantly increased in GD group and WGC group (< 0.05, 0.01),gene expression was significantly increased in GD group and GG group (< 0.05, 0.01). Except for QL group, protein expressions of Nrf2 and HO-1 in other groups were significantly increased (< 0.01); Except for WG group and QL group, NQO1 protein expression was significantly increased in the other groups (< 0.05, 0.01), and Nrf2 protein into the nucleus was significantly increased (< 0.05, 0.01).The lack ofhas a negative effect on the inhibition of oxidative stress injury of Caco-2 cells by Gegen Qinlian Decoction.

    Gegen Qinlian Decoction;; compatibility of medicines; oxidative stress; colon cancer cells

    R285.5

    A

    0253 - 2670(2022)20 - 6492 - 08

    10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.021

    2022-07-15

    上海市科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(19ZR1451900)

    林 川,男,碩士研究生,從事藥物分析與體內(nèi)過程研究。Tel: 19821726781 E-mail: 3325892608@qq.com

    安 叡,女,博士,教授,從事藥物分析與體內(nèi)過程研究。Tel: (021)51322183 E-mail: anruimw@126.com

    [責(zé)任編輯 李亞楠]

    猜你喜歡
    連湯葛根芩葛根
    The role of intestinal flora on tumorigenesis, progression,and the efficacy of PD-1/PD-L1 antibodies in colorectal cancer
    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討葛根芩連湯治療放射性腸炎的作用機(jī)制
    藥食兩用話葛根
    頸椎病良方葛根湯
    葛根芩連丸UPLC指紋圖譜建立及7種成分測(cè)定
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:53
    Self-Consistent Sources Extensions of Modified Differential-Difference KP Equation?
    葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究進(jìn)展※
    葛根芩連湯治療腹瀉的相關(guān)研究
    父子吃貨
    葛根芩連湯及其加減方治療小兒腹瀉的統(tǒng)計(jì)分析
    2018国产大陆天天弄谢| 看黄色毛片网站| 日韩亚洲欧美综合| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久午夜福利片| 午夜爱爱视频在线播放| 日韩亚洲欧美综合| 丰满少妇做爰视频| 男女无遮挡免费网站观看| 国产精品久久久久久av不卡| 不卡视频在线观看欧美| 熟妇人妻不卡中文字幕| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产视频首页在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产精品久久久久久精品电影小说 | 精品人妻偷拍中文字幕| 22中文网久久字幕| 亚洲自拍偷在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日韩制服骚丝袜av| 精品久久国产蜜桃| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久6这里有精品| 日韩亚洲欧美综合| 又爽又黄无遮挡网站| av在线app专区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| av在线亚洲专区| 欧美最新免费一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 久久99精品国语久久久| 免费电影在线观看免费观看| videossex国产| 亚洲不卡免费看| 国产精品.久久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 97热精品久久久久久| 别揉我奶头 嗯啊视频| 伦理电影大哥的女人| 国产一区二区在线观看日韩| 国产免费一区二区三区四区乱码| av在线老鸭窝| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲av.av天堂| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| av在线老鸭窝| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产 一区精品| 国产精品精品国产色婷婷| 97精品久久久久久久久久精品| 久久久a久久爽久久v久久| 久久女婷五月综合色啪小说 | 久久精品夜色国产| 国产午夜精品一二区理论片| 国产精品无大码| 亚洲av.av天堂| 一边亲一边摸免费视频| 久久精品国产亚洲网站| 国产伦理片在线播放av一区| 国产精品成人在线| 欧美性感艳星| 一级av片app| 久久久久久久久久成人| 欧美日韩视频精品一区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产精品福利在线免费观看| 91久久精品国产一区二区成人| 一区二区三区免费毛片| 久久久久久久国产电影| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲av中文av极速乱| 中国国产av一级| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 成人黄色视频免费在线看| 午夜免费鲁丝| 国产精品蜜桃在线观看| 国产有黄有色有爽视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 热99国产精品久久久久久7| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 身体一侧抽搐| 五月玫瑰六月丁香| 精品人妻熟女av久视频| 伦精品一区二区三区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 直男gayav资源| 熟女av电影| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩强制内射视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 成年版毛片免费区| 久久久久久久久大av| 春色校园在线视频观看| 赤兔流量卡办理| 午夜福利在线在线| 视频中文字幕在线观看| 亚洲图色成人| 国产av码专区亚洲av| 精品午夜福利在线看| 国产片特级美女逼逼视频| 国产淫语在线视频| 国产真实伦视频高清在线观看| 嫩草影院新地址| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 97在线视频观看| 色视频www国产| 91狼人影院| 精华霜和精华液先用哪个| 卡戴珊不雅视频在线播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 中文字幕av成人在线电影| 成人特级av手机在线观看| 99久久精品国产国产毛片| a级毛色黄片| 国产免费又黄又爽又色| 日韩欧美精品v在线| 久久精品人妻少妇| 久久久久久久国产电影| 白带黄色成豆腐渣| 国产高清有码在线观看视频| 久久6这里有精品| 国产高清有码在线观看视频| 一本一本综合久久| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产毛片在线视频| 日韩欧美一区视频在线观看 | 亚洲美女视频黄频| 我要看日韩黄色一级片| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久精品国产亚洲网站| 日韩电影二区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 91aial.com中文字幕在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 日本一二三区视频观看| 高清毛片免费看| 午夜免费观看性视频| 在线天堂最新版资源| 最近最新中文字幕免费大全7| 插阴视频在线观看视频| 91精品国产九色| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲综合色惰| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 一级毛片我不卡| 国产精品99久久99久久久不卡 | 中文字幕免费在线视频6| 国产精品99久久久久久久久| 午夜日本视频在线| 久久久精品94久久精品| 亚洲四区av| 乱系列少妇在线播放| 中文字幕久久专区| 亚洲欧美精品自产自拍| 99热网站在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 在线 av 中文字幕| 黄色欧美视频在线观看| 国产永久视频网站| 少妇丰满av| 午夜免费鲁丝| 美女高潮的动态| 熟女av电影| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 91久久精品电影网| 亚洲怡红院男人天堂| 天美传媒精品一区二区| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩一区二区视频免费看| 欧美日韩综合久久久久久| 国产精品av视频在线免费观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品久久久久久久久免| 欧美激情国产日韩精品一区| 一区二区三区精品91| 欧美一区二区亚洲| 韩国高清视频一区二区三区| 国产伦理片在线播放av一区| 免费看a级黄色片| 我要看日韩黄色一级片| 又爽又黄无遮挡网站| 精品少妇黑人巨大在线播放| 成人黄色视频免费在线看| 综合色丁香网| 国产精品一二三区在线看| 国产在线男女| 少妇高潮的动态图| 精品久久久久久久久亚洲| 色播亚洲综合网| 高清在线视频一区二区三区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲国产精品成人久久小说| 国产av国产精品国产| 麻豆乱淫一区二区| 欧美激情久久久久久爽电影| 1000部很黄的大片| 国产一区亚洲一区在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产伦精品一区二区三区四那| 性色av一级| 国产成人freesex在线| 哪个播放器可以免费观看大片| 大片电影免费在线观看免费| 日韩免费高清中文字幕av| 高清在线视频一区二区三区| 夫妻性生交免费视频一级片| 七月丁香在线播放| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 久久人人爽人人片av| 天堂网av新在线| 午夜福利网站1000一区二区三区| 色哟哟·www| 少妇 在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲色图综合在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 少妇高潮的动态图| 99热网站在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 精品视频人人做人人爽| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 高清av免费在线| 在线免费观看不下载黄p国产| 18+在线观看网站| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 我要看日韩黄色一级片| 久久久久性生活片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久精品国产自在天天线| 国产免费福利视频在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日韩免费高清中文字幕av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 亚洲成色77777| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 九草在线视频观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 天天躁日日操中文字幕| 国产成人精品一,二区| 日韩人妻高清精品专区| 深爱激情五月婷婷| 国产爽快片一区二区三区| .国产精品久久| 中国三级夫妇交换| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 秋霞伦理黄片| 只有这里有精品99| 免费观看无遮挡的男女| av在线老鸭窝| 中文字幕av成人在线电影| 日本爱情动作片www.在线观看| 高清毛片免费看| 精品人妻偷拍中文字幕| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 熟妇人妻不卡中文字幕| av免费观看日本| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲国产高清在线一区二区三| 欧美zozozo另类| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品久久久久久久久av| 国产日韩欧美在线精品| 一本色道久久久久久精品综合| 国产一级毛片在线| 中文欧美无线码| 在线免费十八禁| 成人亚洲欧美一区二区av| 日本av手机在线免费观看| 赤兔流量卡办理| 亚洲国产欧美在线一区| 99热这里只有是精品50| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 水蜜桃什么品种好| 22中文网久久字幕| 国产精品一区www在线观看| 熟女电影av网| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲,欧美,日韩| 一级毛片电影观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日本三级黄在线观看| av免费观看日本| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 成人毛片60女人毛片免费| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲国产日韩一区二区| 免费观看性生交大片5| 18+在线观看网站| 一边亲一边摸免费视频| 免费人成在线观看视频色| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲人成网站在线播| 亚洲自拍偷在线| 亚洲精品第二区| 1000部很黄的大片| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲av二区三区四区| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 日韩av不卡免费在线播放| 男人和女人高潮做爰伦理| 最近中文字幕2019免费版| 一个人观看的视频www高清免费观看| 尾随美女入室| 丰满乱子伦码专区| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美97在线视频| 97超视频在线观看视频| 在线观看一区二区三区激情| 国产一区亚洲一区在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲精品成人久久久久久| 日本黄色片子视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 少妇熟女欧美另类| 男的添女的下面高潮视频| 国产亚洲精品久久久com| 插逼视频在线观看| 一本久久精品| 大陆偷拍与自拍| 国产成人a∨麻豆精品| 黄色配什么色好看| 色播亚洲综合网| 国产毛片a区久久久久| 嫩草影院新地址| 特级一级黄色大片| 观看美女的网站| kizo精华| 超碰av人人做人人爽久久| 欧美高清成人免费视频www| 丰满乱子伦码专区| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲精品国产成人久久av| 久久久精品免费免费高清| 少妇的逼好多水| 男女无遮挡免费网站观看| 午夜激情久久久久久久| 精品视频人人做人人爽| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 午夜免费鲁丝| 十八禁网站网址无遮挡 | a级毛片免费高清观看在线播放| 国产色婷婷99| 麻豆国产97在线/欧美| 内地一区二区视频在线| 亚洲综合色惰| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲自偷自拍三级| 成人欧美大片| 激情 狠狠 欧美| 午夜免费男女啪啪视频观看| 偷拍熟女少妇极品色| 色5月婷婷丁香| 欧美性感艳星| 国产伦在线观看视频一区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲国产欧美在线一区| 如何舔出高潮| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲四区av| 可以在线观看毛片的网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 永久网站在线| 久久6这里有精品| 少妇的逼水好多| 日韩精品有码人妻一区| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲精品乱久久久久久| 免费在线观看成人毛片| 伊人久久精品亚洲午夜| 97超视频在线观看视频| av女优亚洲男人天堂| 少妇高潮的动态图| 嫩草影院精品99| 乱码一卡2卡4卡精品| 婷婷色综合大香蕉| 99热全是精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产精品久久久久久精品古装| 国产午夜福利久久久久久| 久久韩国三级中文字幕| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 大片电影免费在线观看免费| av线在线观看网站| 亚洲欧美精品专区久久| 久久久久精品性色| 九九在线视频观看精品| 天美传媒精品一区二区| 午夜免费观看性视频| 亚洲av免费在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品偷伦视频观看了| 国产 精品1| 寂寞人妻少妇视频99o| 丰满少妇做爰视频| 久久鲁丝午夜福利片| 国产av不卡久久| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产午夜福利久久久久久| 国产成人免费无遮挡视频| av在线亚洲专区| 国产黄a三级三级三级人| 国产 一区 欧美 日韩| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久精品久久久久久久性| 日韩av不卡免费在线播放| 久久久色成人| 最近中文字幕2019免费版| 六月丁香七月| 网址你懂的国产日韩在线| 国产av国产精品国产| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产黄片视频在线免费观看| 久久久精品免费免费高清| 日韩av免费高清视频| 久久精品国产亚洲av天美| 国产一区二区在线观看日韩| 国产69精品久久久久777片| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲精品国产av成人精品| h日本视频在线播放| 男女边吃奶边做爰视频| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲人与动物交配视频| 国产成人精品久久久久久| 性插视频无遮挡在线免费观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲精品国产成人久久av| 国产淫语在线视频| 国产成年人精品一区二区| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩欧美精品v在线| 日韩一区二区三区影片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线天堂最新版资源| 好男人视频免费观看在线| 久久鲁丝午夜福利片| 一级毛片久久久久久久久女| 人人妻人人看人人澡| 色哟哟·www| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日韩大片免费观看网站| 97在线人人人人妻| 精品国产三级普通话版| 晚上一个人看的免费电影| 午夜视频国产福利| 日本wwww免费看| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲av欧美aⅴ国产| 成人无遮挡网站| 三级经典国产精品| 深爱激情五月婷婷| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲国产欧美人成| 国产色婷婷99| 国产亚洲91精品色在线| 日本一本二区三区精品| 一本色道久久久久久精品综合| 又爽又黄a免费视频| 日韩制服骚丝袜av| 九九爱精品视频在线观看| av国产免费在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 熟女人妻精品中文字幕| 中文天堂在线官网| 久久久久精品性色| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 2021少妇久久久久久久久久久| 日本免费在线观看一区| 性色avwww在线观看| 波野结衣二区三区在线| 男男h啪啪无遮挡| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 69av精品久久久久久| 少妇高潮的动态图| 69av精品久久久久久| 白带黄色成豆腐渣| 欧美成人a在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 精品久久久精品久久久| 免费观看在线日韩| 一区二区三区免费毛片| 国产老妇女一区| 亚洲综合精品二区| 国产熟女欧美一区二区| videossex国产| 亚洲成人av在线免费| 亚洲精品影视一区二区三区av| 人妻一区二区av| 一级毛片久久久久久久久女| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 乱码一卡2卡4卡精品| 97超视频在线观看视频| 真实男女啪啪啪动态图| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产成人精品一,二区| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲人成网站在线观看播放| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 人妻一区二区av| av国产精品久久久久影院| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国模一区二区三区四区视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 边亲边吃奶的免费视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 两个人的视频大全免费| 国产精品女同一区二区软件| tube8黄色片| xxx大片免费视频| 中文字幕免费在线视频6| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产精品一二三区在线看| 日本色播在线视频| 香蕉精品网在线| 99热国产这里只有精品6| 国产在线一区二区三区精| 亚洲av男天堂| 日本一本二区三区精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| 秋霞伦理黄片| 国产高清国产精品国产三级 | 少妇的逼水好多| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 免费人成在线观看视频色| 亚洲欧洲日产国产| 久久这里有精品视频免费| 精品一区在线观看国产| 欧美日本视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 成年版毛片免费区| 成人无遮挡网站| 在线看a的网站| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产 一区精品| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美精品国产亚洲| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲成人av在线免费| 好男人在线观看高清免费视频| 国产高清三级在线| 26uuu在线亚洲综合色| 尤物成人国产欧美一区二区三区| av免费在线看不卡| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲伊人久久精品综合| 国产一区有黄有色的免费视频| 日韩av免费高清视频| 欧美日本视频| 国产高清有码在线观看视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 婷婷色综合大香蕉| 欧美极品一区二区三区四区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产伦精品一区二区三区四那| 校园人妻丝袜中文字幕| 色网站视频免费| 熟女人妻精品中文字幕| 婷婷色综合大香蕉| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产视频首页在线观看| 国产毛片a区久久久久| 一级毛片我不卡| 日韩av不卡免费在线播放| 91精品国产九色| 成人国产av品久久久| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 欧美成人午夜免费资源| 久久久久久伊人网av| 亚洲三级黄色毛片| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 久久热精品热| 美女内射精品一级片tv| 中文字幕久久专区| 99九九线精品视频在线观看视频| 伦理电影大哥的女人| 男插女下体视频免费在线播放| av网站免费在线观看视频| 麻豆乱淫一区二区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 久久久国产一区二区| 波多野结衣巨乳人妻| 91久久精品国产一区二区三区| 色综合色国产|