噬菌體對雞腸炎沙門氏菌的防治研究

呂興幫，郝 賀，張 博，張永英，石玉祥，鐘翠紅

（河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056000）

腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）可感染人和動物[1]。腸炎沙門氏菌是食源性疾病暴發(fā)的主要原因，感染后的畜禽可將細菌傳至其制品，與其他食物交叉感染造成食源性疾病傳播[2]?？股厥侵饕目咕幬?，但因抗生素廣泛使用，細菌的耐藥性正逐漸顯現(xiàn)[1]。在全球替抗的背景下，開發(fā)新型抗菌藥物成為熱點研究方向。

噬菌體是細菌的天然殺手，數(shù)量豐富、分布廣泛。噬菌體侵入細菌體內(nèi)進行自身繁殖，通過釋放酶類物質(zhì)裂解細菌，釋放子代噬菌體。因抗生素耐藥特異性與細菌互作性在多數(shù)細菌物種中的發(fā)展傳播，噬菌體療法再次受到人們的關注[3]，并應用于動物和人類的食源性、環(huán)境病原體的生物控制。對噬菌體生物學和遺傳學的深入研究，有助于探索噬菌體的進化規(guī)律并更好地解釋其與宿主細菌相互作用的分子機制。

1 腸炎沙門氏菌危害及耐藥性發(fā)展

歐美等國的食源性疾病多數(shù)由腸炎沙門氏菌引起，常造成數(shù)以千億的損失。據(jù)調(diào)查，僅在美國，腸道沙門氏菌每年引發(fā)約100 萬例食源性疾病[3]；歐盟成員國每年感染沙門氏菌病的患者約10～16萬人，沙門氏菌的發(fā)病率與蛋雞中存在的腸炎沙門氏菌顯著相關，表明雞蛋可能是引發(fā)人類疾病的主要感染源[4-5]。2012 年，Hulaj 等[6]對科索沃地區(qū)的39 個蛋雞養(yǎng)殖場進行抽樣檢測，發(fā)現(xiàn)49%的樣本中均存在沙門氏菌感染，占比最高的血清型是腸炎沙門氏菌；對所分離菌株的耐藥性分析顯示，所有菌株均對慶大霉素、氨芐西林、磺胺甲惡唑、土霉素敏感，其中29 株（97%）對環(huán)丙沙星敏感；所有菌株對二甲胺四環(huán)素和鄰氯青霉素均表現(xiàn)中度耐藥或耐藥，26株（86%）對阿莫西林中度耐藥，27 株（90%）對鏈霉素完全耐藥。Wei 等[7]對我國貴州省2011～2016年間發(fā)生的食源性疾病病例進行病原菌分離，對分離得到的16株臨床菌株進行檢測，發(fā)現(xiàn)所有菌株至少對一種抗生素耐藥性，耐藥率最高的是萘啶酸（98.7%），多數(shù)分離株（92.4%）對環(huán)丙沙星的敏感性降低，同時觀察到細菌對第3、4代頭孢菌素耐藥。腸炎沙門氏菌已在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，抗生素可誘發(fā)細菌耐藥性產(chǎn)生，并且可對公共衛(wèi)生造成危害。因此，研發(fā)新型抗菌藥物對當前的家禽養(yǎng)殖具有重要意義。

2 噬菌體及其產(chǎn)物

噬菌體是一種細菌病毒，由蛋白外殼和內(nèi)部核酸構成，須寄生在活菌內(nèi)才可完成復制增殖。1982 年，國際病毒分類委員會規(guī)范了噬菌體的分類標準[8]，可根據(jù)蛋白質(zhì)結構分為有尾噬菌體、無尾噬菌體和絲狀噬菌體。其中，有尾噬菌體數(shù)量最多，常見的T系烈性噬菌體均屬有尾噬菌體；根據(jù)其核酸類型，可分為DNA或RNA[9]，大體上細分為ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA；根據(jù)其作用特點，可分為烈性噬菌體和溫和性噬菌體。烈性噬菌體可直接侵入細菌，在細菌內(nèi)部完成增殖并裂解宿主菌；溫和性噬菌體通過核酸整合，隨宿主菌共同分裂增殖，在特定的情況下裂解細胞。

噬菌體對靶細菌的裂解主要依靠自身產(chǎn)物-裂解酶。在裂解周期中，噬菌體在細菌宿主體內(nèi)表達其裂解基因，形成水解細菌細胞壁的裂解酶。裂解酶本質(zhì)是蛋白質(zhì)，與完整的噬菌體相比，可能更具有安全性[10]。裂解酶可直接作用于細菌，無需經(jīng)歷噬菌體的侵襲過程，但裂解酶的常規(guī)制備方法復雜，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)。因此，通常使用基因重組技術制備大量目的蛋白。此外，基因重組也能夠優(yōu)化裂解酶的作用特性，利用重組技術擴大裂解酶的裂解譜，進而增強裂解效果。

3 噬菌體侵染細菌的途徑

噬菌體侵染細菌的途徑即是裂解周期，包括吸附、核酸注射、病毒粒子組裝以及子代病毒的釋放。

（1）吸附：是噬菌體生命周期的關鍵步驟之一，需要細菌包膜上的宿主表面蛋白、脂多糖或其他分子（磷壁酸、菌毛、鞭毛）的特異性識別。細菌表面受體識別導致噬菌體粘附于細菌，允許滲透細菌包膜及注射病毒遺傳物質(zhì)。

噬菌體吸附通常包括初始接觸、可逆結合和不可逆附著。初始接觸涉及由布朗運動、分散、擴散或流動引起的噬菌體和宿主之間的隨機碰撞，表明噬菌體與細菌結合需要一定的數(shù)量關系；在可逆結合中，噬菌體與細菌表面成分的結合不是決定性的，噬菌體可從宿主中解吸，這一過程由Garen 等[11]噬菌體洗脫分離試驗確定；在不可逆結合中，噬菌體與細菌受體的結構域之間進行特異性連接，為之后的核酸注射創(chuàng)造條件。

（2）核酸注射：噬菌體將其核酸注射至細菌內(nèi)部需要一些裂解酶質(zhì)參與。噬菌體依靠其自身的裂解酶可裂解細菌細胞壁的肽聚糖，將自身核酸注入細胞。噬菌體的核酸接管細菌的合成系統(tǒng)，通過基因表達以合成噬菌體所需的核酸和蛋白質(zhì)[12]。

（3）病毒粒子組裝：噬菌體基因組指導宿主細胞合成相應的結構蛋白和子代病毒核酸，核酸經(jīng)由機構蛋白包裹，形成頭部-尾絲及尾部的其他部件，頭尾結合，連接尾絲，組裝得到1個形狀和大小相同的成熟噬菌體。

（4）子代病毒釋放：子代噬菌體組裝完成，由胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞外，再次侵染宿主細胞，開始新一輪的復制周期。烈性噬菌體以溶解細胞的形式釋放，通常一個噬菌體經(jīng)過一輪裂解周期，可產(chǎn)生100～300個子代噬菌體。溫和性噬菌體通常隨宿主細胞進行同步遺傳復制，這一過程不會裂解宿主細胞。

4 噬菌體于腸炎沙門氏菌的應用進展

噬菌體的發(fā)展歷史久遠，但應用條件較為苛刻，需要與靶細菌進行特異性識別；且噬菌體進入體內(nèi)的作用機制尚未得到完全闡釋，可能對機體存在潛在威脅。目前，噬菌體重獲關注，噬菌體的研究與發(fā)展得到極大推動，應用涉及多個領域，如疾病防控、環(huán)境消毒以及細菌檢測。

4.1 噬菌體的防控效果

有研究表明，家禽長期使用噬菌體在減少寄生在消化道的沙門氏菌病原體數(shù)量方面具有良好效果。王曦等[13]通過糞便移植與噬菌體聯(lián)合治療，降低了經(jīng)沙門氏菌感染的雛雞死亡率，緩解了雛雞腸道炎癥損傷。Ahmadi等[14]在攻毒前對鵪鶉進行噬菌體灌胃，發(fā)現(xiàn)噬菌體可降低體內(nèi)腸炎沙門氏菌的數(shù)量。Wernicki 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，通過氣溶膠噴霧消毒和口服接種噬菌體均可減弱腸炎沙門氏菌對肉雞的感染。腸炎沙門氏菌可通過垂直傳播。因此，被多重耐藥菌污染的雞蛋也是危害人類健康和公共衛(wèi)生安全的潛在隱患。Sonalika等[16]將雞蛋浸泡在菌液中進行細菌接種，發(fā)現(xiàn)在雞蛋表面施用噬菌體可使雞蛋表面的細菌數(shù)量減少2×106CFU/mL。

4.2 噬菌體的消毒作用

與抗生素相比，噬菌體對環(huán)境幾乎沒有損害，可考慮使用噬菌體作為環(huán)境消毒劑。于曉妍等[17]研究顯示，經(jīng)大腸桿菌噬菌體噴霧30 min，雞舍內(nèi)消毒區(qū)域的細菌數(shù)量比對照組低99%。錢新杰等[18]以大腸桿菌噬菌體對地面細菌進行噴霧消毒，結果表明，與對照組相比，經(jīng)噬菌體PNJ1809-11 處理的地面殘留菌落數(shù)量下降約2.5 個數(shù)量級，AB9殺滅效率為99.32%；經(jīng)噬菌體PNJ1809-13處理的地面菌落數(shù)量下降約1個數(shù)量級，殺滅效率為91.23%。綜上所述，噬菌體具有作為消毒劑的潛力，可為家禽生產(chǎn)中的沙門氏菌提供新的消毒策略。

4.3 噬菌體的檢測技術

噬菌體因?qū)λ拗鞲叨让舾泻吞禺愋詰糜诩毦臋z測。有些測定方法利用噬菌體裂解檢測細菌的胞內(nèi)成分，或以此產(chǎn)生的環(huán)境變化為細菌存在標記；其他方法則通過檢測噬菌體的繁殖情況，作為目標細菌的存在信號[19]。

Garrido 等[20]研究表明，建立沙門氏菌噬菌體B_SenS_PVP-SE2 擴增與qPCR 結合的方法檢測雞樣本，可檢測到低濃度的活菌，節(jié)省了大量時間，提高靈敏度和準確性。隨著分子生物學技術發(fā)展，基因工程噬菌體已成為監(jiān)測和檢測細菌病原體的有力工具。這種技術可應用于檢測污染食品中的細菌，具有較高的選擇性和靈敏度[21]。Kim等[22]采用完整的luxABCDE操縱子檢測不同食物基質(zhì)中的沙門氏菌。此方法還可應用于沙門氏菌的診斷和快速檢測。Choi 等[23]利用較高特異性及穩(wěn)定性的KFS-SE2 噬菌體作為生物傳感器的生物受體。此方法也可快速且準確地檢測農(nóng)產(chǎn)品上的腸炎沙門氏菌。

5 噬菌體的應用前景

5.1 噬菌體應用的優(yōu)勢

（1）高度特異性：噬菌體因具有高度特異性成為替抗藥物。但與抗生素廣譜殺菌不同，噬菌體只靶向作用于腸道中特定的病原菌，對其他菌株無裂解作用，不會破壞區(qū)域中的其他微生菌群[24]。噬菌體只在宿主菌中增殖分裂，噬菌體的所有宿主被裂解，噬菌體會被自動清除。

（2）高效性：噬菌體借助宿主細菌代謝系統(tǒng)實現(xiàn)自我維持。噬菌體藥物動力學表明，噬菌體經(jīng)歷1個感染周期可產(chǎn)生200 個子代噬菌體，當完成4 個感染周期，1 個噬菌體顆?？僧a(chǎn)生數(shù)十億個子代噬菌體。因此，小劑量的噬菌體制劑即可清除宿主細菌，而抗生素往往需要多次用藥，維持在一定濃度才能達到預期治療效果[25-26]。

（3）適應性：抗生素的殺菌成分相對固定，無法應對細菌的持續(xù)進化，治療耐藥菌存在一定的局限性。噬菌體作為一種活體微生物，可以同細菌共同進化，并且還可以適應抗性菌株，防止耐藥菌的生物膜形成或清除預先形成的生物膜[27]。

5.2 噬菌體應用的局限性

（1）作用機制尚不明確：噬菌體和細菌之間的分子機制以及噬菌體在體內(nèi)的行為仍不完全明晰。噬菌體可在宿主體內(nèi)繁殖，根據(jù)所處環(huán)境的變化，也可能發(fā)生變異。這種變異結果無法判斷。噬菌體藥動學和藥效學仍需進一步探索。因此，治療各種類型感染的噬菌體產(chǎn)品的最佳劑型尚未確定。

（2）免疫原性：基于病毒的生物學特性，盡管噬菌體不會感染人類細胞，但宿主的免疫系統(tǒng)可能會產(chǎn)生針對噬菌體的抗體，在噬菌體未作用細菌前將其清除。梁梅等[28]對噬菌體進行免疫原性試驗，結果表明，與對照組相比，噬菌體組中的小鼠血清可產(chǎn)生針對噬菌體的抗體，表明噬菌體具有一定免疫原性，可刺激機體產(chǎn)生中和抗體，這是噬菌體用藥需要克服的關鍵問題[29]。

（3）傳播耐藥基因：耐藥基因通常存在于各種可移動基因元件（MGE）當中，如質(zhì)粒、基因組島和轉(zhuǎn)座子，而水平基因轉(zhuǎn)移機制是食源性細菌病原體的抗生素抗性傳播增加的原因之一[30]。環(huán)境中的噬菌體（如污水、海洋、土壤）攜帶大量抗生素抗性基因ARGs，噬菌體可通過轉(zhuǎn)導作用將ARGs轉(zhuǎn)移至宿主細菌。上述結果表明，噬菌體在與細菌相互進化的過程中，具有轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的潛力，并且可能在抗生素耐藥傳播中發(fā)揮積極作用。因此，不應低估噬菌體對環(huán)耐藥基因的傳播[31]。

6 展望

腸炎沙門氏菌作為重要的食源性病原菌之一，對畜禽生產(chǎn)及人類生活具有重要的防護意義。噬菌體可特異性殺滅腸炎沙門氏菌并中斷其流行傳播，噬菌體分離的蛋白質(zhì)具有巨大的醫(yī)療潛力，可應用于環(huán)境消毒、食品保存、癌癥治療、疫苗開發(fā)、生物傳感裝置、治療基因和抗菌劑的靶向遞送等方面。但是，具體的作用機制仍未完全明晰。隨著科學的發(fā)展進步，噬菌體將作為一種生物制劑應用于畜禽甚至整個養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)防控，噬菌體技術的成熟與完善將對醫(yī)療產(chǎn)生重要的推動作用。