1 株產(chǎn)蛋白酶菌株的分離鑒定及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

盧麗媛，周麗艷，宋天悅，馬子豪，申青忠，周雪雁

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124）

蛋白酶是微生物產(chǎn)生的主要酶，廣泛應(yīng)用于食品、診斷試劑、皮革、藥物及護(hù)膚品等領(lǐng)域[1]。Lillian 等[2]篩選得到的BF20菌株具有溶栓能力；李奇[3]分離的沙蠶蛋白酶具有疏通血管的作用。這些蛋白酶均可有效地降解纖維蛋白原，在健康等領(lǐng)域具有很大的利用價(jià)值，且相對其他藥物更安全經(jīng)濟(jì)。蛋白酶對廢棄物的降解具有一定的優(yōu)勢，這種微生物降解方式相對于常規(guī)垃圾物的焚燒、深埋處理方式，可顯著緩解對環(huán)境的污染程度。張妮等[4]在廢棄物中獲得1株名為Gxun-30的菌株，其所產(chǎn)的角蛋白酶在最適產(chǎn)酶條件下幾乎可以使整根羽毛完全降解，該酶在酪蛋白肽和醫(yī)學(xué)用膠原材料的制備等領(lǐng)域同樣具有應(yīng)用價(jià)值。Tang等[5]從海水中分離的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌，可降解海洋中的有關(guān)物質(zhì)。蛋白酶還可縮短污泥的發(fā)酵周期[6]。近年來，我國蛋白酶的使用遍及各大產(chǎn)業(yè)[7]，尤其是微生物源堿性蛋白酶具有不可替代的作用，始終占據(jù)酶市場中的主導(dǎo)地位，約占洗滌劑產(chǎn)業(yè)的50%[8-10]。

本試驗(yàn)得到1 株芽孢桿菌，來自甘肅省甘南地區(qū)夏河縣的土壤，鑒定其為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。蘇云金芽孢桿菌雖為重要的微生物源蛋白酶，但國內(nèi)外卻少見有關(guān)其應(yīng)用于工業(yè)蛋白酶生產(chǎn)的報(bào)道。本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化蘇云金芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶條件，以期最大限度利用蘇云金芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

樣品采集于甘肅省夏河地區(qū)深度20～30 m處的土樣。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 液體培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L、胰化蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L。酪素培養(yǎng)基：KH2PO43.6 g、MgSO4·7H2O 5 g、ZnCl20.14 g、Na2HPO4·7H2O 10.7 g、NaCl 1.6 g、CaCl20.02 g、FeSO40.02 g、Trypticase 2 g、酪 素4 g、瓊 脂20 g/15 g、pH值6.5～7.0。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉40 g/L、豆粕粉30 g/L、Na2HPO44 g/L、KH2PO40.3 g/L。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

酵母提取粉、氯化鈉、胰化蛋白胨（OXOID 公司），瓊脂（北京索萊寶生物科技有限公司），NaOH（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），血清（蘭州民海生物工程有限公司），革蘭染色試劑（博精索拉博科技有限公司），細(xì)菌生化鑒定管（杭州微生物試劑有限公司），福林酚試劑（分析純，博精索拉博科技有限公司），干酪素（阿拉丁工業(yè)公司）。

1.1.4 儀器設(shè)備

YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、DHG-9146A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）、MOST-T蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）、AR224CN 電子天平（奧豪斯儀器常州有限公司）；IS-ROV1 立式恒溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）、13395H2XBME 顯微鏡（萊卡）、SW-CJ-1F 潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、Pico17 高速離心機(jī)（BioRad）、電泳儀（北京六一儀器設(shè)備）、微波爐（廣東格蘭仕）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株篩選與純化

使用滅菌蒸餾水稀釋少量樣品，梯度分別為10-1、10-2、10-3、10-4。取10-4土壤稀釋液200μL，均勻涂布于酪素固體培養(yǎng)基表面，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取分離平板培養(yǎng)基上透明水解圈直徑大小與菌落直徑大小之比大的菌落，并在酪素培養(yǎng)基上三區(qū)劃線進(jìn)行菌株的純化，放入恒溫箱，操作重復(fù)3次。將純化后的單菌落點(diǎn)種于酪素固體培養(yǎng)基上，37 ℃保存24 h，再次根據(jù)菌落水解圈與菌落之比，初步篩選高產(chǎn)蛋白酶菌株。

1.2.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

挑取已純化的單菌落菌株三區(qū)劃線，恒溫培養(yǎng)24 h，肉眼觀察該菌株的菌落特點(diǎn)，挑取目標(biāo)菌株革蘭氏染色并涂片，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)與特征。

1.2.3 生理生化鑒定

挑取目標(biāo)菌株放入LB 液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)24 h，搖床溫度設(shè)置為37 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min。以每管50μL 的量接種于生化管中，生化指標(biāo)包括VP 試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、明膠液化、淀粉水解等。根據(jù)說明書要求，對生化管進(jìn)行接種培養(yǎng)，觀察并記錄各管結(jié)果，繪制生化圖譜。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定

挑取目標(biāo)菌株至LB液體培養(yǎng)基，37 ℃180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)10 h，制得細(xì)菌培養(yǎng)液。使用1.5 mL離心管收集細(xì)菌培養(yǎng)液0.5 mL，12 000 r/min離心2 min，棄去上清液。使用快速提取試劑盒，提取菌株NWMCC0320基因組的DNA。

采用16S rRNA全長引物合成27F:5'-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'，1492R：5'GGTTACCTTGTTACGACT T-3'，擴(kuò)增細(xì)菌核糖體16S rDNA。

PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min，4 ℃保存。得到相應(yīng)的PCR 產(chǎn)物。產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序，獲得16S rDNA 序列。將所得序列上傳至數(shù)據(jù)庫GenBank，利用BLASTN程序?qū)y序所得16S rDNA 序列進(jìn)行同源性的比對，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建相應(yīng)的系統(tǒng)進(jìn)化樹[11]。

1.2.5 蛋白酶活力測定

于pH 值為9 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種菌株的單菌落，37 ℃180 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h，梯度離心發(fā)酵液備用。蛋白酶活力測定按照國標(biāo)QB 747—80方法進(jìn)行測定[12-13]。比較蛋白酶的產(chǎn)酶活力，以高產(chǎn)菌株作為目標(biāo)菌株。

1.3 產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)化培養(yǎng)

1.3.1 粗酶液的制備

于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中（pH 值自然）接種菌株的單菌落，37 ℃180 r/min搖床中培養(yǎng)10 h，制得種子液。

1.3.2 溫度對產(chǎn)蛋白酶的影響

將種子液（接種量為5%）接種于容量為50 mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，設(shè)置溫度梯度為25、30、35、40、45、50 ℃，放入180 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h，分別測定其產(chǎn)蛋白酶的活力。

1.3.3 初始pH值對產(chǎn)蛋白酶的影響

加入相同pH值的磷酸緩沖液分別調(diào)配液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH 值，設(shè)置pH 值梯度為5.5、6.5、7.5、8.5、9.0。調(diào)整好50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值，將種子液按照5%的接種量接入。同上優(yōu)化結(jié)果，180 r/min 搖床培養(yǎng)24 h，分別測定其產(chǎn)蛋白酶的活力。

1.3.4 氮源種類對產(chǎn)蛋白酶的影響

將4種不同的氮源（硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨、尿素），以濃度30 g/L 取代發(fā)酵培養(yǎng)基中的豆粕粉（30 g/L），接種至另一新的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中（接種量為5%）。溫度、pH值同上的優(yōu)化結(jié)果，置于180 r/min 搖床中培養(yǎng)24 h，分別測定其產(chǎn)蛋白酶的活力，所得結(jié)果則為該菌株產(chǎn)蛋白酶的最佳氮源種類。接著在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以10、20、30、40、50 g/L 的終濃度添加最佳氮源。同上優(yōu)化結(jié)果，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，分別測定其產(chǎn)蛋白酶的活力。

1.3.5 碳源種類對產(chǎn)蛋白酶的影響

5種碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、檸檬酸鈉）分別以濃度40 g/L 取代發(fā)酵培養(yǎng)基中的玉米粉（40 g/L），并接種至另一新的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中（接種量為5%）。溫度、pH值同上的優(yōu)化結(jié)果，放入180 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h，分別測定其產(chǎn)蛋白酶的活力，結(jié)果即為測定所得最佳碳源；在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以10、20、30、40、50 g/L 的終濃度添加最佳碳源，同上優(yōu)化結(jié)果，放入180 r/min 的搖床中培養(yǎng)24 h，分別測定其產(chǎn)蛋白酶的活力。

1.4 酶學(xué)性質(zhì)的探究

1.4.1 溫度對蛋白酶活性的影響

設(shè)置水浴鍋的溫度為：25、30、35、40、45、50 ℃。取1 mL 經(jīng)適度稀釋的粗酶液，與1 mL 的酪蛋白（pH 值9）一同水浴。10 min后，分別測定其產(chǎn)酶活力。蛋白酶活力測定依據(jù)國標(biāo)QB 747—80。

1.4.2 pH值對蛋白酶活性的影響

在上述最適條件下，使用不同pH 值的磷酸緩沖液進(jìn)行稀釋。適當(dāng)將磷酸緩沖液滴入，使粗酶液pH 值為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5。取稀釋液1 mL，與1 mL 相應(yīng)pH 值的酪蛋白在最適溫度條件下水浴反應(yīng)10 min，蛋白酶活力測定依據(jù)國標(biāo)QB 747—80。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

試驗(yàn)純化得到了4株菌株。通過點(diǎn)種法在酪素培養(yǎng)基上接種，所得4株菌的透明水解圈與菌落直徑比值結(jié)果見圖1、表1。

由圖1、表1 可知，NWMCC0320 菌株的比值最大，說明該菌株在酪蛋白平板上活性最高。使用福林酚法分別測定其產(chǎn)蛋白酶活力，對菌株進(jìn)行進(jìn)一步篩選，結(jié)果見圖2。

表1 菌株透明水解圈與菌落直徑比值Tab.1 Ratio of transparent hydrolysis circle to colony diameter

圖1 目標(biāo)菌株NWMCC0320透明水解圈Fig.1 Transparent hydrolysis circle of target strain NWMCC0320

由圖2 可知，NWMCC0320 菌株酶活力顯著高于其他菌株，初步測定蛋白酶活力為114.21 U/mL，即將NWMCC0320菌株作為目標(biāo)菌株應(yīng)用于后續(xù)的試驗(yàn)。

圖2 蛋白酶活力Fig.2 Protease activity

2.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

NWMCC0320 菌株形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為：菌落圓形、顏色呈乳白色、大小中等，表面隆起、易挑起、不透明、邊緣不整齊。革蘭氏染色鏡下觀察，目標(biāo)菌株顏色為藍(lán)色，可知其為革蘭氏陽性菌，形狀呈桿狀、兩端鈍圓，菌體長3.0～5.0μm，寬1.2～1.8μm，有呈橢圓形的芽孢產(chǎn)生，細(xì)菌為好氧菌。

2.3 NWMCC0320菌株生理生化鑒定結(jié)果（見表2）

由表2 可知，NWMCC0320 菌株可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，但不能發(fā)酵木糖、阿拉伯糖、纖維二糖及部分醇類；NWMCC0320菌株能夠利用葡萄糖作碳源。

表2 NWMCC0320菌株生化鑒定結(jié)果Tab.2 Biochemical identification results of NWMCC0320 strain

在吲哚試驗(yàn)中，甲基紅表現(xiàn)為弱陽性，VP 試驗(yàn)呈陽性。此外，該菌株能夠還原硝酸鹽，具有液化明膠和水解淀粉的能力，精氨酸脫羧酶呈陽性。

2.4 NWMCC0320菌株分子生物學(xué)鑒定（見圖3）

目標(biāo)菌株所提基因組DNA 經(jīng)電泳檢測，該菌株核酸序列全長約為1 500 bp，擴(kuò)增細(xì)菌核糖體16S rDNA，得到相應(yīng)的PCR 產(chǎn)物。利用BLASTN 程序?qū)y序所得16S rDNA序列進(jìn)行同源性的比對。

由 圖 3 可 知，NWMCC0320 菌 株 與Bacillus thuringiensisIAM 12077菌株的序列相似性為100%。

圖3 基于16S rRNA基因序列建立的NWMCC0320菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of NWMCC0320 strain based on 16S rRNA gene sequences

2.5 NWMCC0320菌株最適產(chǎn)酶條件的測定

2.5.1 酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖4）

分別以吸光度值、酪氨酸濃度值作為橫、縱坐標(biāo)，繪制相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖4可知，該菌株產(chǎn)蛋白酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.01x+0.001 7，R2=0.999 6。當(dāng)光密度為1時(shí)，計(jì)算與之相當(dāng)?shù)睦野彼豳|(zhì)量K=99.83。

圖4 酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of enzyme activity

2.5.2 最適產(chǎn)蛋白酶溫度（見圖5）

圖5 最適產(chǎn)蛋白酶溫度Fig.5 Optimum temperature for protease production

由圖5可知，目標(biāo)菌體的產(chǎn)蛋白酶活力隨溫度而升高，35 ℃時(shí)產(chǎn)酶活力達(dá)到峰值，35 ℃后隨溫度升高呈遞減趨勢，50 ℃時(shí)酶活降至31.09%。

2.5.3 最適產(chǎn)蛋白酶pH值（見圖6）

圖6 最適產(chǎn)蛋白酶pH值Fig.6 Optimum pH value for protease production

由圖6 可知，pH 值為5.5 時(shí)，該菌體相對酶活低于50%；隨著pH值遞增，菌體產(chǎn)蛋白酶活力明顯增強(qiáng)，pH值8.5 時(shí)酶活力最大，菌體在pH 值9.5～10.5 的區(qū)間內(nèi)仍具有很高的產(chǎn)酶活力。

2.5.4 產(chǎn)蛋白酶最適氮源（見圖7）

由圖7可知，有機(jī)、無機(jī)氮源均可被菌株利用，但是菌株極少利用無機(jī)氮源。相對其他氮源，目標(biāo)菌株對蛋白胨的利用率最高。

圖7 產(chǎn)蛋白酶最適氮源Fig.7 Optimum nitrogen source for protease production

2.5.5 產(chǎn)蛋白酶最適氮源濃度（見圖8）

由圖8 可知，在氮源濃度分別為10、20、30、40、50 g/L的條件下，目標(biāo)菌株的產(chǎn)酶活力呈先增后減的趨勢；濃度為30 g/L時(shí)最高。

圖8 產(chǎn)蛋白酶最適氮源濃度Fig.8 Optimum nitrogen concentration for protease production

2.5.6 產(chǎn)蛋白酶最適碳源（見圖9）

由圖9 可知，碳源為葡萄糖時(shí)，菌株產(chǎn)蛋白酶活力最高；與其他碳源相比，目標(biāo)菌株對葡萄糖的利用率最高。

圖9 產(chǎn)蛋白酶最適碳源Fig.9 Optimal carbon source for protease production

2.5.7 產(chǎn)蛋白酶最適碳源濃度（見圖10）

圖10 產(chǎn)蛋白酶最適碳源濃度Fig.10 Optimum carbon source concentration for protease production

葡萄糖為碳源時(shí)，目標(biāo)菌株產(chǎn)酶活性較高。由圖10可知，在碳源濃度分別為10、20、30、40、50 g/L 的條件下，目標(biāo)菌株的產(chǎn)酶活力先增后減，濃度為20 g/L時(shí)達(dá)到峰值。

2.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.6.1 蛋白酶最適溫度（見圖11）

由圖11可知，蛋白酶的活性會受到溫度影響而發(fā)生顯著變化。在溫度分別為25、30、35、40、45、50 ℃的條件下，蛋白酶的酶活逐漸增高。蛋白酶的活性在溫度為25 ℃的條件下為最低，溫度為50 ℃的條件下達(dá)到最大，可推測其局部活性可能因溫度過低而受到抑制，表明該菌株耐高溫，酶解效率受溫度高低的影響。

圖11 蛋白酶最適溫度Fig.11 Optimum temperature of protease

2.6.2 蛋白酶最適pH值（見圖12）

由圖12 可知，蛋白酶的活性受pH 值影響而發(fā)生顯著變化，隨著pH值加大，酶活呈現(xiàn)先增后減的趨勢。當(dāng)酶活性達(dá)到最大時(shí)，pH值為9.5，表明pH值可影響酶解效率；當(dāng)pH 值在5.5～6.5 的范圍內(nèi)時(shí)，該蛋白酶活性的相對酶活均低于50%，說明該酶對酸的敏感性相對較高，可推測其具有不耐酸的特性。

圖12 蛋白酶最適pH值Fig.12 Optimum pH of protease

在堿性條件下（pH值為10.5），蛋白酶仍表現(xiàn)較高的酶活性（活性高于70%），表明該菌體所產(chǎn)蛋白酶活性對堿性具有耐受作用，可推測該酶相對嗜堿。

3 討論

菌株NWMCC0320的生理生化試驗(yàn)特征，參考羅杰氏細(xì)菌鑒定手冊中有關(guān)蘇云金芽孢桿菌的內(nèi)容，可知該目標(biāo)菌株的生化圖譜與之相符。菌株NWMCC0320 與蘇云金芽孢桿菌之間存在較近的關(guān)系，在16S rRNA 序列系統(tǒng)進(jìn)化分析中顯示，NWMCC0320 菌株與Bacillus thuringiensisIAM 12077 菌株的序列相似性為100%。根據(jù)菌株NWMCC0320 在形態(tài)學(xué)上結(jié)合生理生化試驗(yàn)結(jié)果中所呈現(xiàn)的特征，可鑒定其為蘇云金芽孢桿菌。

本試驗(yàn)中，溫度高于35 ℃時(shí)酶活降低，推測是因?yàn)闇囟冗^高，酶活性降低甚至失活，導(dǎo)致細(xì)菌生長代謝受阻、無法持續(xù)生長繁殖，蛋白酶合成受阻，酶活大幅度降低。pH值為5.5時(shí)，該菌體相對酶活低于50%，說明極酸性條件下并不適合產(chǎn)酶，隨著pH值的遞增，菌體產(chǎn)蛋白酶活力明顯升高，在pH值為8.5時(shí)酶活力最大，而菌體在pH值9.5～10.5的區(qū)間內(nèi)仍然具有很高的產(chǎn)酶活力，表明該產(chǎn)蛋白酶菌可在一定程度上耐堿。

微生物的生長與繁殖需要氮源作為原材料。在微生物合成細(xì)胞過程中，氮源主要供給含氮物質(zhì)。其中，蛋白胨作為有機(jī)氮源，氨基酸含量十分豐富，還含有生長素和其他生長因子，可供細(xì)菌生長所需。本試驗(yàn)中，隨著蛋白胨濃度的增加，目標(biāo)菌株產(chǎn)蛋白酶活力隨之下降，原因可能為細(xì)菌代謝的失衡，致使菌株產(chǎn)酶活力下降。菌種的生長、繁殖、合成、代謝等狀態(tài)由相應(yīng)的碳源維持，碳源主要是供給微生物能量。此外，菌株的代謝產(chǎn)物與菌體的有關(guān)細(xì)胞成分，碳源也有參與構(gòu)成。碳源濃度為1%時(shí)，產(chǎn)蛋白酶活力受到少部分抑制，可能是菌株所需的碳源的量不足，無法供給菌種足夠的能量。當(dāng)終濃度為50 g/L 時(shí)，相對酶活降至50%以下，可能是因?yàn)樘荚礉舛冗^大，反而抑制了菌株產(chǎn)蛋白酶，從而導(dǎo)致酶活下降。

Bacillus thuringiensis是一種重要的微生物源蛋白酶。黃慧敏等[14]分離的蘇云金芽孢桿菌可產(chǎn)生某種特殊的晶體，可作為常用的微生物源殺蟲劑，能夠殺滅不同種類的昆蟲，且對環(huán)境友好，對人體無危害。趙謀明等[15]分離得到一株SWJS07 經(jīng)過優(yōu)化培養(yǎng)，蛋白酶活可最大限度地提高30%以上。Zhang等[16]分離出一株Bacillus thuringiensis菌株，為高產(chǎn)堿性蛋白酶菌株。

現(xiàn)已從許多微生物中分離純化得到多種堿性蛋白酶，但應(yīng)用于生產(chǎn)高活性堿性蛋白酶的微生物依然只占少數(shù)。為滿足各種工業(yè)對堿性蛋白酶的需求，還應(yīng)探索更多新的蛋白酶高產(chǎn)菌株[17]。蘇云金芽孢桿菌與其所產(chǎn)生的蛋白酶，究竟能否用于工業(yè)生產(chǎn)，還有待進(jìn)一步研究。

對于本文篩選的菌株，后期研究工作重點(diǎn)為進(jìn)一步提高Bacillus thuringiensis的產(chǎn)酶性能，并探究該菌株在飼料工業(yè)中的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從甘肅甘南土壤中分離出1 株芽孢桿菌，通過對其16S rRNA 的序列進(jìn)行鑒定，可知該菌株為Bacillus thuringiensis。該菌株最優(yōu)產(chǎn)蛋白酶條件為：溫度50 ℃、pH值9.5，該酶表現(xiàn)較高的產(chǎn)蛋白酶活性。經(jīng)過優(yōu)化試驗(yàn)，該菌株的最適反應(yīng)條件為：溫度35 ℃、初始pH值8.5、最適碳源葡萄糖的添加量2%、最適氮源蛋白胨的添加量3%。此條件下酶活為388.34 U/mL，與原始培養(yǎng)基的產(chǎn)酶量相比，優(yōu)化試驗(yàn)可顯著增加培養(yǎng)基的產(chǎn)酶量。