抗壞血酸和半胱氨酸對大菱鲆肌肉中氧化三甲胺熱分解的影響及其動力學(xué)研究

唐 森 ， 李軍生 *， 胡金鑫 ，4， 閻柳娟 ， 黃國霞

（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州 545006；2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣西科技大學(xué)），廣西柳州 545006；3.廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣西科技大學(xué)），廣西柳州 545006；4.國家輕工業(yè)食品質(zhì)量監(jiān)督檢測天津站，天津?yàn)I海新區(qū)300451）

氧化三甲胺（TMAO）的分解方式除了酶途徑和微生物途徑，還包括非酶途徑。非酶途徑一般發(fā)生在高溫加熱狀況下，并且此時(shí)的內(nèi)源性TMAOase處于失活狀態(tài)，TMAO在內(nèi)源性或外源添加物質(zhì)的還原作用下，還可以分解產(chǎn)生二甲胺（DMA） 和三甲胺 （TMA） 等揮發(fā)胺 （Spinelli和Koury，1979）。L-半胱氨酸（Cys）是一種還原劑，常用于肉制品、果汁、乳制品中，以提高食品的穩(wěn)定性，延長食品的保藏期并增強(qiáng)食品的營養(yǎng)價(jià)值（Christian等，2014）。Cys不管作為魚制品內(nèi)源性氨基酸，還是作為一種食品常用的添加劑，都可能促進(jìn)TMAO通過非酶途徑形成揮發(fā)胺（Jonathan等，2014）。應(yīng)用化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)的研究方法，可以找到控制反應(yīng)條件的方法，因此可以根據(jù)需要來改變反應(yīng)速率，如為了提高產(chǎn)品的質(zhì)量同時(shí)減少原料的消耗，可以人為的減慢或抑制副反應(yīng)的速率。熱分解反應(yīng)動力學(xué)的意義在于可以了解和調(diào)控某個反應(yīng)過程，來保證安全生產(chǎn)和維持生產(chǎn)效益（文堯順等，2014）。

本試驗(yàn)旨在研究魚制品熱加工過程中Cys的添加對TMAO熱分解的影響。魚制品中TMAO的熱分解存在一定的復(fù)雜性，而單一的TMAO標(biāo)準(zhǔn)品性質(zhì)穩(wěn)定很難受熱分解。研究表明，抗壞血酸（Vc）、Sn2+等促進(jìn)因子可促進(jìn)TMAO的熱解反應(yīng)（Spinelli和 Koury，1981）， 所以本文建立 TMAOVc體系作為TMAO-Vc-Cys對照，對添加Cys的魚制品熱加工過程進(jìn)行模擬研究，并研究其熱反應(yīng)特性，最后測定兩個體系不同溫度、不同時(shí)間條件下的TMA、DMA和TMAO的含量，從動力學(xué)角度分析TMAO熱分解規(guī)律，求出各個指標(biāo)在不同反應(yīng)階段的Arrhenius活化能，根據(jù)活化能的變化規(guī)律分析魚制品熱加工過程中揮發(fā)胺的產(chǎn)生機(jī)理，以此為生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)，從而保證魚制品加工的安全。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 鮮活大菱鲆，購于農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 樣品處理 按照SC/T 3016-2004方法取樣，除去魚鱗、魚皮，取背部和腹部肌肉，將魚肉絞碎后，稱量并分裝于經(jīng)殺菌后的自封袋中，定時(shí)取出，測定樣品中各項(xiàng)指標(biāo)。留出整魚進(jìn)行感官評定。每次檢測做3個平行試驗(yàn)，取其平均值。

1.3 試驗(yàn)試劑 三甲胺鹽酸鹽（≥98%），梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；二水合氧化三甲胺（≥98%），北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；二甲胺鹽酸鹽（≥99.0%），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；L-抗壞血酸（AR），汕頭市西隴化工廠；L-半胱氨酸（AR），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 試驗(yàn)儀器 UV-2012PC型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；PHS-25CVV型精密pH計(jì)，上海理達(dá)儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器公司；LD4-2型低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；AL204型電子分析天平，梅特勒托利多儀器有限公司；BZZOOS型超聲波臺式清洗機(jī)，必能信超聲有限公司；ZFD-A5040A型全自動新型鼓風(fēng)干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.5 TMAO、TMA和DMA的測定 應(yīng)用苦味酸比色法對大菱鲆魚肉中的TMA和TMAO同時(shí)測定，此方法依靠Fe-EDTA將樣品中的TMAO全部還原成TMA，此時(shí)，被還原的樣品中包含固有的TMA和TMAO還原的TMA兩部分，樣品中TMAO含量是由TMA總量與樣品中原有的TMA的量的差值換算所得出。所以，此方法在測定樣品TMAO的同時(shí)也將TMA含量同時(shí)測出。采用比色法對大菱鲆魚肉中的DMA含量進(jìn)行測定，具體方法參照李豐（2010）所用方法并稍作修改。

1.6 添加物質(zhì)Cys對魚體中TMAO熱分解生成DMA和TMA影響的研究

1.6.1 模擬體系溶液的制備 TMAO-Vc體系：10 mmol/L TMAO、10 mmol/L Vc、10 mmol/L Tris-乙酸（pH=7）；TMAO-Vc-Cys 體系：10 mmol/L TMAO、10 mmol/L Vc、10 mmol/L Cys、10 mmol/L Tris-乙酸 （pH=7）；TMAO：10 mmol/L TMAO、10 mmol/L Tris-乙酸 （pH=7）；TMAO-Cys：10 mmol/L TMAO、10 mmol/L Cys、10 mmol/L Tris-乙酸（pH=7）。

1.6.2 上清液的提取 取解凍后的大菱鲆魚肉5.0 g，絞碎后加入到裝有10 mL抽提液（10 mmol/L的Tris-乙酸，pH=7.0）的離心管中，漩渦振蕩2 min，超聲30 min，離心后取上清液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 添加Cys對TMAO熱解反應(yīng)的影響 分別取TMAO、TMAO-Cys體系各6 mL于10 mL的比色管中，100℃加熱30 min，加入1 mL 7.5%TCA中止反應(yīng)，反應(yīng)液稀釋至合適的倍數(shù)，測定TMA、DMA和TMAO的含量。取上清液3 mL與等體積的10 mmol/L的Cys于10 mL比色管中，并用蒸餾水替代添加物質(zhì)作空白，100℃加熱30 min，加入1 mL 7.5%TCA中止反應(yīng)，然后分別測定TMA、DMA和TMAO的含量。

1.7 TMAO-Vc和TMAO-Vc-Cys體系熱分解反應(yīng)動力學(xué)研究 分別取TMAO-Vc體系和TMAO-Vc-Cys體系各 6 mL，分別于 100、80、60 ℃和 40 ℃下反應(yīng) 0、2、5、8、10、15、30、45、60 min，加入1 mL 7.5%TCA中止反應(yīng)，反應(yīng)液稀釋至合適的倍數(shù)，測定TMA、DMA和TMAO的含量。利用Arrhenius公式計(jì)算活化能 （唐萬軍和陳棟華，2007）。

lnk=-Ea/（RT）+lnA；

式中：Ea為反應(yīng)活化能，kJ/mol；R為氣體常數(shù)，8.314 J/（mol·K）；T 為熱力學(xué)溫度，K；k 為零級反應(yīng)速率常數(shù)；A為指前因子。

1.8 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以均值表示，采用Origin 8.0軟件對同一溫度不同時(shí)間的各指標(biāo)含量變化進(jìn)行線性擬合，求出反應(yīng)速率k，再以lnk為縱坐標(biāo)，1/T為橫坐標(biāo)作圖，得出斜率為-Ea/R，截距為lnk的直線，從而得出表觀活化能（Ea）和指前因子（A）（天津大學(xué)物理化學(xué)教研室，2011）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cys對魚體中TMAO熱分解生成DMA和TMA的影響 表1為大菱鲆上清液與TMAO標(biāo)準(zhǔn)品中分別添加Cys，經(jīng)過100℃加熱30 min后的TMA和DMA的生成量，本試驗(yàn)選用TMAO標(biāo)準(zhǔn)品作為參照是為了消除生物體中其他因素對TMAO熱分解的影響。結(jié)果表明，加熱反應(yīng)后，添加Cys的樣品液和TMAO標(biāo)準(zhǔn)液中的DMA和TMA生成量均有所增加：添加Cys的樣品液與未添加的相比，DMA的生成量增加了2.75倍，TMA生成量增加了1.06倍；添加Cys的TMAO標(biāo)準(zhǔn)溶液與未添加溶液相比，DMA的生成量增加了9.7倍，TMA生成量增加了6.25倍。由此可以看出Cys可以明顯促進(jìn)TMAO熱分解，并且在大菱鲆的生物體中可能存在一些抑制TMAO熱分解反應(yīng)因素，導(dǎo)致Cys的還原能力較在單純的標(biāo)準(zhǔn)品減弱。

表1 Cys對TMAO熱分解的影響mg/L

2.2 TMAO-Vc和TMAO-Vc-Cys體系熱分解反應(yīng)動力學(xué)

2.2.1 溫度和時(shí)間對TMAO-Vc和TMAO-Vc-Cys體系熱分解反應(yīng)的影響 由圖1和圖2可以看出，隨著加熱時(shí)間的增加，兩個體系中的TMAO逐漸被分解，TMA和DMA的生成量逐漸增加，在兩個體系中TMA、DMA和TMAO存在相同的變化趨勢，但是加入Cys的反應(yīng)體系中，TMAO的分解趨勢更為明顯。兩個體系中，各個指標(biāo)在0～15 min變化最大，15 min后各個指標(biāo)的變化較前15 min變化平緩。由此可以看出Cys的添加促進(jìn)了TMAO的熱解反應(yīng)。這是因?yàn)閂c和Cys作還原劑與TMAO發(fā)生反應(yīng)時(shí)，Vc的還原性表現(xiàn)更強(qiáng)，Vc更易被TMAO氧化，在反應(yīng)初期Vc的反應(yīng)速率大于Cys的反應(yīng)速率，TMAO熱分解后期主要依賴于未反應(yīng)完全的Cys的促進(jìn)作用，以至于Cys表現(xiàn)出促進(jìn)TMAO熱分解的特性。

圖1 不同溫度、不同時(shí)間下TMAO-Vc體系中TMA（a）、DMA（b）和 TMAO（c）的含量變化

陳帥（2012）曾經(jīng)對 TMAO-Fe（Ⅱ）、TMAOFe（Ⅱ）-Lys/Gal體系的熱力學(xué)反應(yīng)過程進(jìn)行分析，將時(shí)間按熱反應(yīng)特性分成兩個階段。本試驗(yàn)中的兩個研究體系也有相類似的反應(yīng)特性，故把0～15 min作為第一階段，15～60 min作為第二階段。

圖2 不同溫度、不同時(shí)間下TMAO-Vc-Cys體系中TMA（a）、DMA（b）和 TMAO（c）的含量變化

2.2.2 TMAO-Vc、TMAO-Vc-Cys體系第一階段反應(yīng)動力學(xué)研究 對兩個反應(yīng)體系第一階段TMA、DMA的生成量及反應(yīng)物TMAO的變化量進(jìn)行反應(yīng)動力學(xué)方程線性擬合，得到不同溫度下不同指標(biāo)在0～15 min所得到的反應(yīng)速率r。從圖3可以看出，反應(yīng)速率r的大小與反應(yīng)物濃度無關(guān)，而且相關(guān)系數(shù)均大于0.90，因此第一階段的TMAO熱解反應(yīng)符合零級反應(yīng)，故反應(yīng)速率r等于反應(yīng)速率常數(shù)k（斜率）。各個指標(biāo)的反應(yīng)速率大小順序?yàn)?kTMAO-Vc-Cys＞kTMAO-VC和 k100℃＞k80℃＞k60℃＞k40℃。在TMAO-Vc-Cys體系中，由于逐漸升高的溫度增加了各分子間有效碰撞的幾率，并且Cys的增加使反應(yīng)速率增加，從而更容易引起TMAO的熱分解反應(yīng)。

圖 4所示為 TMAO-Vc、TMAO-Vc-Cys體系第一階段的TMA、DMA和TMAO的Arrhenius曲線，以上所得線性方程相關(guān)系數(shù)R2＞0.90，計(jì)算出方程的斜率，最后根據(jù)Arrhenius方程lnk=-Ea/（RT）+lnA， 計(jì)算出各個分解產(chǎn)物的活化能（Ea），結(jié)果如表2所示。

圖3 TMAO-Vc、TMAO-Vc-Cys體系第一階段的TMA、DMA和TMAO的線性擬合

圖4 TMAO-Vc、TMAO-Vc-Cys體系第一階段的TMA、DMA和TMAO的Arrhenius曲線

表2 TMAO-Vc、TMAO-Vc-Cys體系第一階段的TMA、DMA和TMAO的回歸方程和活化能

由表2可以看出，TMAO熱分解反應(yīng)在第一階段的表觀活化能，通過不同的指標(biāo)所得出的結(jié)果各不相同。TMAO-Vc-Cys體系較TMAO-Vc體系而言，各個指標(biāo)的活化能皆有所下降。由此可得，添加Cys的體系的各指標(biāo)的活化能降到更低，雖然活化能的降低幅度較小，但添加了Cys的體系各指標(biāo)的生成量卻大幅增加了。所以Cys的添加促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行，使其化學(xué)平衡反應(yīng)有向右移的趨勢，以至于各指標(biāo)的生成量增加。并且Arrhenius活化能與反應(yīng)溫度有較大關(guān)系，熱分解反應(yīng)對溫度的敏感程度會隨著活化能的降低而下降（丁曉雯和刁恩杰，2006）。所以，Cys的添加使TMAO熱解反應(yīng)對溫度的敏感度降低。因此，在魚制品的熱加工過程中，若熱加工溫度一定，應(yīng)避免添加Cys等添加劑，以防止降低TMAO的熱敏感性而產(chǎn)生過量的揮發(fā)胺，進(jìn)而降低了魚制品的品質(zhì)。

2.2.3 TMAO-Vc、TMAO-Vc-Cys體系第二階段反應(yīng)動力學(xué)研究 圖5所示為TMAO熱解反應(yīng)第二階段TMA、DMA的生成量及反應(yīng)物TMAO的變化量進(jìn)行反應(yīng)動力學(xué)方程的線性擬合，相關(guān)系數(shù)均大于0.90。同第一階段相同，第二階段的TMAO的熱解反應(yīng)也符合零級反應(yīng)。各個指標(biāo)的反應(yīng)速率大小順序?yàn)?k100℃＞k80℃＞k60℃＞k40℃， 反應(yīng)速率k全部小于第一階段的反應(yīng)速率，第二階段各個指標(biāo)的生成量較第一階段不明顯，這是因?yàn)閂c比Cys的還原性強(qiáng)，Vc更易被TMAO氧化，在反應(yīng)初期Vc的反應(yīng)速率大于Cys的反應(yīng)速率，TMAO熱分解后期主要依賴于未反應(yīng)完全的Cys的促進(jìn)作用，以至于TMAO的熱解反應(yīng)較初期減弱。

根據(jù)第二階段中不同溫度下的各指標(biāo)的反應(yīng)速率k的自然對數(shù)lnk與1000/T作圖，得到圖6所示的TMAO-Vc、TMAO-Vc-Cys體系第二階段的TMA、DMA TMAO的Arrhenius曲線，以上所得線性方程相關(guān)系數(shù)R2＞0.93，計(jì)算出方程的斜率，最后根據(jù) Arrhenius 公式 lnk=-Ea/（RT）+lnA，計(jì)算出各個分解產(chǎn)物的活化能，結(jié)果如表3所示。

由表3可以得出，在TMAO熱解反應(yīng)第二階段，TMAO-Vc-Cys體系較TMAO-Vc體系，各個指標(biāo)的活化能均有所下降。同樣的，添加了Cys的體系的各指標(biāo)的活化能降低，從而降低了熱分解反應(yīng)對溫度的敏感性。在第二階段，降低反應(yīng)溫度對添加了Cys的體系熱分解的影響變小，所以，在魚制品熱加工時(shí)間較長時(shí)，降低溫度不足以對TMAO的熱解產(chǎn)生較大影響，此時(shí)應(yīng)避免加入Cys等添加物質(zhì)以減少大量揮發(fā)胺的積累。

由表2和表3對比可知，第二階段的活化能比第一階段要低，由此可知隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，TMAO熱分解反應(yīng)對溫度敏感性逐漸降低，以至于降低反應(yīng)溫度對分解反應(yīng)的影響也降低，所以，在同一個反應(yīng)體系中，對通過降低溫度來抑制TMAO熱解的效果而言，第一階段要強(qiáng)于第二階段。這是由于隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，溫度不再是TMAO熱解反應(yīng)的主要因素，并且不管是第一階段反應(yīng)，還是第二階段反應(yīng)，Cys的加入均能降低反應(yīng)的活化能，加快TMAO熱分解反應(yīng)的速率，在一定程度上使反應(yīng)向生成物方向移動。

圖5 TMAO-Vc、TMAO-Vc-Cys體系第二階段的TMA、DMA和TMAO的線性擬合

圖6 TMAO-Vc、TMAO-Vc-Cys體系第二階段的TMA、DMA和TMAO的Arrhenius曲線

表3 TMAO-Vc、TMAO-Vc-Cys體系第二階段的TMA、DMA和TMAO的回歸方程和活化能

3 討論與結(jié)論

Lin和 Hurng（1985）研究發(fā)現(xiàn)TMAO在高溫?zé)峤獾臅r(shí)候，90%轉(zhuǎn)變?yōu)镈MA和TMA，其中50%中，為了減少揮發(fā)胺的產(chǎn)生，應(yīng)在整個熱加工過程中避免Cys等物質(zhì)的添加，并且盡量縮減加熱時(shí)間以防止TMAO熱解進(jìn)入第二階段。的生成物在加熱過程中造成損失。添加物質(zhì)Cys促進(jìn)了魚肉中TMAO分解產(chǎn)生TMA和DMA，但是與TMAO標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，Cys對TMAO標(biāo)準(zhǔn)溶液的促進(jìn)分解作用更為明顯。

構(gòu)建了TMAO-Vc和TMAO-Vc-Cys體外熱分解體系，研究了反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對TMAOVc和TMAO-Vc-Cys體系的影響，發(fā)現(xiàn)Cys的添加明顯促進(jìn)了TMAO的熱解，其產(chǎn)物DMA和TMA明顯增加，兩個體系的各個指標(biāo)隨加熱時(shí)間的延長存在相似的變化規(guī)律，在后45 min的變化較前15 min明顯變慢。所以將TMAO-Vc和TMAO-Vc-Cys的體外模擬體系的動力學(xué)分為兩個反應(yīng)階段反應(yīng)，前15 min作為第一階段，15～60 min為第二階段，對這兩個反應(yīng)體系的兩個階段進(jìn)行線性擬合，得出反應(yīng)速度與反應(yīng)物濃度無關(guān)，符合零級反應(yīng)動力學(xué)方程，溫度是影響TMAO熱分解的因素，反應(yīng)速率隨溫度的升高而變快，并且Cys的添加明顯增加了TMAO的熱解速率。

TMAO-Vc和TMAO-Vc-Cys體系中各指標(biāo)第二階段的活化能比第一階段要低，由此可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，TMAO熱分解反應(yīng)對溫度的敏感性逐漸降低，Cys的加入能降低反應(yīng)活化能，加快TMAO熱分解反應(yīng)的速率，同樣熱分解反應(yīng)對溫度的敏感性降低，所以在魚制品熱加工過程

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