特異性結(jié)合革蘭氏陰性菌外膜蛋白C的單鏈抗體核糖體展示文庫的構(gòu)建

王 瀟 ， 王秀敏 ， 管慶豐 ， 滕 達 ， 姚軍虎 ， 王建華 *

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京海淀100081；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所基因工程研究室，北京海淀 100081）

多種革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、志賀氏菌及沙門氏菌等均為飼料中常見病原菌，會引發(fā)腹瀉、敗血癥等疾?。ㄖ軙郧澹?012）。常規(guī)抗菌劑或者抗菌藥多具廣譜抗菌性，對正常菌群也有很強抑制效果，無差別性殺菌容易破壞腸道微生態(tài)環(huán)境，使機體遭受二次感染（Mao等，2012）。而靶向抗菌劑能選擇性殺滅目標(biāo)菌，對正常細菌無作用或作用較小（霍麗堵和凌均棨，2009）。特異性靶向定位區(qū)對靶向抗菌劑的靶向效應(yīng)具有結(jié)構(gòu)決定作用。單鏈抗體可變區(qū)片段 （scFv）是輕鏈 （VL）和重鏈（VH）可變區(qū)通過（Gly4Ser）3 linker連接而成的具有抗原親和力的抗體片段，是靶向抗菌劑特異性靶向定位區(qū)的理想候選物之一（Pan等，2012；Ahmad 等，2012）。

外膜蛋白C（OmpC）在多種革蘭氏陰性菌膜上均有分布，具有運輸疏水性分子等生理機能，為耐藥性關(guān)聯(lián)蛋白，且能引發(fā)機體強烈的體液免疫反應(yīng)并產(chǎn)生特異性抗體 （Liu等，2012a、b）。 核糖體展示技術(shù)是將抗體庫體外轉(zhuǎn)錄翻譯并在完成后阻止mRNA及蛋白脫落，形成蛋白質(zhì)、核糖體與mRNA分子聚合物，進而實現(xiàn)親和篩選獲得與靶抗原具有高親和性的單鏈抗體序列的過程（Plückthun，2012）。 近年來核糖體展示技術(shù)由于克服了基因庫的轉(zhuǎn)化丟失及胞內(nèi)難以表達毒性蛋白的限制，作為一種篩選容量大、多樣性好的方式，已成功用于抗體、酶及其他蛋白的篩選（Sun等，2012）。在核糖體展示中，構(gòu)建高質(zhì)量、大容量scFv庫是保證篩選出高親和力抗體可變區(qū)序列的關(guān)鍵。scFv具有分子量小、組織穿透力強，且含有決定抗體與抗原特異性的結(jié)構(gòu)，在抗原物質(zhì)檢測和藥物設(shè)計方面具有極高的參考價值。本課題組前期工作已完成大腸桿菌OmpC的原核重組表達（待發(fā)表），本研究將其作為抗原蛋白開展了相關(guān)工作，PCR構(gòu)建核糖體展示抗體庫，篩得抗OmpC蛋白的特異性scFv，旨在為構(gòu)建飼料有害革蘭氏陰性菌的預(yù)警檢測及靶向抗菌劑和關(guān)聯(lián)藥物的靶向定位區(qū)設(shè)計提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 純化的重組大腸桿菌外膜蛋白OmpC（C端帶有6×His標(biāo)簽）由本實驗室制備；Taq DNA聚合酶、EasyPfu高保真DNA聚合酶、DNA marker，均購自全式金生物科技有限公司；TRIZOL、逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒，均購自TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物純化和膠回收試劑盒，均購自天根生化科技有限公司。引物由上海生工公司合成；DNA測序服務(wù)由上海生工公司提供。6～8周齡雌性BALB／c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大腸桿菌外膜蛋白OmpC免疫小鼠和骨髓細胞制備 將OmpC蛋白 （純度為96%）免疫3只6～8周齡雌性BALB／c小鼠。初次免疫佐劑為完全弗氏佐劑，皮下注射；初次免疫3周后進行二免，佐劑為不完全弗氏佐劑，腹腔注射；2周后進行三免，免疫方式同二免。蛋白免疫劑量為25 μg/只[（25 μg 蛋白溶于 25 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS），加入25 μL免疫佐劑及50 μL PBS，移液器吹打乳化后 100 μL/只免疫）]。

免疫后6 d，脫頸處死小鼠。將小鼠脛骨和股骨上的肌肉和脂肪去除，并用外科手術(shù)剪減掉兩端，用20 mL PBS沖洗，收集于50 mL離心管中。收集的骨髓組織用70 μm濾膜過濾，離心10 min（4 ℃，335 g），棄上清，將沉淀重懸于 3 mL 紅細胞裂解液中，25℃輕柔搖動5 min。向細胞重懸液中加入 20 mL PBS，4℃、335 g離心 10 min， 棄上清，將沉淀重懸于1 mL PBS中。將上一步得到的重懸液于4℃、930 g離心5 min，獲得小鼠骨髓細胞。

1.2.2 OmpC免疫小鼠骨髓細胞總RNA的提取及其cDNA逆轉(zhuǎn)錄 按TRIZOL法提取細胞總RNA（朱姜，2008）。按照 TaKaRa RNA PCR Kit說明書，利用隨機引物Oligo（dT）l5將小鼠骨髓細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（孟夏萌，2008）。

1.2.3 元件、引物的設(shè)計與合成 元件合成見表1：（1）含有T7啟動子、5'端莖環(huán)結(jié)構(gòu)與核糖體結(jié)合位點序列（Shine Dalgarno，SD）的 scFv 上游元件序列。 （2）含有6His myc標(biāo)簽、gⅢ tether和 3'端莖環(huán)結(jié)構(gòu)的scFv下游元件序列。

表1 構(gòu)建核糖體展示文庫合成元件

引物設(shè)計見表2：（1）用于擴增抗體庫VL和VH 的 引 物 ：VHF、VHR、VLF 和VLR （Luo 和 Xia，2012）。 （2）用于擴增帶有（Gly4Ser）3 linker的 VH和VL序列的引物：VH+linker R和VL+linker F。重鏈下游引物及輕鏈上游引物均帶有l(wèi)inker序列，以便通過重疊延伸PCR合成帶有l(wèi)inker序列的scFv基因。（3）用于在VL基因下游連接帶有6His標(biāo)簽的堿基序列，便于鑒定和純化的引物：HisRev VLR。（4）重疊延伸獲得連接gⅢ tether及最終序列的引物：T7B和T6te。

1.2.4 構(gòu)建核糖體展示文庫 核糖體展示元件構(gòu)建示意如圖1所示：（1）以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，以 VHF、VHR，VLF、VLR 為引物分別進行 PCR 擴增 VH、VL 基因；（2）將引物 VHF、VH+linker R，VLF、VL+linker F分別混合，以VH、VL基因為模板，PCR獲得VH+linker序列和VL+linker序列，用膠回收試劑盒純化；（3）將等物質(zhì)的量濃度的純化產(chǎn)物VH+linker和VL+linker混合，利用引物VHF和VLR進行重疊延伸PCR，將VH與VL通過linker連接獲得scFv基因庫，用膠回收試劑盒純化；（4）以引物VHF和HisRev VLR對scFv基因進行PCR擴增，獲得帶6His標(biāo)簽的scFv序列，用膠回收試劑盒純化；（5）將等物質(zhì)的量濃度的純化產(chǎn)物scFv（帶有6His標(biāo)簽）與gⅢ tether混合，利用引物VHF和T6te進行重疊延伸PCR，獲得連接gⅢtether及3'端莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列；（6）純化所獲序列與T7SD序列等物質(zhì)的量濃度混合，利用引物T7B和T6te進行重疊延伸PCR反應(yīng)，最后獲得完整序列（圖1）。

表2 構(gòu)建核糖體展示文庫引物序列

圖1 核糖體展示元件的構(gòu)建過程

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR法獲得抗體庫VH、VL及其連接linker序列 本課題組前期研究表明，大腸桿菌OmpC蛋白免疫BALB/c小鼠后所產(chǎn)生抗體對OmpC蛋白的效價高達1∶240000，對大腸桿菌菌體效價高達1∶27000，說明免疫小鼠能產(chǎn)生高親和力抗體，且部分抗體可特異性結(jié)合于菌體表面蛋白區(qū)域，初步實證了scFv作為飼料中革蘭氏陰性病原菌檢測物質(zhì)和靶向抗菌藥物靶向定位區(qū)的可行性（Wang等，待發(fā)表）。此外，研究發(fā)現(xiàn)小鼠免疫6 d后，會有高濃度骨髓漿細胞產(chǎn)生，并在骨髓中較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定（Reddy等，2010）。因此，小鼠免疫后第6天提取小鼠骨髓細胞總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得抗體可變區(qū)cDNA序列，以此為模板，以 VHF、VHR，VLF、VLR 為引物擴增 VH、VL 序列（圖 2）。

圖2 PCR擴增獲得抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)及其連接linker序列

為保證抗體庫多樣性，VH上游用簡并引物，且VH、VL上下游引物均依據(jù)抗體可變區(qū)框架區(qū)設(shè)計（Luo 和 Xia，2012；Reddy 等，2010）。 最終獲得VH片段大小約為350 bp，VL片段大小約為700 bp（圖 2）， 與 Lee等 （2004） 報道相符。（Gly4Ser）3柔韌性很強，不會對抗體可變區(qū)二級結(jié)構(gòu)及肽鏈折疊產(chǎn)生影響，具有維持天然抗體特異性結(jié)合性質(zhì)的作用，其被作為linker廣泛用于scFv庫的構(gòu)建。故隨后以VH、VL基因為模板，以VHF、VH+linker R，VLF、VL+linker F 為引物，PCR擴增后獲得VH+linker和VL+linker序列 （圖2）（Luo 和 Xia，2012）。

2.2 重疊延伸 PCR構(gòu)建 VH+linker+VL（scFv）和VH+linker+VL+6His myc（scFv-6His myc）序列將膠回收純化的VH+linker和VL+linker序列等物質(zhì)的量濃度混合，利用引物VHF和VLR進行重疊延伸PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，VH與VL基因通過linker連接獲得scFv基因，即VH+linker+VL序列，片段大小約為1000 bp。以切膠回收純化的scFv基因為模板，用VHF和His-Rev VLR引物進行PCR擴增，獲得帶有6His標(biāo)簽的scFv序列（scFv-6His）。在PCR擴增過程中發(fā)現(xiàn)，普通PCR和重疊延伸PCR效率都不高，非特異性擴增現(xiàn)象明顯，需要反復(fù)多次PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳后“切膠-回收-純化”富集目的序列。這可能與上、下游引物及文庫中scFv基因序列中的高GC含量有關(guān)（陳銳，2009）。

圖3 重疊延伸PCR和PCR獲得VH+linker+VL序列和VH+linker+VL+6His序列

圖4 重疊延伸PCR獲得VH+linker+VL+6His myc+gⅢ tether+3'loop序列和T7+5'loop+SD+VH+linker+VL+6His myc+gⅢ tether+3'loop序列

2.3 核糖體展示篩選高親和力scFv序列文庫的構(gòu)建 核糖體展示中，完整的元件構(gòu)建決定其體外轉(zhuǎn)錄翻譯效果。首先，為使展示蛋白更好地折疊，并與抗原蛋白結(jié)合，翻譯完成后完整蛋白需脫離核糖體但不能脫落，故展示蛋白基因C端需融合一段非結(jié)構(gòu)蛋白基因“tether”，由此特殊肽段錨定核糖體。此外，為防止mRNA降解，在3'及5'端添加莖環(huán)結(jié)構(gòu)，能夠?qū)⒄故拘侍岣呒s15倍（Plückthun，2012）。 將 scFv-6His序列做膠回收純化后與合成的gⅢtether元件等物質(zhì)的量濃度混合，利用引物VHF和T6te做重疊延伸PCR，獲得scFv+6His myc+gⅢtether+5'loop序列，約1300 bp（圖4）。在體外轉(zhuǎn)錄過程中還需要強啟動子（T7）以高效獲得RNA及SD序列以保證翻譯過程順利進行。故將所得序列膠回收純化后與合成的T7SD元件等物質(zhì)的量濃度混合，并利用引物T7B和T6te進行重疊延伸PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示獲得完整核糖體展示序列，約1420 bp（圖4）。在此過程中非特異性擴增現(xiàn)象更加嚴重，或與兩端莖環(huán)結(jié)構(gòu)有關(guān)，在重疊延伸PCR連接T7SD和gⅢtether過程中引物設(shè)計必須在莖環(huán)結(jié)構(gòu)部分，這也可能是造成擴增效率不高的原因之一。在擴增過程中嘗試通過改變引物堿基數(shù)目改進，但效果不佳。最終采取多次擴增、切膠回收的方式獲得抗體庫。

3 結(jié)論

OmpC蛋白免疫BALB/c小鼠，獲得骨髓漿細胞。以其總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，PCR擴增獲得 VH和 VL， 并通過（Gly4Ser）3 linker連接兩片段，獲得scFv庫。通過重疊延伸PCR法添加T7啟動子、SD、gⅢ tether和兩端莖環(huán)結(jié)構(gòu)等元件，最終成功構(gòu)建針對大腸桿菌外膜蛋白C單鏈抗體核糖體展示文庫。為進一步通過核糖體展示法篩選高特異性、高親和力scFv抗體奠定了基礎(chǔ)，為飼料和其他領(lǐng)域革蘭氏陰性病原菌檢測及靶向抗菌劑和關(guān)聯(lián)藥物的靶向定位區(qū)的分子設(shè)計提供了新思路，也為其他關(guān)聯(lián)領(lǐng)域scFv抗體的制備提供了參考方法和材料基礎(chǔ)。

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