納豆芽孢桿菌發(fā)酵制備高蛋白微生態(tài)血粉的研究

潘春梅， 李彥紅， 袁麗娟

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程系，河南鄭州 450046；2.鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，河南鄭州 450052；3.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心，河南鄭州 450006）

動(dòng)物血液中蛋白質(zhì)含量高，可作為畜禽蛋白質(zhì)飼料來源。但是由于加工成本高，設(shè)備不配套以及血粉中蛋白質(zhì)分子量大、難消化、適口性差等原因，造成血粉資源大量浪費(fèi)，而且嚴(yán)重污染環(huán)境（方俊等，2006）。目前利用微生物發(fā)酵方法對(duì)血粉進(jìn)行處理，可不同程度解決血粉消化率低、氨基酸平衡性差、功能單一等問題。如能利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，利用益生菌將血粉進(jìn)行微生物發(fā)酵，在提高其蛋白消化利用率和適口性的同時(shí)，增加益生菌的數(shù)量，制備高效的高蛋白微生態(tài)血粉，對(duì)于改善動(dòng)物的健康狀況有著重要意義。因此，本試驗(yàn)選擇具有較高蛋白酶活力和顯著益生特性的納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株，利用響應(yīng)面方法對(duì)微生態(tài)血粉的發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 菌種 納豆芽孢桿菌 （Bacillus natto ZZ18）由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 原料 血粉由河南君安生物科技有限公司提供，豆粕粉由鄭州天宇飼料科技有限公司提供，粗蛋白質(zhì)含量分別為79.3%、43.2%。

1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，121℃滅菌15 min。血粉發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 10，玉米粉 10，血粉 100，豆粕粉10，初始pH自然，裝液量50 mL/250 mL三角瓶，115℃滅菌30 min。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 發(fā)酵培養(yǎng) 接一環(huán)已經(jīng)活化的納豆芽孢桿菌至種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。將擴(kuò)大培養(yǎng)過的納豆芽孢桿菌加入到滅菌后的血粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，在一定條件下恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。取出培養(yǎng)液，測定細(xì)菌總數(shù)、游離氨基酸含量、可溶性蛋白質(zhì)含量，并計(jì)算水解度。每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。

1.4.2 發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，包括12個(gè)析因試驗(yàn)和3個(gè)中心試驗(yàn)。以發(fā)酵溫度（X1）、接種量（X2）、搖床轉(zhuǎn)速（X3）為自變量，經(jīng)過下述公式分別進(jìn)行編碼轉(zhuǎn)換：X1=（X1-34）/4；X2=（X2-6）/2；X3=（X3-180）/40。響應(yīng)面優(yōu)化回歸分析模型為：

式中：β0、βi、βii和 βij分別是截距及回歸系數(shù)；xi、xj是編碼轉(zhuǎn)換后的自變量；響應(yīng)值Y為血粉的水解度。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1和表2，利用Minitab軟件對(duì)響應(yīng)值和自變量之間的關(guān)系進(jìn)行擬合統(tǒng)計(jì)分析。

表1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排及不同發(fā)酵條件下血粉的水解度

1.4.3 水解度的測定 取血粉發(fā)酵液10 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸10 mL，混勻后靜置30 min，4℃、10000 r/min離心 15 min，半微量凱氏定氮法測定上清液中三氯乙酸（TCA）可溶氮含量。分別測定血粉發(fā)酵前總氮含量以及發(fā)酵前后可溶性氮含量，按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

水解度 （DH）/%=（發(fā)酵后的可溶性氮含量-發(fā)酵前的可溶性氮含量）/發(fā)醇前總氮含量×100。

1.4.4 游離氨基酸總量的測定 采用茚三酮法測定游離氨基酸總量（龐偉，2009）。

1.4.5 蛋白酶活性測定 蛋白酶活性采用Folin酚法測定，酶活定義為1 mL酶液在40℃、pH 7.2條件下，每分鐘水解酪蛋白釋放出1 μg酪氨酸所需的酶量為1個(gè)活力單位（龐偉，2009）。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌發(fā)酵血粉工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化 在納豆芽孢桿菌發(fā)酵血粉的過程中，發(fā)酵溫度、接種量和轉(zhuǎn)速都會(huì)影響納豆芽孢桿菌的生長和血粉的水解。利用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究發(fā)酵溫度（X1）、接種量（X2）、轉(zhuǎn)速（X3）對(duì)納豆芽孢桿菌血粉發(fā)酵水解度的影響。利用統(tǒng)計(jì)軟件MINITAB14.11對(duì)血粉水解度DH（表2）進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合和數(shù)據(jù)分析，建立最佳血粉發(fā)酵條件的二次響應(yīng)面回歸模型。由表3可知，擬合的三元二次方程為：

式中：X1、X2和X3分別代表發(fā)酵溫度、接種量和搖床轉(zhuǎn)速的編碼水平；Y1代表血粉水解度預(yù)測值。

為檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)血粉水解度的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，一次項(xiàng) X1、X3極顯著（P ＜ 0.01），X2不顯著，表明發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)血粉的水解具有較大的影響。二次項(xiàng)中 X12、X22、X32均具有顯著差異（P ＜ 0.1）。 交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3均不顯著，說明發(fā)酵溫度和接種量、發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)速和接種量的交互作用對(duì)發(fā)酵血粉無顯著影響。

為檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)水解度DH的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。由表4可知，二次回歸模型的F值為15.06，相應(yīng)的概率值P＜0.004，模型決定系數(shù)R2=0.964，表明該模型回歸顯著，說明該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，預(yù)測值和實(shí)測值之間具有高度的相關(guān)性，較好地反映了血粉水解度DH與發(fā)酵溫度、接種量、轉(zhuǎn)速的關(guān)系，因此可以用此模型對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵血粉水解度進(jìn)行分析和預(yù)測。

表3 Box-Benhnken試驗(yàn)對(duì)血粉水解度的回歸分析結(jié)果

表4 血粉水解度回歸方程的方差分析

為了求得發(fā)酵血粉的最佳培養(yǎng)條件，對(duì)所得的回歸擬和方程分別對(duì)各自的變量求一階偏導(dǎo)，并令其為0，得到三元一次方程組，求解此方程組得出該模型的極值點(diǎn)：X1=0.6449、X2=0.1309、X3=0.5532、Y=29.2，即當(dāng)發(fā)酵溫度36.6℃、接種量6.6%和轉(zhuǎn)速為202 r/min時(shí)，發(fā)酵血粉的理論最大DH值為29.2%。

根據(jù)獲得的回歸方程，利用Minitab繪出不同發(fā)酵條件下發(fā)酵血粉水解度的響應(yīng)面分析圖及其等高線圖，見圖1至圖3。每個(gè)響應(yīng)面分別代表兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用，此時(shí)第三個(gè)變量保持在最佳值水平，由響應(yīng)面圖可以看出：所有的響應(yīng)面圖均呈現(xiàn)明顯的峰值，這意味著最佳的發(fā)酵條件在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的考察范圍內(nèi)，其中溫度對(duì)發(fā)酵血粉水解度的影響最為顯著，當(dāng)轉(zhuǎn)速和接種量固定在最佳水平時(shí)，發(fā)酵溫度在30～36.6℃，發(fā)酵血粉的水解度隨著發(fā)酵溫度的升高而顯著提高，當(dāng)溫度高于36.6℃時(shí)，水解度降低。當(dāng)發(fā)酵溫度和接種量固定在最佳水平時(shí)，轉(zhuǎn)速由140 r/min增至202 r/min，發(fā)酵血粉的水解度則隨之提高。這是因?yàn)樵谶m當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和溶氧水平下，納豆芽孢桿菌能產(chǎn)生較高活力的蛋白酶，將血粉蛋白中的高分子物質(zhì)水解。同時(shí)，由相應(yīng)的等高線圖可以看出，在圖1至圖3中的等高線圖接近圓形，交互作用均不顯著。

圖1 溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵血粉水解度的影響（接種量固定為6.6%）

圖2 接種量和轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵血粉水解度的影響（溫度固定為36.6℃）

圖3 接種量和溫度對(duì)發(fā)酵血粉水解度的影響（轉(zhuǎn)速固定為202 r/min）

2.2 納豆芽孢桿菌發(fā)酵血粉最佳發(fā)酵條件驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)求得的最優(yōu)回歸方程和試驗(yàn)結(jié)果，得到發(fā)酵血粉水解度達(dá)最大值時(shí)的組合為：發(fā)酵溫度36.6℃、接種量6.6%和轉(zhuǎn)速為202 r/min。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)測得的數(shù)據(jù)為29.1%±0.2%（n=5），試驗(yàn)值與理論預(yù)測值非常接近，可見該模型可以較好地預(yù)測實(shí)際發(fā)酵情況，從而也證明了響應(yīng)面法優(yōu)化血粉發(fā)酵條件的可行性。

2.3 發(fā)酵血粉的組分分析 血粉與玉米粉、豆粕粉等混合物料經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后，發(fā)酵液外觀為淡紅色，具有發(fā)酵血液特殊醇香，無明顯血腥味和不良異味，室溫下保存6個(gè)月不變質(zhì)。經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后，發(fā)酵液中可溶性氮含量由發(fā)酵前的0.35 g/L增加至4.24 g/L，游離氨基酸含量由發(fā)酵前的0.17 g/L增加至1.09 g/L，發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量下降了29%，蛋白酶活力達(dá)到1576 U/mL。這說明納豆芽孢桿菌在發(fā)酵過程中分泌了大量蛋白酶，將血粉中的大分子量蛋白質(zhì)降解成氨基酸和小分子量的肽類，從而導(dǎo)致總蛋白質(zhì)含量下降，可溶蛋白與游離氨基酸含量上升。另外，發(fā)酵過程中納豆芽孢桿菌大量生長，產(chǎn)生的菌體蛋白被水解也可提高發(fā)酵血粉的氨基酸含量，改善其氨基酸組成和產(chǎn)品風(fēng)味。發(fā)酵血粉蛋白的可降解性大大提高，產(chǎn)物中含有大量的納豆芽孢桿菌活菌體（8.8×108cfu/mL），并具有較高的蛋白酶活力，可作為潛力巨大的高蛋白益生產(chǎn)品使用（表5）。

表5 血粉發(fā)酵液的成分分析

3 結(jié)論

3.1 利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立影響發(fā)酵血粉水解度的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)該模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)，獲得最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度36.6℃、接種量6.6%、轉(zhuǎn)速202 r/min。在優(yōu)化條件下經(jīng)5批搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)驗(yàn)證，預(yù)測值與驗(yàn)證試驗(yàn)平均值接近，與原始培養(yǎng)條件相比，水解度提高了42.3%，達(dá)到29.1%。

3.2 血粉經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后，氣味有所改善，發(fā)酵液中可溶性氮和游離氨基酸含量分別增加至4.24 g/L和1.09 g/L，蛋白質(zhì)含量下降了29%，蛋白酶活力達(dá)到1576 U/mL，納豆芽孢桿菌活菌數(shù)量達(dá)到8.8×108cfu/mL，具有良好的營養(yǎng)價(jià)值和益生特性。

[1]方俊，盧向陽，蔣紅梅，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化制備豬血小肽發(fā)酵條件的研究[J].食品科學(xué)，2006，27（8）：141～144.

[2]龐偉.豬血多肽的發(fā)酵法制備及其ACE抑制活性研究：[碩士學(xué)位論文][D].合肥：合肥工業(yè)大學(xué)，2009.