微波輔助提取玉米蛋白粉中的玉米黃色素研究

趙文揚(yáng)， 康明麗， 郭小磊， 王蕾娜

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018）

玉米蛋白粉也稱為玉米麩質(zhì)粉，是加工玉米淀粉的副產(chǎn)物之一（趙文揚(yáng)等，2014），其中主要成分是玉米醇溶蛋白和玉米黃色素。玉米黃色素是主要由β-胡蘿卜素、玉米黃素（3-3’-二羥基-β-胡蘿卜素）、黃體素（3-3’-二羥基-α-胡蘿卜素）和隱黃素（3-羥基-β-胡蘿卜素）組成的類胡蘿卜素混合物，其中雙羥基胡蘿卜素的比重最大，其次是單羥基胡蘿卜素 （Quackenbush等，1970）。玉米蛋白粉中類胡蘿卜素含量為100～300 mg/kg（李麗和崔波，2010）。研究表明，玉米黃色素可以增強(qiáng)免疫力，降低患癌癥、心血管疾病、眼部疾病和白內(nèi)障等風(fēng)險(xiǎn)（孫曉芳等，2010；吳靜等，2009；孫震等，2006a、b）。 提取玉米蛋白粉中玉米黃色素的方法主要有混合有機(jī)溶劑萃取、超臨界CO2萃取、微波法等（周芳和郝紅英，2014）。有機(jī)溶劑法使用的提取設(shè)備較為常用；超臨界CO2萃取需要特殊的設(shè)備，儀器設(shè)備昂貴，而且分離步驟繁雜；微波輔助可以消除熱梯度，具有速度快、能耗低、提取質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。黃瓊等（2011）利用微波輔助提取玉米黃色素，提高了提取率，但是微波時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)破壞玉米黃色素的結(jié)構(gòu)。

因此，本試驗(yàn)利用分析軟件Design expert 8.0.6進(jìn)行Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)微波提取玉米蛋白粉中玉米黃色素的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，為工業(yè)化提取提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 玉米蛋白粉：河北誠(chéng)業(yè)制糖有限公司提供；β-胡蘿卜素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇、二氯甲烷等試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、PL203電子分析天平 （梅特勒-托利多儀器有限公司）、MP511型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（上海三信儀表廠）、Galanz G8023 YSL-V1微波爐 （佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 β-胡蘿卜素最大吸收波長(zhǎng)的確定 準(zhǔn)確稱取20 mg β-胡蘿卜素，溶解于100 mL無(wú)水乙醇中。以無(wú)水乙醇做空白參比，在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)400～600 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長(zhǎng) λmax。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取20 mg β-胡蘿卜素，配制成濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取1～8 mL，用無(wú)水乙醇定容至50 mL。在λmax處測(cè)其吸光度值，用最小二乘法做線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）及標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

圖1 β-胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：

y=24.128x+0.0248，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992；

式中：y為吸光度；x為β-胡蘿卜素濃度，mg/mL。

1.3.3 提取溶劑的選擇 準(zhǔn)確稱取2 g玉米蛋白粉，分別溶于20 mL無(wú)水乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑中，pH值調(diào)至5，靜置提取1 h后過(guò)濾，在λmax處測(cè)其吸光度值并計(jì)算得率。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取2 g玉米蛋白粉按料液比 1∶20～1∶4（g/mL）溶于有機(jī)溶劑（無(wú)水乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯等）中，分別調(diào)節(jié)pH值至2～13，微波功率 160、320、480、640、800 W，微波時(shí)間10～60 s。提取完成后，過(guò)濾，在λmax處測(cè)其吸光度值，計(jì)算得率。由于微波會(huì)產(chǎn)生大量的熱，破壞色素的穩(wěn)定性，所以提取時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

1.3.5 玉米黃色素的得率計(jì)算 在λmax處測(cè)得吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得玉米黃色素中β-胡蘿卜素含量（mg/mL），利用公式計(jì)算玉米蛋白粉中玉米黃色素的提取率。

玉米黃色素的得率/（mg/g）=稀釋倍數(shù)×C×V/所用的玉米蛋白粉質(zhì)量（g）；

式中：C為β-胡蘿卜素含量，mg/mL；V為提取液的體積，mL。

1.3.6 優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Design Expert 8.0.6進(jìn)行三因素三水平的Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以料液比、pH值和微波設(shè)定為研究因素，以玉米黃色素的得率為響應(yīng)值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)處理重復(fù)三次，試驗(yàn)結(jié)果均以平行試驗(yàn)測(cè)定所得數(shù)據(jù)的 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。處理間的平均數(shù)多重比較用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的Duncan’s分析法，最小差異顯著水平為5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng) 由圖2可見(jiàn)，波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示β-胡蘿卜素在波長(zhǎng)為446 nm處有最大吸收峰。將提取液進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，得到最大吸收波長(zhǎng)為446 nm。這與張梅秀等（2013）和李曉玲等（2014）的研究結(jié)果相同。

圖2 β-胡蘿卜素最大吸收波長(zhǎng)的確定

2.2 提取溶劑的選擇 由圖3可知，用不同提取溶劑提取玉米黃色素，得率由大到小分別為：二氯甲烷＞無(wú)水乙醇＞乙酸乙酯＞氯仿＞四氯化碳＞丙酮＞石油醚＞正己烷。從圖3可以看出，無(wú)水乙醇與二氯甲烷對(duì)玉米黃色素得率的影響無(wú)顯著差異（P>0.05）。由于二氯甲烷和乙酸乙酯具有刺激性氣味，而無(wú)水乙醇具有特殊的香味且易揮發(fā)，適用于食品加工，所以選擇無(wú)水乙醇為最佳提取溶劑。李曉玲等（2014）通過(guò)溶劑篩選，選擇無(wú)水乙醇作為提取溶劑提取玉米黃色素。敬思群等（2010）通過(guò)溶劑篩選，選擇成本較低，易于濃縮蒸發(fā)且易回收利用的無(wú)水乙醇作為玉米蛋白粉中黃色素的提取劑。

圖3 提取溶劑的選擇

2.3 pH值對(duì)玉米黃色素得率的影響 由圖4可知，pH值的變化對(duì)玉米黃色素得率的影響顯著（P<0.05）。隨著pH值的升高，玉米黃色素的得率逐漸增加，在pH為5時(shí)達(dá)到最大，隨后逐漸減小。由于玉米黃色素在弱酸性和中性范圍內(nèi)比較穩(wěn)定（敬思群等，2010），因此，提取玉米黃色素的最佳pH為5。

圖4 pH值對(duì)玉米黃色素得率的影響

2.4 料液比對(duì)玉米黃色素得率的影響 由圖5可知，料液比的變化對(duì)玉米黃色素得率的影響顯著。隨著料液比例的逐漸減小，玉米黃色素的得率逐漸增加，1∶6時(shí)得率最大，隨后又減小，因此最佳料液比選擇 1∶6。

圖5 料液比對(duì)玉米黃色素得率的影響

2.5 微波功率對(duì)玉米黃色素得率的影響 由圖6可知，微波功率的變化對(duì)玉米黃色素得率的影響顯著。隨著微波功率的增加，玉米黃色素的得率逐漸增加，到640 W時(shí)得率最大，640 W之后得率緩慢減小。微波加熱主要是通過(guò)穿透水將能量傳遞到植物物料內(nèi)部使細(xì)胞內(nèi)溫度突然升高，連續(xù)的高溫使其內(nèi)部壓力超過(guò)細(xì)胞空間膨脹的能力，從而導(dǎo)致細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)自由流出，傳遞到周圍被溶解。所以在一定時(shí)間內(nèi)微波功率越大傳遞能量就越多，植物因細(xì)胞破裂而溶出的內(nèi)容物也越多。但是功率過(guò)大會(huì)分解色素（張守文和韓英，2014）。因此最佳微波功率為640 W。

圖6 微波功率對(duì)玉米黃色素得率的影響

2.6 微波時(shí)間對(duì)玉米黃色素得率的影響 由圖7可知，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，玉米黃色素的得率逐漸增加，達(dá)到一個(gè)最大值之后緩慢減小，可能是由于微波放熱的過(guò)程中，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，微波產(chǎn)生的熱量逐漸破壞玉米黃色素的結(jié)構(gòu)，使玉米黃色素分解，玉米黃色素得率逐漸減小。姚壯和（2013）認(rèn)為利用微波輔助法來(lái)提取色素，應(yīng)當(dāng)把微波功率和作用時(shí)間兩個(gè)因素結(jié)合，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行提取條件的優(yōu)化，以確定最佳提取條件。

圖7 微波時(shí)間對(duì)玉米黃色素得率的影響

2.7 優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定料液比為 1∶8～1∶4（g/mL），pH 值為 4～6。 由于在微波初期，微波功率為640 W時(shí)，微波20 s，玉米黃色素得率最大，微波功率為640 W，微波15、25 s和微波功率為480 W，微波25 s，玉米黃色素得率差異不顯著（P>0.05），因此選擇微波功率大且時(shí)間短的微波條件，當(dāng)時(shí)間相同時(shí)，選擇微波功率較小的微波條件，以減少玉米黃色素的損失。因此選擇微波條件分別為640 W、15 s，640 W、20 s和480 W、25 s。試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1；試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2；回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

經(jīng)分析得到的得率Y對(duì)料液比、pH值和微波條件的二次多元回歸方程如下：

Y=0.26-0.003021A+0.001399B+0.002965C-0.004588AB-0.001007AC+0.0006714BC-0.049A2-0.038B2-0.039C2。

表3的方差分析結(jié)果表明，方程復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方 R2=0.9981，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）。 R2adj為0.9956，表明建立的模型能解釋99.56%響應(yīng)值的變化，能很好地描述玉米蛋白粉中的玉米黃色素的得率隨提取條件的變化規(guī)律。因此該模型可用于預(yù)測(cè)響應(yīng)值。

此外，由表3還可以看出，因素A、B、C對(duì)玉米黃色素的得率的影響極顯著（P＜0.01）。

響應(yīng)面圖及等高線圖見(jiàn)圖8～10，各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響結(jié)果可通過(guò)該組圖直觀反映出來(lái)。等高線的形狀反映了交互作用的強(qiáng)弱，橢圓表示兩兩交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著。

圖8 料液比（A）與pH（B）響應(yīng)面圖和等高線

圖9 料液比（A）與微波條件（C）響應(yīng)面圖和等高線

由圖8可以看出，料液比和pH的交互作用顯著，隨著料液比和pH的增加，得率逐漸增加，但是料液比和pH過(guò)高，得率下降，因此料液比為1∶6左右，pH為5左右，得率最大。

由圖9可以看出，料液比和微波條件的交互作用不顯著，隨著料液比的增加，微波條件的改變，得率逐漸增加，但是料液比過(guò)高，微波功率減小微波時(shí)間增加，得率下降，因此料液比為1∶6左右，微波條件為640 W、20 s左右，得率最大。

由圖10可以看出，pH和微波條件的交互作用影響不顯著，隨著pH的增加，微波條件的改變，得率逐漸增加，但是pH過(guò)高，微波功率減小微波時(shí)間增加，得率下降，因此pH為5左右，微波條件為640 W、20 s左右，得率最大。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)優(yōu)化分析得到的最佳提取條件料液比為1∶6，pH值為5，微波功率640 W，微波時(shí)間20 s。進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到玉米黃色素的得率為0.2650 mg/g，與預(yù)測(cè)值接近。

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面建立了料液比、pH值以及微波條件三因素的回歸模型，根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，得到最優(yōu)的工藝參數(shù)為料液比 1∶6，pH值 5，微波功率640 W，微波時(shí)間20 s，玉米黃色素的得率為0.2650 mg/g。建立的回歸模型方程能夠很好地反映玉米黃色素的提取條件與玉米黃色素得率的關(guān)系，同時(shí)確立了提取玉米黃色素的最優(yōu)條件。本文研究結(jié)果可以為玉米黃色素的工業(yè)化提取提供參考依據(jù)。

[1]黃瓊，丁玲，黃容.微波法萃取玉米黃色素的工藝[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2011，32（12）：234～237.

[2]敬思群，任志艷，歐陽(yáng)位琪.玉米蛋白粉中黃色素的提取工藝及穩(wěn)定性研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（10）：2051～2058.

[3]李麗，崔波.玉米蛋白粉的綜合利用及研究進(jìn)展[J].糧油科技與經(jīng)濟(jì)，2010，35（3）：45～47.

[4]車曉玲，陳相艷，王文亮，等.超微粉碎輔助超聲-微波法提取玉米黃色素[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2014，14（8）：99～106.

[5]劉振春，張嵐.微波酶法提取玉米蛋白粉中玉米黃素的研究[J].食品科學(xué)，2008，29（1）：169～172.

[6]孫曉芳，辛志強(qiáng)，李冰，等.玉米黃素對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥小鼠血脂的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2010，30（4）：507～509.

[7]孫震，奚海燕，陳正行，等.玉米蛋白粉中葉黃素和玉米黃素對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的研究[J].食品科學(xué)，2006，27（11）：505～509.

[8]孫震，李博，姚惠源.玉米蛋白粉中葉黃素和玉米黃素對(duì)口腔癌細(xì)胞DNA 的損傷作用[J].食品科技，2006，31（4）：131～134.

[9]吳靜，張美霞，嚴(yán)密.葉黃素及玉米黃素與老年性黃斑變性的研究進(jìn)展[J].眼科新進(jìn)展，2009，29（10）：791～795.

[10]姚壯和.微波輔助提取芒果皮黃色素的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2013，29（8）：1973～1977.

[11]張梅秀，鄭明洋，王元秀.響應(yīng)面法優(yōu)化玉米黃色素的提取[J].濱州學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，29（3）：109～113.

[12]張守文，韓英.玉米蛋白粉中黃色素超聲微波提取工藝的優(yōu)化[J].中國(guó)食品添加劑，2014，1：95～101.

[13]趙文揚(yáng)，康明麗，王蕾娜，等.玉米蛋白粉的綜合利用[J].食品工程，2014，2：3～5.

[14]周芳，郝紅英.玉米黃色素提取工藝研究進(jìn)展[J].廣東化工，2014，41（21）：105～106.

[15]Quackenbush F W，Dyer M A，Smallidge R L.Vtamins and other nutrients：Analysis for carotenes andxanthophylls in dried plant materials[J].Journal of the AOAC，1970，53（1）：181～185.