重組人瘦素蛋白的原核表達、純化和生物學活性鑒定

周向陽，李仲凱，郝騰飛，丁光碩，鄭文慧，李文娟

(1.河北大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，河北 保定 071000；2.河北省炎性自身免疫性疾病發(fā)病機制及防治重點實驗室，河北 保定 071000；3.河北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，河北 保定 071001；4.河北大學 公共衛(wèi)生學院，河北 保定 071000)

瘦素(Leptin)是由定位于人類染色體7q31.3的肥胖基因(Obese gene，Ob)表達的產(chǎn)物，是167個氨基酸組成的非糖基化蛋白[1].成熟的Leptin是切掉N端21個氨基酸信號肽后的具有強親水性的單鏈球形分子，分泌入血后，以游離狀態(tài)和結(jié)合狀態(tài)2種形式存在，前者為生物活性狀態(tài)[2].Leptin作為脂肪組織和中樞神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系的外周信號，多數(shù)研究集中于其在體質(zhì)量調(diào)節(jié)方面的作用，旨在闡明人類肥胖的機理[3].然而，越來越多的數(shù)據(jù)表明，Leptin不僅在調(diào)節(jié)食物攝入和能量平衡方面發(fā)揮著重要作用，而且還作為一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素調(diào)節(jié)機體多種生理功能[4-5].研究表明，Leptin與肥胖、糖尿病、心血管等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6]；同時，肥胖患者血漿中高水平的Leptin在多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[7].

根據(jù)Leptin的非糖基化蛋白特性，具有生物活性的hLeptin可以在原核生物中有效表達.因此，研究者試圖在大腸桿菌中表達重組hLeptin，但大多數(shù)重組hLeptin主要表達于不溶性包涵體[8].已有研究從大腸桿菌包涵體中純化重組hLeptin，然而，對于商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)而言，程序復(fù)雜而且效率低下[9].此外，瘦素的生物學效力根據(jù)所采用的重組表達折疊方法不同也有很大差異[10].

本研究主要通過大腸桿菌(Escherichiacoli)的密碼子使用偏向性合成了hLeptin成熟肽編碼序列，并在大腸桿菌中以SUMO融合標簽的形式高效表達重組hLeptin，生物學活性實驗表明，純化的hLeptin具有完整的生物活性，這些都為進一步了解hLeptin的生物學功能和生理作用機制奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與細胞

大腸桿菌 pET-30a(+)載體購自Invitrogen公司.大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細胞均購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司.人肝癌HepG2細胞由本實驗室保存,細胞生長于體積分數(shù)為10%的胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基，于體積分數(shù)為5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng).

1.1.2 試劑

FastPfu Fly DNA Polymerase購自TransGen Biotech公司；2×Seamless Cloning Mix、瓊脂糖均購自Biomed公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Biomiga公司;膠回收試劑盒購自Promega公司;BCA法蛋白濃度測定試劑盒購自Sangon Biotech;蛋白膠試劑盒購自康維世紀生物科技有限公司;0.01 mol/L PBS溶液(磷酸鹽緩沖溶液)、CCK8試劑購自Solarbio公司.

1.1.3 實驗動物

6～8周齡的健康雄性KM小鼠12只，體質(zhì)量(25.3±1.2) g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司.按照河北大學《實驗動物保護條例》，小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體(SPF級)動物房中，期間自由進水進食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～24 ℃.

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得

基于GenBank中hLeptin的基因序列(Accession No:NM_000230)，選取其成熟肽基因序列作為克隆的對象，序列全長為438 bp，目的基因經(jīng)密碼子優(yōu)化，并合成在pET-30a(+)質(zhì)粒上，由金唯智生物科技有限公司完成.

1.2.2 原核表達載體的構(gòu)建

根據(jù)hLeptin成熟肽基因片段序列，利用NEB Builder軟件(https://nebuilder.neb.com/)設(shè)計相應(yīng)引物(表1)，下劃線為線性化pET-30a(+)-SUMO載體的同源序列.使用hLeptin引物F和R擴增基因片段，PCR反應(yīng)體系：2×Pfx mix 12.5 μL，模板0.5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，無酶ddH2O 11 μL.反應(yīng)條件:98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，40個循環(huán)；72 ℃ 5 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收純化目的基因片段.將hLeptin成熟肽基因片段與線性化pET-30a(+)-SUMO載體進行同源重組反應(yīng)，反應(yīng)體系：載體1 μL，目的片段4 μL，2×Clone mix 5 μL，充分混勻后，50 ℃反應(yīng)1 h.將重組體轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切驗證并篩選陽性單克隆后送至華大基因進行測序，得到重組質(zhì)粒pET-30a(+)-SUMO-Lep.

表1 本研究中所使用的引物Tab.1 Primers used for clone in this study

1.2.3 細菌培養(yǎng)及目的蛋白最適溫度的誘導(dǎo)表達

將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pET-30a(+)-SUMO-Lep轉(zhuǎn)化至表達E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布于含有硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate，Kan)的 LB 平板上，培養(yǎng)箱中 37 ℃ 過夜培養(yǎng).挑取單克隆于2 mL的LB液體培養(yǎng)基中(50 mg/mL Kan)，37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng).以體積分數(shù)為1%的接種量接入2 mL的LB液體培養(yǎng)基中(50 mg/mL Kan)，分別在37、30、25、20 ℃ 培養(yǎng)至OD600為 0.6 時加入誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為 0.1 mmol/L，之后在各溫度分別培養(yǎng)，220 r/min條件下培養(yǎng) 4、8、12、20 h.12 000 r/min離心2 min收集菌體，用1 mL的Lysis buffer(10 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑；pH 8)洗滌重懸菌體，再次離心，利用1 mL的Lysis buffer重懸菌體，進行超聲波破碎.將破碎后的細菌裂解物在4 ℃下12 000 r/min離心 10 min，上清液即為含有可溶性表達蛋白的粗提液，同時將沉淀用1 mL的Lysis buffer重懸.通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測各個溫度下的表達效果.

1.2.4 hLeptin蛋白的純化及濃度測定

將200 mL誘導(dǎo)完成后的菌液6 000 r/min離心10 min進行富集，取10 mL Ni-NTA Lysis buffer 重懸并收集菌體，6 000 r/min離心10 min，再用100 mL Ni-NTA Lysis buffer (50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L 咪唑；pH 8) 將菌體重懸，用高壓均質(zhì)機進行破碎.破碎壓力為0 MPa 3次，40 MPa 3次，80 MPa 3次，100 MPa 3次.將高壓破碎后的細胞裂解液12 000 r/min、4 ℃離心 10 min，收集上清液粗提液.

使用鎳柱親和層析法對目的蛋白進行純化，首先使用10個柱體積Ni-NTA的 Lysis buffer平衡鎳柱，然后將上清液粗提液緩慢加入鎳柱；再加入5個柱體積Ni-NTA 的Washing buffer (50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑；pH 8)洗脫雜蛋白，最后用Ni-NTA 250 mmol/L Elution buffer(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、250 mmol/L咪唑；pH 8)和Ni-NTA 350 mmol/L Elution buffer(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、350 mmol/L咪唑；pH 8)對目的蛋白進行洗脫并收集，得到純化后的產(chǎn)物，利用SDS-PAGE對目的蛋白的純化效果進行檢測.運用BCA法以BSA作為標準蛋白測定hLeptin相對蛋白濃度.

1.2.5 瘦素的生物活性鑒定

小鼠減肥實驗：將12只健康雄性KM小鼠隨機分為對照組和實驗組(n=6).正常飼養(yǎng)7 d后，按每g體質(zhì)量1 μL,實驗組給與hLeptin (2.5 μg/μL)，對照組給與PBS溶液(0.01 mol/L)，每天上午9：00和下午5：00腹腔注射，持續(xù)1周.每日定時稱體質(zhì)量，并觀察記錄食物攝入量.比較2組小鼠體質(zhì)量和攝食結(jié)果的差異.

成熟hLeptin蛋白對HepG2細胞的增殖作用：將生長狀況良好的HepG2細胞用質(zhì)量分數(shù)為0.25%的胰酶消化，并用含體積分數(shù)10%血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整HepG2細胞濃度為5×104/mL后接種96孔細胞培養(yǎng)板 (每孔100 μL).貼壁生長后換無血清DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞同步化.吸除細胞培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)基，分別加入含hLeptin質(zhì)量濃度為0、50、100、200、400 ng/mL的無血清DMEM培養(yǎng)基，每個質(zhì)量濃度設(shè)6個平行孔，其中無hLeptin(0 ng/mL)為對照組.繼續(xù)培養(yǎng)12 、24 h后，向待測孔各加入10 μL的CCK8，孵育1.5 h，用酶標儀測定450 nm波長處每孔的吸光度值A(chǔ)(以不加細胞的空白孔調(diào)零)，計算細胞增殖率.

細胞增殖率=(A實驗-A調(diào)零)/(A對照-A調(diào)零)×100%.

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 表達質(zhì)粒的構(gòu)建

以帶有合成基因的pET-30a(+)-Lep質(zhì)粒和pTWIN1質(zhì)粒為模板，分別擴增hLeptin基因和SUMO標簽片段，結(jié)果如圖1a所示，SUMO片段全長296 bp，帶有hLeptin片段的質(zhì)粒全長5 767 bp.利用Gibson Assembly無縫克隆，成功構(gòu)建了重組載體pET-30a(+)-SUMO-Lep，用BamHⅠ和Hind Ⅲ進行酶切驗證的結(jié)果如圖1b所示，與預(yù)期結(jié)果一致.將得到的陽性克隆送至華大基因進行測序驗證，測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件與pET-30a(+)-SUMO-Lep拼接圖譜序列比對正確，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功.

a.PCR擴增產(chǎn)物：M.Marker；1.hLeptin基因及載體；2.SUMO標簽片段.b.雙酶切驗證無縫克隆產(chǎn)物：M.Marker；1.無酶切質(zhì)粒；2.酶切后大片段為載體，小片段為插入序列.圖1 重組表達質(zhì)粒pET-30a(+)-SUMO-Lep的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant expression plasmid pET-30a(+)-SUMO-Lep

2.2 瘦素的可溶性表達及純化

對含有重組質(zhì)粒pET-30a(+)-SUMO-Lep的大腸桿菌在不同溫度下誘導(dǎo)表達，結(jié)果如圖2所示，在30 ℃條件下，上清液中帶有SUMO標簽的hLeptin表達量最高.

M.Maker；1.BL21(DE3) 上清液；2.BL21(DE3) 沉淀；3.37 ℃ 上清液；4.37 ℃ 沉淀；5.30 ℃ 上清液；6.30 ℃ 沉淀；7.25 ℃ 上清液；8.25 ℃ 沉淀；9.20 ℃ 上清液；10.20 ℃ 沉淀.圖2 SDS-PAGE 分析不同誘導(dǎo)溫度下 hLeptin 的表達水平Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression levels of hLeptin under different induction temperatures

通過Ni-NTA親和柱純化后結(jié)果如圖3所示，成功對重組hLeptin進行了表達及純化.純化后的帶有SUMO標簽重組hLep的蛋白分子質(zhì)量約為31.5 ku；利用SUMO特異性蛋白酶ULP去除SUMO標簽的重組hLeptin蛋白分子質(zhì)量為16 ku，與預(yù)期分子質(zhì)量一致.

圖3 純化后的重組hLeptinFig.3 Purified recombinant hLeptin

2.3 重組hLeptin的質(zhì)量濃度測定

利用BCA法測得562 nm波長下不同質(zhì)量濃度標準蛋白溶液吸光度，根據(jù)表2得到標準曲線方程:y=0.475 8x+0.083 9，R2=0.991 9，線性關(guān)系良好(圖4)，稀釋10倍后重組hLeptin樣品的A562=0.289，將其代入標準曲線方程得到原h(huán)Leptin質(zhì)量濃度為4.31 mg/mL.

表2 不同質(zhì)量濃度的標準品的吸光度值Tab.2 Absorbance values of the standard protein with different mass concentrations

圖4 標準曲線方程Fig.4 Standard curve equation

2.4 重組hLeptin的生物活性鑒定

小鼠腹腔注射hLeptin后第2天開始體質(zhì)量增長量低于對照組，hLeptin組小鼠的進食量受到抑制，整個實驗期內(nèi)hLeptin組小鼠的體質(zhì)量增長量和進食量均小于對照組(圖5～6)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，由此可見重組表達的hLeptin具有良好的生物學活性.

*P<0.05，hLeptin vs PBS圖5 KM小鼠注射hLeptin后體質(zhì)量的變化Fig.5 Changes of body mass after hLeptin injected of KM mouse

圖6 KM小鼠注射hLeptin后攝食量的變化Fig.6 Changes of food intake after hLeptin injected of KM mouse

分別用0、50、100、200、400 ng/mL的hLeptin處理人肝癌HepG2細胞，12、24 h后用CCK8法檢測細胞活力，與對照組(0 ng/mL)相比，hLeptin處理后的人肝癌HepG2細胞增殖水平均隨著hLeptin質(zhì)量濃度的增加而明顯增加(圖7)，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明瘦素可以誘導(dǎo)HepG2細胞增殖，證明重組表達的hLeptin具有良好的生物學活性.

與對照組(0 ng/mL)相比*P<0.05.圖7 不同質(zhì)量濃度瘦素作用HepG2細胞不同時間對細胞增殖的影響Fig.7 Effects of different mass concentrations of hLeptin on cell proliferation of HepG2 at different time

3 討論

DNA重組技術(shù)使體外表達目的蛋白成為可能[11].真核表達蛋白系統(tǒng)盡管具有幫助重組真核蛋白翻譯后準確折疊和修飾的酶系統(tǒng)，能獲得生物活性蛋白，但細胞培養(yǎng)周期長、蛋白得率低、操作要求高等缺點使其不能滿足對生物活性蛋白的大量需求.以大腸桿菌為代表的原核表達系統(tǒng)具有遺傳背景清晰、生長快速、表達量高、易于操作等優(yōu)點，在科研、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用.但真核蛋白在原核宿主細胞中的表達常會遇到外源蛋白錯誤折疊以無生物活性不可溶的包涵體形式存在的問題[12].如何通過提高外源蛋白表達的可溶性，獲得具有生物活性的目的蛋白已成為原核表達系統(tǒng)廣泛應(yīng)用的最大瓶頸[13].

近年來SUMO常作為融合標簽促進外源重組蛋白的表達，主要基于SUMO/SUMO特異性蛋白酶相互作用的機理[14].SUMO被發(fā)現(xiàn)可用作分子伴侶不僅能夠提高蛋白在大腸桿菌的表達量，而且能夠大大增加蛋白的可溶性，其作用機制可能是SUMO蛋白作為一個高度疏水的核心，為目的蛋白的折疊提供成核位點，促進蛋白間的相互作用并使其正確折疊，最終增強了融合蛋白的可溶性[15].此外，利用SUMO標簽表達融合蛋白的另一個優(yōu)點是利用SUMO特異性蛋白酶具有高度特異性，可以識別完整的SUMO 標簽蛋白，并能高效地把SUMO從融合蛋白上切割下來，而且經(jīng)過切割的目標蛋白不會攜帶多余的氨基酸殘基，以產(chǎn)生具有所需N末端的天然蛋白[16].

人類與小鼠的Leptin同源性高達84%[17].在人類和嚙齒動物中，血漿Leptin的水平反映了脂肪組織庫的充盈狀態(tài)，與體脂總量呈正相關(guān)[18].Leptin通過與包括中樞和外周的多個位點的瘦素受體特異性結(jié)合后，繼而激活下游一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮其生理作用，因此Leptin具有廣泛的生物學效應(yīng)[19].大部分肥胖患者體內(nèi)Leptin水平異常增高，表現(xiàn)為高瘦素血癥及瘦素抵抗[20].Leptin參與了肥胖相關(guān)的肝癌的發(fā)生發(fā)展，多項研究指出[21-23]，Leptin通過與人肝癌HepG2細胞上的瘦素受體結(jié)合促進肝癌細胞DNA合成和增強有絲分裂活性，從而誘導(dǎo)肝癌細胞增殖.而在臨床中，由于Leptin基因突變而導(dǎo)致的先天性Leptin完全缺乏患者，在生命早期就會發(fā)展為極端肥胖，同時伴有明顯的神經(jīng)內(nèi)分泌異常，通過補充重組hLeptin蛋白可改善患者病態(tài)肥胖及代謝異常[24].LEE的研究表明[25]，重組hLeptin替代治療可以改善高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)所致的脂肪萎縮和代謝綜合征患者的胰島素抵抗和高脂血癥.本研究成功建立了pET-30a(+)-SUMO原核表達系統(tǒng)，成功獲得可溶性表達高活性的重組hLeptin.在對重組hLeptin進行生物學活性鑒定時，給予KM小鼠外源重組hLeptin后顯著抑制了小鼠的體質(zhì)量及進食量的增長；同時，觀察到不同濃度重組hLeptin誘導(dǎo)人肝癌HepG2細胞增殖，與對照組相比差異顯著.這些結(jié)果表明，本研究獲得的重組hLeptin在體內(nèi)和體外實驗中均具有良好的生物學活性.

綜上所述，本文利用SUMO融合標簽對原核表達系統(tǒng)中促蛋白可溶性表達進行了研究，并對得到的重組hLeptin進行體內(nèi)動物實驗和體外細胞實驗檢測其生物學活性.成功表達了可溶且具有生物活性的hLeptin，為大規(guī)模生產(chǎn)hLeptin提供了一種新方法，這對于深入研究其在基礎(chǔ)醫(yī)學及臨床醫(yī)學中的作用具有重要意義，同時為廣泛應(yīng)用于表達可溶重組蛋白研究提供了一定的思路.