月桂酸鈉誘導(dǎo)建立三種冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙大鼠模型的比較

朱瑾嫻 范雅雯 龔勝蘭 莊園妃 劉春貴 唐新征

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第六臨床醫(yī)學(xué)院 廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院（福田）心血管病科，廣東深圳 518034

冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙（coronary microvascular dysfunction，CMVD）是指多種病理因素導(dǎo)致的血管內(nèi)徑小于0.5 mm 的微血管結(jié)構(gòu)和/或功能異常，臨床多表現(xiàn)為存在勞力性心絞痛癥狀或存在心肌缺血客觀證據(jù)[1-2]。研究表明，CMVD 與未來(lái)主要不良心臟事件有關(guān)，同時(shí)也被認(rèn)為是射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭發(fā)生的相關(guān)因素，并與死亡風(fēng)險(xiǎn)增加及心臟術(shù)后器官功能障礙相關(guān)[3-6]。

近年來(lái)，CMVD 的臨床檢出率逐漸升高，對(duì)于CMVD 的研究也愈漸深入。目前對(duì)于CMVD 大鼠模型的建立方法主要是開(kāi)胸注射法、經(jīng)頸動(dòng)脈導(dǎo)管介入法[7-8]，后者存在操作復(fù)雜且介入導(dǎo)管成本較高的缺點(diǎn)，故前者更為常見(jiàn)。月桂酸鈉作為開(kāi)胸注射法最常用的化學(xué)誘導(dǎo)藥物，其誘導(dǎo)建立的大鼠CMVD 模型廣泛應(yīng)用于CMVD 發(fā)病機(jī)制及藥物治療的研究中，但目前對(duì)于月桂酸鈉致大鼠CMVD 模型的給藥劑量及給藥方式尚未有定論。故本研究通過(guò)3 種不同給藥方案造模的比較，優(yōu)選出合理的月桂酸鈉造模給藥方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF 級(jí)SD 雄性大鼠50 只，6～8 周齡，體重（200±20）g，購(gòu)自珠海百試通動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2020-0051，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2020-0230。飼養(yǎng)及手術(shù)操作于深圳拓普生物科技有限公司SPF 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行；飼養(yǎng)條件：每籠2～3 只，自由飲食，通風(fēng)、照明良好，室溫22～24℃，相對(duì)濕度67%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用符合3R 原則。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)室倫理委員會(huì)審批（TOP-IACUC-2021-0104）。

1.2 藥物與試劑

2%異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號(hào)：R510-22-16）；月桂酸鈉（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)：L9755）；HE 染色試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司，批號(hào)：G1006）；Heidenhain 染色液（Solarbio，批號(hào)：G4480）；GENMED 石蠟切片纖維蛋白（fibrin）卡斯塔萊斯（carstairs）染色試劑盒（美國(guó)GENMED 公司，批號(hào)：GMS80128.1）。

1.3 儀器及器械

外科手術(shù)器械；小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)（美國(guó)Matrx公司，7025）；U-40 胰島素注射器（上海康德萊企業(yè)發(fā)展集團(tuán)股份有限公司）；HS-B7126-B 型石蠟包埋機(jī)（沈陽(yáng)恒松科技有限公司）；ART-300 型自動(dòng)脫水機(jī)（湖北安立信醫(yī)療實(shí)業(yè)有限公司）；QPJ-1C 生物病理切片機(jī)（天津愛(ài)華醫(yī)療器械有限公司）；BX-53F 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；vevo2100 型彩色多普勒超聲儀（美國(guó)Visualsonics 公司）。

1.4 研究方法

1.4.1 模型的建立與分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，使用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白組、假手術(shù)組和模型組1～3，每組10 只?？瞻捉M：未行任何干預(yù)；模型組采取經(jīng)心尖部注入月桂酸鈉的方法建立CMVD 模型[9]，根據(jù)造模方法不同分為三組，即模型組1 采用擴(kuò)張肋間后擠出心臟+心尖注入月桂酸鈉（1 mg/kg）1 次、模型組2 采用擴(kuò)張肋間后擠出心臟+心尖注入月桂酸鈉（1 mg/kg）2 次、模型組3 采用擴(kuò)張肋間后擠出心臟+夾閉主動(dòng)脈根部+心尖注入月桂酸鈉（1 mg/kg）1 次，見(jiàn)圖1。假手術(shù)組操作同模型組2，注入等量生理鹽水。術(shù)后連續(xù)72 h 肌肉注射4 萬(wàn)單位青霉素預(yù)防感染。

圖1 大鼠CMVD 模型建立

1.4.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 術(shù)后72 h 將各組大鼠以異氟烷吸入麻醉后仰臥位固定，取胸骨短軸觀切面，M 型超聲模式下連續(xù)計(jì)算3 個(gè)心動(dòng)周期的左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）的平均值。

1.4.3 形態(tài)學(xué)及病理學(xué)分析 術(shù)后72 h 完成超聲心動(dòng)圖后禁食12 h，各組大鼠生理鹽水灌注后取出心臟，固定包埋，切片進(jìn)行HE、Heidenhain 及Carstairs 染色觀察心肌組織變化，以見(jiàn)到心肌缺血、微血管內(nèi)血栓形成且大血管未見(jiàn)損傷為模型成功。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活情況

空白組大鼠存活率為100%（10/10）；手術(shù)大鼠死亡率為17.5%（7/40），死亡原因?yàn)槠餍嫡`觸破血管（1 只）、進(jìn)針過(guò)深穿破心臟（1 只）、操作時(shí)間過(guò)久（4 只）、麻醉過(guò)量（1 只）。

2.2 各組大鼠LVEF 比較

假手術(shù)組與空白組LVEF 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組1～3 LVEF 均降低（P＜0.05）；與模型組2 比較，模型組1、3 LVEF升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖2。

表1 各組大鼠LVEF 比較（%，）

表1 各組大鼠LVEF 比較（%，）

注 與假手術(shù)組比較，bP＜0.05；與模型組2 比較，cP＜0.05。LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)

圖2 各組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)

2.3 心肌組織病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 HE 染色 空白組及假手術(shù)組大鼠心肌排列整齊，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，冠狀動(dòng)脈微血管內(nèi)未見(jiàn)明顯血栓形成。模型組1～3 均可見(jiàn)不同程度冠狀動(dòng)脈微血管內(nèi)血栓形成，周邊可見(jiàn)不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維排列紊亂，組織水腫，大血管無(wú)明顯血栓形成。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠心肌病理變化（HE 染色，400×）

2.3.2 Heidenhain 染色 空白組及假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)完整，心肌纖維組織呈紅色，細(xì)胞核呈黑色；模型組1～3 均可見(jiàn)不同程度的點(diǎn)狀、片狀及團(tuán)塊狀心肌纖維黑染缺血灶。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠心肌缺血情況（Heidenhain 染色，400×）

2.3.3 Carstairs 染色 空白組及假手術(shù)組大鼠微血管及心肌較大動(dòng)脈血管內(nèi)無(wú)明顯血栓形成；模型組1～3 均可見(jiàn)微血管中存在血小板與纖維蛋白重疊的紫色血栓形成。見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠微血管內(nèi)血栓情況（Carstairs 染色，400×）

3 討論

CMVD 存在于多種心臟或全身疾病中，如心肌病、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫病、高血壓等，是遠(yuǎn)期心血管事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，因其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前對(duì)其研究尚不確切[10-11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有助于理解CMVD的病理生理學(xué)機(jī)制并探索更好的治療方法，故建立一種可靠、可復(fù)制性強(qiáng)且經(jīng)濟(jì)快速的動(dòng)物模型很有必要。

現(xiàn)階段CMVD 大鼠動(dòng)物模型的建立方法[12-14]中導(dǎo)管介入法對(duì)操作者及建模工具要求較高，且導(dǎo)管費(fèi)用昂貴，不易掌握，故開(kāi)胸注射法仍是目前主流的造模方法。傳統(tǒng)開(kāi)胸注射法均采取經(jīng)心尖部或主動(dòng)脈根部注射，技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，但手術(shù)過(guò)程中的創(chuàng)傷程度大，造模流程需要約1 h，且開(kāi)胸需要?dú)夤懿骞芡?，腹腔麻醉所用水合氯醛易?dǎo)致大鼠室性心律失常，戊巴比妥鈉可導(dǎo)致大鼠呼吸抑制[15]，術(shù)中及術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)較高。為提高生存率，本研究手術(shù)操作在傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，改為采取異氟烷氣體誘導(dǎo)麻醉。

開(kāi)胸注射法通?？蛇x擇注入塑料微球、自體微血栓、月桂酸鈉[16-17]。在微循環(huán)障礙的病理過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的異常具有重要地位[18-19]，而月桂酸鈉有強(qiáng)烈的內(nèi)皮損傷作用，可造成血管內(nèi)皮脫落、穿孔，形成血栓[9]。塑料微球通過(guò)物理方式導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈微血管栓塞，自體血栓通過(guò)模擬冠狀動(dòng)脈內(nèi)斑塊破裂導(dǎo)致微血栓形成，這二者雖均可誘發(fā)心肌缺血及炎癥反應(yīng)，但無(wú)法模擬內(nèi)皮功能受損過(guò)程，故月桂酸鈉造成的化學(xué)損傷更符合CMVD 的發(fā)病機(jī)制[20-21]，更貼近臨床。

研究證實(shí)，微血栓的形成與月桂酸鈉的劑量有關(guān)[22]，目前實(shí)驗(yàn)常用劑量為1 mg/kg 或2 mg/kg[23-25]?？紤]存在藥物劑量不足及未夾閉主動(dòng)脈導(dǎo)致藥物未完全進(jìn)入冠狀動(dòng)脈致血管內(nèi)皮損傷較輕的可能性，故同時(shí)設(shè)置模型組2（二次損傷）和模型組3（夾閉主動(dòng)脈根部）。本研究結(jié)果顯示，模型組1～3 均不會(huì)導(dǎo)致大血管病變，且模型組1 和模型組3 微血管堵塞程度及心功能受損程度均較模型組2 輕。此外，假手術(shù)組與空白組間心功能及心肌組織比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故擠出心臟所致?lián)p傷并不會(huì)導(dǎo)致心功能下降及微血栓形成。

需要注意的是，模型組2 的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)于操作者有如下要求：①需提高熟練度，以便在短時(shí)間內(nèi)完成操作；②術(shù)中需密切關(guān)注大鼠狀況，避免大鼠因長(zhǎng)時(shí)間通氣功能障礙而死亡；③術(shù)中需根據(jù)大鼠情況及時(shí)調(diào)整麻醉藥物濃度，避免大鼠因在操作途中蘇醒掙扎或因心律失常、呼吸抑制而死亡；④術(shù)中心尖部注射藥物要求勻速、輕柔及緩慢，避免藥物作用時(shí)間過(guò)短，同時(shí)嚴(yán)格控制穿刺力度及深度。

本研究中3 種造模方法平均需要約10 min，較常規(guī)方法快捷，且均可成功導(dǎo)致微循環(huán)障礙，其中模型組2 微血管損傷及心功能受損最明顯，且造模時(shí)間短，死亡率低，成模穩(wěn)定，與常規(guī)方法結(jié)果基本一致，是較優(yōu)的一種造模方案，可廣泛應(yīng)用于CMVD 方面的研究，極大地提高實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。研究者可根據(jù)所需微循環(huán)功能障礙的嚴(yán)重程度酌情調(diào)整給藥量。

本研究不足之處在于樣本量偏小，僅探索了加倍劑量的造模方案，且未嘗試更高濃度月桂酸鈉配比對(duì)微血管及冠狀動(dòng)脈的損傷程度，因而未明確當(dāng)劑量增加至何種水平時(shí)會(huì)導(dǎo)致大鼠的死亡率升高或損傷到大血管，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索。另外，月桂酸鈉可能會(huì)導(dǎo)致全身微循環(huán)障礙，本研究未進(jìn)行相關(guān)評(píng)估，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意觀察。