超聲輔助法提取辣椒多糖的工藝優(yōu)化及其 抗氧化活性研究

辣椒（Capsicum annuumL.）屬于茄科辣椒屬植物，為一年生或多年生草本植物[1]。辣椒中含有如多糖、色素、辣椒堿和蛋白質(zhì)等多種有效成分[2-3]，且具有一定的保健功能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，深受人們的喜愛[4]。

在辣椒的加工生產(chǎn)過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量的辣椒渣、辣椒桿等副產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，辣椒渣中的多糖較為豐富[5]。植物多糖具有抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、抗衰老[8]和免疫調(diào)節(jié)[9]等多種生物活性，甚至對(duì)艾滋病毒有一定的防御能力[10]，且具有毒副作用小和不易造成殘留等優(yōu)點(diǎn)[11]。國(guó)內(nèi)外對(duì)辣椒渣中研究較多的為蛋白和膳食纖維，對(duì)多糖研究較少。而植物多糖的提取、功能性及應(yīng)用是目前研究的重點(diǎn)[12]。本文以寧夏吳忠市農(nóng)作物——辣椒為原料，采用超聲輔助法提取辣椒多糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化辣椒多糖提取條件，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行體外抗氧化活性評(píng)價(jià)，為辣椒渣進(jìn)一步的綜合利用打下了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒粉，無(wú)籽辣椒渣產(chǎn)自寧夏寧楊食品有限公司。

無(wú)水乙醇、抗壞血酸、Tris-HCl緩沖溶液、鹽酸、PBS緩沖液、過(guò)氧化氫、DPPH、ABTS、鄰二氮菲、過(guò)硫酸鉀、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、磷酸鈉、三氯醋酸、FeSO4以及FeCl3等，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ME203E型電子天平，美國(guó)梅特勒公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；V-5100型紫外-可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 辣椒多糖的提取

準(zhǔn)確稱取50.0 g辣椒粉末，加入400 mL 95%乙醇，80 ℃下回流提取3 h，提取2次，抽濾，收集濾渣干燥即為脫除辣椒素樣品。取脫除辣椒素樣品30.0 g，加入360 mL蒸餾水，超聲波處理后，離心（4 500 r·min-1，20 min）除去濾渣和不溶物，合并濾液。將上述濾液減壓并濃縮至掛壁狀態(tài)，室溫條件下，攪拌并加入80%的乙醇，于4 ℃條件下放置過(guò)夜，離心（4 500 r·min-1，10 min），得到沉淀物。將上述沉淀物真空干燥（真空度0.09，溫度35 ℃，時(shí)間2 h），粉碎后即可得到辣椒多糖提取物。

1.3.2 辣椒多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定辣椒多糖的含量[13]。

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖0.100 0 g，定容于100 mL容量瓶中，配制成葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液分置于試管中，加蒸餾水至2.0 mL，再加5%的苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置10 min后，沸水浴中加熱30 min后冷卻至室溫，于490 nm處測(cè)定吸光度。用2.0 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=16.031x+0.066 9（R2=0.993 8）。

（2）樣液的測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出待測(cè)液中葡萄糖的含量，做3次平行。辣椒多糖含量的計(jì)算公式：

式中：ω為辣椒多糖含量，mg·g-1；ρ為吸取的待測(cè)液中葡萄糖的濃度，mg·mL-1；f為葡萄糖換算多糖的換算因子，f=3.19；m為試樣質(zhì)量，mg。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以辣椒多糖含量為指標(biāo)，分別考察料液比（1∶8、1∶10、1∶12、1∶14和1∶16）（g∶mL）、超聲功率（125 W、150 W、175 W、200 W和225 W）、超聲溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃）以及超聲時(shí)間（20 min、30 min、40 min、50 min和60 min）對(duì)辣椒多糖含量的影響。

試驗(yàn)過(guò)程中，各因素控制量分別為超聲功率為175 W、超聲溫度為50 ℃、超聲時(shí)間為30 min、料液比為1∶12（g∶mL）。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在確定單因素試驗(yàn)的較佳條件（超聲功率150 W、超聲溫度70℃、超聲時(shí)間40 min）的基礎(chǔ)上進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以辣椒多糖含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間3因素3水平的響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化，見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表

1.3.5 辣椒多糖體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

（1）超氧陰離子的清除活性的測(cè)定。采用YANG 等[14]的方法，取 0.05 mol·L-1，pH 8.2的 Tris-HCl緩沖溶液5 mL置于試管中，水浴中（25 ℃）預(yù)熱20 min后，加入樣品溶液1 mL，加入預(yù)熱的3 mmol·L-1的鄰苯三酚溶液0.5 mL，搖勻，于水浴中反應(yīng)5 min，再加入8 mmol·L-1的鹽酸1 mL，終止反應(yīng)，在299 nm處測(cè)定溶液的吸光度。按式（2）計(jì)算樣品對(duì)超氧陰離子的清除率。

式中：Ai為樣品溶液的吸光度值；Aj為Tris-HCl緩沖液和鄰苯三酚的吸光度值；A0為Tris-HCl緩沖液的吸光度值。

（2）羥自由基清除活性的測(cè)定。采用范艷麗等[15]的試驗(yàn)方法，根據(jù)式（3）計(jì)算樣品對(duì)羥自由基的清除率。

式中：A0為空白對(duì)照品的吸光度；Ai為樣品溶液的吸光度。

（3）DPPH自由基清除活性的測(cè)定。按梁萬(wàn)年等[16]的試驗(yàn)方法并做修改，取0.2 mmol DPPH溶液2 mL于試管中，加入2 mL樣品溶液，搖勻，避光靜置30 min。將2 mL DPPH溶液和2 mL乙醇混合作為空白對(duì)照。在517 nm處測(cè)定各反應(yīng)混合物的吸光度。根據(jù)式（4）計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力。

式中：Ai為DPPH和樣品溶液的吸光度；Aj為乙醇和樣品溶液的吸光度；A0為DPPH和乙醇的吸光度。

（4）ABTS自由基清除活性的測(cè)定。按方甜等[17]的試驗(yàn)方法并做修改。將配制好的7 mmol·L-1的ABTS溶液與2.45 mmol·L-1的過(guò)硫酸鉀溶液等體積濃度混合，避光放置12～16 h，得到ABTS+溶液。用蒸餾水稀釋，使其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光值在（0.7±0.02），取ABTS+溶液3.9 mL，加入樣品溶液0.1 mL，搖勻，室溫放置6 min，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以維生素C作陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)式（5）計(jì)算樣品對(duì)ABTS+的清除能力。

式中：A0為空白對(duì)照品的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度。

（5）總還原能力測(cè)定。按李進(jìn)等[18]的試驗(yàn)方法并做修改，取1 mL樣品溶液于試管中，依次加入2.5 mL 的 0.2 mol·L-1磷 酸 鈉 緩 沖 液（pH 6.6） 和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，置于50 ℃水浴中，恒溫20 min后，再加入10%的三氯醋酸溶液2.5 mL，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL和0.1%的FeCl3溶液1 mL，搖勻，靜置10 min，在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定其吸光度，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)辣椒多糖含量的影響

不同料液比對(duì)辣椒多糖含量的影響如圖1所示。隨著提取液的不斷增加，辣椒多糖的含量先增加后減少。在料液比為1∶12時(shí)，辣椒多糖含量達(dá)到最大，隨著提取液的繼續(xù)增加，辣椒多糖含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選定料液比為1∶12（g∶mL）。

圖1 料液比對(duì)辣椒多糖含量的影響圖

2.1.2 超聲功率對(duì)辣椒多糖含量的影響

超聲功率對(duì)辣椒多糖含量的影響如圖2所示。當(dāng)超聲功率為150 W時(shí)，辣椒多糖含量最大，之后隨著超聲功率增大而下降。這可能是因?yàn)槌暪β实脑龃?，破壞了辣椒多糖的結(jié)構(gòu)。因此，選定超聲功率為150 W。

圖2 超聲功率對(duì)辣椒多糖含量的影響圖

2.1.3 超聲溫度對(duì)辣椒多糖含量的影響

超聲溫度對(duì)辣椒多糖含量的影響如圖3所示。當(dāng)超聲溫度為70 ℃時(shí)，辣椒多糖的含量最大，之后隨著超聲溫度的升高，辣椒多糖的含量下降。原因可能是超聲溫度的不斷升高，辣椒多糖容易溶出，但超聲溫度過(guò)高，部分辣椒多糖會(huì)分解，導(dǎo)致辣椒多糖的含量降低。因此，選定超聲溫度為70 ℃。

圖3 超聲溫度對(duì)辣椒多糖含量的影響圖

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)辣椒多糖含量的影響

超聲時(shí)間對(duì)辣椒多糖含量的影響如圖4所示。隨著超聲時(shí)間的不斷增加，辣椒多糖的含量也不斷增大，超聲時(shí)間為40 min時(shí)達(dá)到最大值，之后辣椒多糖的含量逐漸降低。因此，選定超聲時(shí)間為40 min。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)辣椒多糖含量的影響圖

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

基于單因素試驗(yàn)，以超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間為指標(biāo)，采用Design Expertv8.0.6 Trial軟件進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)。整個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)在中心點(diǎn)處共有17次試驗(yàn)，試驗(yàn)隨機(jī)完成，結(jié)果見表2。

分別對(duì)A、B、C各因素和響應(yīng)值Y進(jìn)行回歸擬合，得到多糖含量（Y）一次多元回歸方程為Y=84.85+22.01×A-1.28×B+1.03×C+0.45×A×B-0.55×A×C+0.30×B×C-2.51×A2-3.21×B2-3.28×C2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

該模型的方差分析結(jié)果見表3。回歸模型P=0.012 8，表明該模型差異顯著。失擬項(xiàng)P=0.676 5＞0.05，說(shuō)明該模型擬合程度良好[19]。Design-Expert 8.0軟件處理得響應(yīng)面分析結(jié)果見圖5～圖7。

由圖5～圖7可知，3個(gè)響應(yīng)因素在相對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)辣椒多糖含量有顯著的影響。通過(guò)對(duì)各響應(yīng)因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線圖分析，使用Design-Expert軟件對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化，獲得的最優(yōu)條件為超聲功率158.03 W，超聲溫度68.48 ℃，超聲時(shí)間41.10 min，此時(shí)辣椒多糖含量為42.35 mg·g-1。

2.3 最佳工藝條件試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化的提取工藝條件，基于試驗(yàn)的實(shí)際可操作性，對(duì)其進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，考察工藝模型的穩(wěn)定可靠性。根據(jù)修正后的模型優(yōu)化的最佳提取條件（超聲功率158.03 W，超聲溫度68.48 ℃，超聲時(shí)間41.10 min）進(jìn)行辣椒多糖的驗(yàn)證試驗(yàn)，由于試驗(yàn)條件限制，本次試驗(yàn)設(shè)定提取條件為超聲功率150 W、溫度68 ℃，超聲時(shí)間41 min，重復(fù)測(cè)定3次，測(cè)得多糖的含量為（40.91±0.13）mg·g-1，與預(yù)測(cè)值（42.35 mg·g-1）誤差較小。因此，此模型及相關(guān)參數(shù)準(zhǔn)確可靠，能夠預(yù)測(cè)試驗(yàn)的最佳工藝條件，可用于辣椒多糖的提取條件研究中。

表3 方差分析表

圖5 超聲功率和超聲溫度對(duì)辣椒多糖含量影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖6 超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)辣椒多糖含量影響的響應(yīng)面及等高線圖

2.4 辣椒多糖的體外抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 辣椒多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

由圖8可知，當(dāng)樣品濃度在0.1～0.4 mg·mL-1時(shí)，維生素C和辣椒多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除率不斷增加；當(dāng)樣品濃度在0.5 mg·mL-1時(shí)，維生素C的清除率能夠達(dá)到99.25%，辣椒多糖的清除率達(dá)到74.84%。結(jié)果表明，辣椒多糖對(duì)超氧陰離子自由基有一定的清除能力，但維生素C比辣椒多糖的清除能力更強(qiáng)。

圖8 辣椒多糖提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力圖

2.4.2 辣椒多糖對(duì)羥基自由基清除活性的測(cè)定

由圖9可知，當(dāng)濃度為0.08 mg·mL-1時(shí)，維生素C對(duì)羥自由基的清除率為93.1%；辣椒多糖對(duì)羥自由基的清除率為76.6%。辣椒多糖對(duì)羥基自由基有一定的清除能力，但弱于維生素C。

圖9 辣椒多糖提取物對(duì)羥自由基清除活性的測(cè)定圖

2.4.3 辣椒多糖對(duì)DPPH+清除活性的能力

由圖10可知，當(dāng)樣品的濃度為0.1 mg·mL-1時(shí)，辣椒多糖對(duì)DPPH+清除率為49%，濃度為0.4 mg·mL-1時(shí)，維生素C對(duì)DPPH+清除率達(dá)到100%。當(dāng)濃度超過(guò)0.2 mg·mL-1時(shí)，辣椒多糖提取物對(duì)DPPH+清除率大幅度提升，濃度為0.4 mg·mL-1時(shí)其對(duì)DPPH+的清除率為70%左右。表明辣椒多糖提取物對(duì)DPPH+具有一定的清除能力，且與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

2.4.4 辣椒多糖對(duì)ABTS+自由基清除活性的能力

由圖11可知，當(dāng)樣品濃度在0.2～0.5 mg·mL-1時(shí)，維生素C和辣椒多糖對(duì)ABTS+自由基的清除率呈上升趨勢(shì)。濃度為0.1 mg·mL-1時(shí)，辣椒多糖對(duì)ABTS+的清除率只有12%左右，其清除率隨樣品濃度的增大而增大。在濃度達(dá)到0.5 mg·mL-1時(shí)，辣椒多糖對(duì)ABTS+的清除率達(dá)到最大，為18%左右。結(jié)果表明辣椒多糖對(duì)ABTS+的清除能力較維生素C弱。

圖10 辣椒多糖提取物對(duì)DPPH+清除活性的能力圖

圖11 辣椒多糖提取物對(duì)ABTS+清除活性的能力圖

2.4.5 辣椒多糖的還原能力

樣品的還原能力能夠反映一定的抗氧化性，抗氧化劑可將Fe3+絡(luò)合物還原成綠色或藍(lán)色的Fe2+絡(luò)合物。試驗(yàn)通過(guò)顯色反應(yīng)可以測(cè)定出Fe3+被還原成Fe2+程度的高低，從而可以判斷出辣椒多糖還原能力的強(qiáng)弱。

由圖12可知，隨樣品濃度的增大，維生素C的還原能力升高，辣椒多糖升高趨勢(shì)較為緩慢。當(dāng)濃度為1.4 mg·mL-1時(shí)，維生素C的清除率達(dá)到99.8%，而辣椒多糖的清除率最大為25%左右，說(shuō)明辣椒多糖的還原能力弱于維生素C。

圖12 辣椒多糖提取物的還原能力圖

3 結(jié)論

本文采用超聲輔助法提取辣椒多糖，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)得到辣椒多糖的最佳提取工藝為超聲功率150 W、溫度68 ℃，超聲時(shí)間41 min，在最佳工藝條件下，辣椒多糖含量為（40.91±0.13）mg·g-1，與預(yù)測(cè)值（42.35 mg·g-1）誤差較小。辣椒多糖具有較好的抗氧化活性，其對(duì)超氧陰離子、羥基自由基和DPPH+具有較好的清除作用，但清除ABTS+能力和還原能力較弱。本文可為辣椒多糖提取工藝的工業(yè)化應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持，同時(shí)為辣椒渣的利用提供借鑒思路。