P300/CBP相關(guān)因子和P53在宮頸癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性

李 蕾 張俊濤 曹淑萍

1.山東省東營市東營區(qū)人民醫(yī)院病理科，山東東營 257000；2.山東省東營市東營區(qū)人民醫(yī)院婦科，山東東營 257000

宮頸癌作為女性第四大常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重影響女性健康。在我國每年宮頸癌新發(fā)病例13.15 萬，宮頸癌已成為我國中青年女性的第二大高發(fā)惡性腫瘤，發(fā)病人群趨于年輕化，每年大約有5 萬人死于該病。P300/CBP 相關(guān)因子（P300/CBP-related factor，PCAF）是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶GNAT 家族中的重要一員，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移和腫瘤中血管的生成發(fā)揮重要作用。P53 被認(rèn)為是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤的發(fā)生相關(guān)性最高的抑癌基因。本研究通過檢測(cè)宮頸癌組織內(nèi)PCAF 和P53 的表達(dá)水平，探討PCAF、P53 與宮頸癌病例特點(diǎn)之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月至2020年6月東營市東營區(qū)人民醫(yī)院病理科保存并經(jīng)病理證實(shí)的宮頸癌組織79例（鱗狀細(xì)胞癌57 例，腺癌22 例）作為實(shí)驗(yàn)組，選取同期20 例正常宮頸組織作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組患者年齡38～70 歲，平均（46.2±5.23）歲；≥50 歲37例，<50歲42 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期54 例，Ⅲ～Ⅳ期25例；病理分級(jí)：G1～G2 期45 例，G3 期34 例。對(duì)照組年齡35～69 歲，平均（45.4±6.72）歲，兩組的年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（2020-008），患者及家屬均知情并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者臨床資料完整；②均為首發(fā)病例；③所有患者術(shù)前均無化療、放療以及免疫治療史。

1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)方法

PCAF 單克隆抗體購自美國Santa Cruz 生物公司，批號(hào)：sc-13124。P53 單克隆抗體購自邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào)：MX008。采用免疫組化SP 法染色：組織石蠟塊5 μm 切片，二甲苯進(jìn)行常規(guī)脫蠟，然后依次放入濃度由低到高的乙醇中脫水，蒸餾水沖洗3 次，每次3 min，待充分水化后，用PBS 洗3 次，每次5 min，加入3%過氧化氫滅活內(nèi)源性的過氧化物酶10 min，再用PBS 洗3 次，每次5 min，20%山羊血清室溫下封閉30 min，滴加一抗，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃下1～2 h 或4℃過夜，PBS 洗3 次，每次5 min，然后加入二抗，37℃孵育30 min，PBS 洗3 次，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果判定

陽性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒，PCAF 定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，P53 定位在細(xì)胞核。根據(jù)細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核染色強(qiáng)度以及著色陽性細(xì)胞所占百分率進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)計(jì)分，隨機(jī)選擇每張切片中10 個(gè)高倍鏡視野（400×），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，切片的著色陽性細(xì)胞百分率為所有視野中陽性細(xì)胞的平均百分率。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（A）：0 分為無色，1 分為黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色。著色陽性細(xì)胞所占百分率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（B），陽性細(xì)胞<5%為0 分，陽性細(xì)胞5%～25%為1 分，陽性細(xì)胞26%～50%為2 分，陽性細(xì)胞51%～75%為3 分，陽性細(xì)胞>75%為4 分。最終以A+B 所得分?jǐn)?shù)作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：≤2 分為陰性，≥3 分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，兩組間比較采用χ檢驗(yàn)；采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織中P53 蛋白和PCAF 的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性

實(shí)驗(yàn)組的PCAF 陽性表達(dá)率為41.8%，低于對(duì)照組的80.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組的PCAF 陽性表達(dá)率隨宮頸癌臨床分期及病理分級(jí)的增高而逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同年齡和組織學(xué)類型患者的PCAF 陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組的P53 陽性表達(dá)率（78.5%）高于對(duì)照組（0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組的P53 陽性表達(dá)率隨宮頸癌臨床分期及病理分級(jí)的增高而逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同年齡和組織學(xué)類型患者的P53 陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

表1 宮頸癌組織中P53 蛋白和PCAF 的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性

2.2 P53 和PCAF 在宮頸癌中表達(dá)的相關(guān)性

P53 和PCAF 在宮頸癌中的表達(dá)呈中度負(fù)相關(guān)（r=-0.493，P<0.05）（表2）。

表2 P53 和PCAF 在宮頸癌中表達(dá)的相關(guān)性（例）

3 討論

PCAF 是真核細(xì)胞內(nèi)一種重要的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，可以乙?；诵慕M蛋白H3 和H4，組蛋白被PCAF 乙?；笈cDNA 結(jié)合能力降低，核小體結(jié)構(gòu)松弛，各種轉(zhuǎn)錄因子更易與DNA 結(jié)合，從而調(diào)控相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平。PCAF 還是一種轉(zhuǎn)錄輔激活子，當(dāng)結(jié)合在啟動(dòng)子或增強(qiáng)子附近位點(diǎn)時(shí)，促進(jìn)下游基因轉(zhuǎn)錄。除此之外，PCAF 還可以使一些非組蛋白發(fā)生乙?；瑥亩鴧⑴cDNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞分化、增殖以及凋亡等細(xì)胞過程。另有研究發(fā)現(xiàn)PCAF 不僅具有乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，也具有E3 連接酶的功能，可以促進(jìn)有關(guān)蛋白泛素化修飾，進(jìn)而參與細(xì)胞代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。

PCAF 被認(rèn)為是一種抑癌候選基因，既往研究發(fā)現(xiàn)其可以在一定程度上抑制多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，PCAF 在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并且與不良預(yù)后緊密相關(guān)。PCAF 在多數(shù)原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)PCAF 的下調(diào)與門靜脈侵犯明顯相關(guān)。PCAF 可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡和自噬、抑制肝癌轉(zhuǎn)移。PCAF 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞有正向調(diào)節(jié)作用，PCAF通過靶向自噬相關(guān)基因ATG5 和ATG7 調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞組蛋白H3S28 磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)瘤細(xì)胞的自噬。有研究發(fā)現(xiàn)，PCAF 的陽性表達(dá)率在食管癌組織中明顯低于正常食管組織。PCAF 的低表達(dá)是胃癌發(fā)生的重要因素，PCAF 低表達(dá)患者的生存期明顯低于PCAF 高表達(dá)患者，與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。關(guān)于CAF 在宮頸癌中的研究較少，本研究通過免疫組化研究宮頸癌與正常宮頸組織中PCAF 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中的PCAF 表達(dá)明顯低于正常宮頸組織，并且隨著宮頸癌臨床分期和組織學(xué)分級(jí)的增高，其表達(dá)率顯著下降，提示PCAF 有可能成為宮頸癌及其預(yù)測(cè)預(yù)后的一種重要的生物學(xué)分子標(biāo)志物。同時(shí)隨著腫瘤個(gè)性化治療的發(fā)展，PCAF 亦被人認(rèn)為是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。PCAF 通過促進(jìn)鋅指轉(zhuǎn)錄因子Gli1 的泛素化來抑制Hh 信號(hào)對(duì)DNA 損傷的應(yīng)答，提示PCAF可能成為Hh 依賴性腫瘤的治療靶點(diǎn)。PCAF 的高表達(dá)可以增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的藥物敏感性。

P53 基因是一種腫瘤抑癌基因，有突變型和野生型之分。野生型P53 是一種重要的抑癌基因，作為一個(gè)“分子警察”在細(xì)胞周期中起著重要的作用，調(diào)控細(xì)胞周期中的增殖細(xì)胞，通過控制G0 或G1 期細(xì)胞進(jìn)入S 期，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。在人類大約一半的腫瘤中，P53 基因發(fā)生突變。突變后的P53 基因失去抑制細(xì)胞增殖的功能，導(dǎo)致腫瘤侵襲力增加，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，成為一種癌基因。野生型的P53 的表達(dá)極不穩(wěn)定，因此無法用免疫組化的方法檢測(cè)出，突變型的P53 容易堆積在細(xì)胞中，半衰期延長，可以用免疫組化檢測(cè)出。既往研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸上皮內(nèi)瘤變時(shí)P53的陽性表達(dá)率隨著瘤變程度的增加而逐漸增高，P53和Ki-67、p63 聯(lián)合檢測(cè)被認(rèn)為是可靠地區(qū)分宮頸上皮內(nèi)瘤變的生物標(biāo)志物。在對(duì)401 例宮頸癌組織進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)中，高P53 蛋白水平與侵襲性表型和生存標(biāo)記顯著相關(guān)，認(rèn)為高P53 水平可獨(dú)立預(yù)測(cè)宮頸癌的低生存率。更有學(xué)者分析證實(shí)P53 的過度表達(dá)提示白種人宮頸癌的預(yù)后不良。本研究結(jié)果顯示，P53的陽性表達(dá)率隨著宮頸癌的臨床分期和組織學(xué)分級(jí)的增高而逐漸增高，進(jìn)一步證實(shí)了P53 可以作為評(píng)定宮頸癌預(yù)后的一種重要生物標(biāo)志物。作為一種重要的抑癌基因，將野生型P53 轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞而用于抑制腫瘤或者增強(qiáng)化療藥物的敏感性一直是人們研究的熱點(diǎn)，外源野生型P53 導(dǎo)入宮頸癌HeLa 細(xì)胞后，可與羥喜樹堿發(fā)揮協(xié)同作用，有效抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖促其凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究結(jié)果還顯示，在宮頸癌中突變的P53 和PCAF 兩種蛋白的表達(dá)緊密相關(guān)，隨著突變型P53 蛋白的增加，PCAF 的表達(dá)逐漸降低。PCAF 是抑癌基因P53 的共激活子，它通過調(diào)節(jié)P53 的活性及其蛋白的穩(wěn)定性來使細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響細(xì)胞分化、凋亡與腫瘤形成。PCAF 蛋白作為一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶可以直接對(duì)P53 進(jìn)行乙?；揎棧ㄟ^PCAF-P53-p21 軸來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖。PCAF蛋白亦可以通過其泛素化酶活性間接作用于P53，去乙?；D(zhuǎn)移酶SIRT7 與PCAF 相互作用后促進(jìn)了PCAF 與MDM2 的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)MDM2 的泛素化降解，使得腫瘤細(xì)胞中的P53 更加穩(wěn)定，有利于腫瘤細(xì)胞的周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。PCAF 還可以通過泛素化修飾調(diào)控Hdm2 進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)P53 蛋白表達(dá)水平。敲除PCAF 的結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞，P53 的乙?；矫黠@降低，P53 依賴性P21 的轉(zhuǎn)錄明顯降低，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期蛋白D1 和磷酸化增加。同時(shí)野生型的P53 可以誘導(dǎo)PCAF 的表達(dá)?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中P53 的高表達(dá)與PCAF表達(dá)的降低密切相關(guān)，提示這兩種蛋白可能在宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同作用。

綜上所述，宮頸癌的發(fā)生是多個(gè)基因共同作用的復(fù)雜過程。本研究顯示PCAF 在宮頸癌中表達(dá)水平低于正常宮頸組織，并且隨著宮頸癌的臨床分期和組織學(xué)分級(jí)的增高而逐漸降低，提示PCAF 可能作為宮頸癌及其預(yù)測(cè)預(yù)后的分子標(biāo)志物。本研究還證實(shí)PCAF蛋白和P53 蛋白在宮頸癌中的表達(dá)緊密相關(guān)，并且與宮頸癌惡性臨床病理特征相關(guān)，提示二者在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著協(xié)同作用，二者聯(lián)合運(yùn)用有望成為宮頸癌潛在預(yù)后不良的分子標(biāo)志物，同時(shí)給宮頸癌的精準(zhǔn)個(gè)性化治療提供新思路和新方法。