基于質(zhì)譜進(jìn)行低豐度靶向蛋白質(zhì)定量的實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)*

朱秀珍，李曉華

（南方科技大學(xué)化學(xué)系，廣東深圳 518055）

0 引 言

測(cè)定蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，尤其是檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的差異變化，可以進(jìn)一步探索蛋白質(zhì)生物功能，認(rèn)識(shí)細(xì)胞的分子機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)疾病和藥物治療的新生物標(biāo)志物，對(duì)疾病早期診斷和精準(zhǔn)靶向治療具有重要意義.

在已有臨床檢驗(yàn)中，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是蛋白質(zhì)定量分析的常規(guī)技術(shù)，也是臨床上生物標(biāo)志物分析的主要方法.然而，由于擁有抗體試劑的候選標(biāo)志物很少，且研發(fā)新抗體耗時(shí)長(zhǎng)，花費(fèi)高，導(dǎo)致ELISA在多重蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的測(cè)定應(yīng)用方面具有一定限制［1］.

蛋白質(zhì)組學(xué)可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模鑒定和評(píng)估蛋白質(zhì)的表達(dá)水平高低.生物質(zhì)譜已成為蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域最有效的研究手段［2-7］.Calvo 等［2］綜述了生物質(zhì)譜在靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用，介紹了如何建立合適的色譜、質(zhì)譜方法，以用于檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)和修飾肽段；Aebersold 和 Mann［4］綜述了基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)取得的成就和面臨的挑戰(zhàn)，介紹了質(zhì)譜在研究蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控的應(yīng)用.蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要為發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)和定向蛋白質(zhì)組學(xué).發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)以鳥槍法為例，質(zhì)譜選取豐度最高的一批母離子進(jìn)行碎裂.由于生物樣品的蛋白質(zhì)含量可以相差幾個(gè)數(shù)量級(jí)，樣品的復(fù)雜性使得發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)難以測(cè)定低豐度蛋白.而在定向蛋白質(zhì)組學(xué)中，質(zhì)譜選取特定的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，其他干擾信號(hào)均被排除，能夠?qū)崿F(xiàn)低豐度蛋白的高靈敏度測(cè)定［8］.近年來(lái)，定向蛋白質(zhì)組學(xué)中基于多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）的蛋白質(zhì)定量技術(shù)，因能精確定量分析復(fù)雜樣品中的特定蛋白質(zhì)得以迅速發(fā)展［9-10］.

目前，已有一些基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)研究.岑衛(wèi)健和朱平川［3］設(shè)計(jì)了雙向電泳-基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜，分析蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)方案；萬(wàn)建等［7］開發(fā)了針對(duì)研究生的定性蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì).文獻(xiàn)調(diào)研顯示，低豐度蛋白質(zhì)由于相對(duì)含量低，難以檢測(cè)，目前尚缺乏基于質(zhì)譜的低豐度靶向蛋白質(zhì)定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)教學(xué)研究.為使學(xué)生了解生物質(zhì)譜的前沿研究技術(shù)，滿足培養(yǎng)卓越拔尖創(chuàng)新型人才的教學(xué)要求，本文使用南方科技大學(xué)化學(xué)系實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心的液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，從方法建立、色譜分離、質(zhì)譜檢測(cè)到數(shù)據(jù)分析，探索基于質(zhì)譜MRM技術(shù)的蛋白質(zhì)定量教學(xué)實(shí)驗(yàn).

1 基本原理

1.1 MRM技術(shù)

MRM技術(shù)是基于高分辨、高精度質(zhì)譜儀的離子監(jiān)視技術(shù)，通常在三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀上進(jìn)行，其技術(shù)原理如圖1所示.在3個(gè)串聯(lián)的四級(jí)桿中，有且僅有被預(yù)先選擇的擁有特定質(zhì)荷比（m/z）的母離子能夠順利通過(guò)第一級(jí)四級(jí)桿（Q1），而其他未被選擇的離子將被排除；在第二級(jí)四級(jí)桿（Q2）中，來(lái)自Q1的母離子將在預(yù)設(shè)的撞擊能量下經(jīng)過(guò)碰撞誘導(dǎo)解離模式（collision-induced dissociation，CID）發(fā)生碎裂，而后類似于Q1；第三級(jí)四級(jí)桿（Q3）用來(lái)過(guò)濾子離子，只有符合設(shè)定值的母離子-子離子對(duì)信號(hào)被特異性地檢測(cè)到.通過(guò)兩級(jí)過(guò)濾策略，去除了大量干擾離子，有效降低了背景噪聲及干擾，因而MRM質(zhì)譜掃描具有靈敏度高、重現(xiàn)性好和準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)［11-14］.

圖1 三重四級(jí)桿多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)原理

1.2 肽段二級(jí)質(zhì)譜碎裂機(jī)制

多肽鍵能在不同的共價(jià)鍵位置打斷形成不同的碎片離子.根據(jù)共價(jià)鍵理論和鍵能比較，最容易產(chǎn)生的是酰胺鍵斷裂的b-y模式，原理如圖2所示［15］.三重四級(jí)桿中的CID碎裂模式通常只產(chǎn)生較少的b離子，這些離子的信號(hào)比較弱，相比之下，CID碎裂更傾向于產(chǎn)生y離子，生成的y離子信號(hào)也比較強(qiáng).在MRM實(shí)驗(yàn)中，選擇母離子-子離子對(duì)時(shí)，會(huì)優(yōu)先考慮y離子.

圖2 多肽二級(jí)質(zhì)譜的b-y模式碎裂[15]

1.3 質(zhì)譜MRM方法建立

MRM用于蛋白質(zhì)定量時(shí)，是根據(jù)待分析的目標(biāo)蛋白質(zhì)氨基酸序列，選擇蛋白質(zhì)特異性肽段及其對(duì)應(yīng)的高響應(yīng)子離子，利用高響應(yīng)子離子的信號(hào)強(qiáng)度反映該蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度.每個(gè)蛋白質(zhì)特異性肽段一般選擇2～4個(gè)母離子-子離子對(duì)［1］.

在建立MRM方法時(shí)，肽段及其子離子的選擇一般有2種策略.（1）根據(jù)已有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行選擇，其又可以細(xì)分為2類，一類是從已有的發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，總結(jié)出感興趣的肽段；另一類是根據(jù)現(xiàn)有的整合了不同實(shí)驗(yàn)平臺(tái)、不同搜庫(kù)軟件的數(shù)據(jù)庫(kù)選擇，如：PeptideAtlas、SRMAtlas和 MRMAtlas等，這些數(shù)據(jù)庫(kù)存儲(chǔ)了以往實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)特異性肽段和其相應(yīng)的母離子-子離子對(duì).（2）通過(guò)生物信息學(xué)計(jì)算工具，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)特異性肽段［16］.

2 教學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 儀器和試劑

高效液相色譜Ultimate 3000（Thermo Fisher公司，美國(guó)）；三重四極桿質(zhì)譜儀TSQ Vantage（Thermo Fisher公司，美國(guó)）；牛血清白蛋白酶解標(biāo)準(zhǔn)品（New England Biolabs公司，美國(guó)）；聚酪氨酸（Tyr）-1，3，6校正液；液相色譜質(zhì)譜（liquid chromatograph-mass spectrometry，LC-MS）級(jí)純乙腈（Fisher公司，美國(guó)）；屈臣氏蒸餾水；LC-MS級(jí)純甲酸（Fluka公司，瑞士）.

2.2 樣品制備

將牛血清白蛋白酶解標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水溶解，配成物質(zhì)的量濃度為 1 μmol/L的溶液，分裝冷凍保存.實(shí)驗(yàn)前將樣品用含0.1%甲酸的水溶液稀釋，配制成 10、20、50、100和 200 nmol/L 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液備用.

2.3 質(zhì)量校準(zhǔn)

連接管路并打開注射泵.在調(diào)諧界面中點(diǎn)擊菜單欄設(shè)置（setup）中的注射泵和取樣回路（syringe pump&sample loop）進(jìn)入流速更改界面，設(shè)置流速（flow rate）為 5.0 μL/min，注射器類型（syringe type）為 Hamilton，注射體積（volume）為 500 μL，掃描模式為Q1MS全掃描，掃描范圍為100～1 100 m/z.泵入聚Tyr-1，3，6校正液，采集外標(biāo)物Tyr1（181.85 Da）、Tyr3（508.01 Da）和Tyr6（997.17 Da）譜圖，若誤差值大于0.70 Da，應(yīng)校準(zhǔn)直至軟件通過(guò).

2.4 色譜分離

色譜柱：賽默飛世爾Hypersil GOLD?C18反相色譜柱，柱長(zhǎng)15.0 cm，柱內(nèi)徑2.1 mm，粒徑5.0 μm.

流動(dòng)相：A相為含有0.1%甲酸的純水；B相為含有0.1% 甲酸的乙腈.流速為200.0 μL/min，柱溫50℃，洗脫梯度條件列于表1.色譜流出樣品直接通過(guò)電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）進(jìn)入質(zhì)譜.液相色譜進(jìn)樣量10 μL.

表1 色譜洗脫梯度程序

2.5 質(zhì)譜檢測(cè)

液相色譜分離后的多肽組分進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)分析.在總結(jié)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)資料的基礎(chǔ)上，選取了3條肽段，每條肽段選取了2個(gè)母離子-子離子對(duì)進(jìn)行分析，肽段序列和其母離子-子離子對(duì)信息如表 2所示［8］.主要質(zhì)譜參數(shù)：ESI噴霧電壓3.5 kV；質(zhì)譜正離子模式采集；鞘氣4.5 L/min，輔助氣11.0 L/min，吹掃氣0；離子傳輸管溫度320℃；質(zhì)譜采集時(shí)間35.0 min；循環(huán)時(shí)間0.1 s；碰撞能量設(shè)置為28 V.

表2 多肽片段離子對(duì)設(shè)置［8］

2.6 數(shù)據(jù)分析

LC-MS分析結(jié)束后，以物質(zhì)的量濃度為50 nmol/L樣品為例，得到總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）如圖3所示.在數(shù)據(jù)分析軟件（Xcalibur）中用定性瀏覽器（qual browser）打開數(shù)據(jù)文件，輸入肽段母離子質(zhì)荷比，從TIC圖中提取各條肽段的離子流圖（圖4），分別選取特定肽段，輸入其2個(gè)子離子的質(zhì)荷比，得到子離子的離子流圖，積分得到相應(yīng)的峰面積（area，AA）.值得注意的是，每條肽段設(shè)置的2個(gè)子離子，因是源自同一條肽段碎裂產(chǎn)生，其保留時(shí)間應(yīng)該一致.若源自于同一母離子的2個(gè)子離子保留時(shí)間不一致，則是假陽(yáng)性峰，定量時(shí)應(yīng)排除.

圖3 總離子流圖

圖4 不同母離子的子離子積分（a）464.25；（b）547.32；（c）653.36

以樣品物質(zhì)的量（c）濃度為橫坐標(biāo)，3條肽段的子離子積分面積總和為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合 得 到 線 性 方 程 為 y=2.80×103c-2.25×104，R2=0.994 9.

不同樣品間，根據(jù)目標(biāo)肽段的子離子峰面積值，進(jìn)行相對(duì)定量分析，也可以通過(guò)加入標(biāo)準(zhǔn)肽段實(shí)現(xiàn)精確絕對(duì)定量分析［17-20］.曹東等［21］介紹了基于內(nèi)標(biāo)法的蛋白質(zhì)絕對(duì)定量方法，包括基于同位素標(biāo)記的肽段、同位素標(biāo)記的氨基酸、同位素標(biāo)簽標(biāo)記的肽段等作為內(nèi)標(biāo)的蛋白質(zhì)絕對(duì)定量方法.與相對(duì)定量分析相比，絕對(duì)定量分析不同的是，由于內(nèi)標(biāo)肽和內(nèi)源性肽具有相同的序列，因此，具有相同的液相色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜離子化效率.通過(guò)比較二者子離子信號(hào)強(qiáng)度，可獲取內(nèi)源性多肽的量和對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的量.因教學(xué)時(shí)長(zhǎng)限制，對(duì)此僅向?qū)W生作擴(kuò)展介紹，并鼓勵(lì)感興趣的學(xué)生繼續(xù)從事相關(guān)方向的項(xiàng)目研究.

3 教學(xué)效果

3.1 教學(xué)特色

在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，學(xué)生自主使用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試分析，了解了質(zhì)譜全掃描和MRM掃描的特點(diǎn).教學(xué)難點(diǎn)是質(zhì)譜分析方法的建立，本文以相關(guān)前沿文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)和理論相結(jié)合，提升學(xué)生對(duì)生物質(zhì)譜、蛋白質(zhì)組學(xué)等前沿研究領(lǐng)域的知識(shí)技術(shù)儲(chǔ)備，拓寬了學(xué)生的視野，激發(fā)了研究興趣.

3.2 學(xué)生成績(jī)分布

分析實(shí)驗(yàn)報(bào)告完成情況，學(xué)生參與實(shí)驗(yàn)的積極性等，統(tǒng)計(jì)近3年學(xué)生實(shí)驗(yàn)成績(jī)分布情況如表3所示.95.0%的學(xué)生都能順利完成實(shí)驗(yàn)并撰寫完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，90.0%的學(xué)生實(shí)驗(yàn)成績(jī)達(dá)到優(yōu)良.

表3 近3年學(xué)生實(shí)驗(yàn)成績(jī)分布

3.3 學(xué)生滿意度

分析2018—2021年學(xué)生評(píng)教情況，學(xué)生滿意度為100%.近3年教師教學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)得分分別為96、96和98分.因原有的儀器分析實(shí)驗(yàn)課測(cè)定對(duì)象為離子、小分子，本實(shí)驗(yàn)引入蛋白質(zhì)大分子的分析，豐富了儀器實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，拓寬了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的廣度，也收到了較滿意的教學(xué)效果.

4 結(jié)束語(yǔ)

本文將學(xué)科前沿研究技術(shù)轉(zhuǎn)化為教學(xué)實(shí)驗(yàn)，介紹了基于質(zhì)譜MRM技術(shù)的蛋白質(zhì)定量的原理、方法和實(shí)驗(yàn)流程.實(shí)驗(yàn)首先用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行儀器的質(zhì)量校準(zhǔn)，然后以胰蛋白酶酶解的牛血清白蛋白為樣品，選擇分析了3條肽段，獲得了總離子流圖和各條肽段的子離子峰面積.整個(gè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)需3～4學(xué)時(shí)，操作簡(jiǎn)便，可重復(fù)性高，適合在本科和研究生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中應(yīng)用.未來(lái)將進(jìn)一步順應(yīng)時(shí)代發(fā)展，探索實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的改革創(chuàng)新，更加注重學(xué)科前沿交叉技術(shù)在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的運(yùn)用，以滿足新時(shí)代培養(yǎng)卓越創(chuàng)新人才的要求.