龜苓膏對(duì)陰虛火旺模型大鼠的滋陰瀉火作用研究

李 晗，高云航，宋 玲，施偉東，李玲芝，陳騰飛，侯紅平，張廣平，葉祖光*

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.廣西中恒創(chuàng)新醫(yī)藥研究有限公司，廣西 南寧 530000）

龜苓膏是我國歷史悠久的傳統(tǒng)藥膳，是經(jīng)典的藥食同源代表方劑。龜苓膏主要以龜甲和茯苓為原料，再配以金銀花、蒲公英、甘草等藥物精制而成。其性溫和，不涼不燥，具有清熱祛濕、旺血生肌、止瘙癢、去暗瘡、潤腸通便、滋陰補(bǔ)腎等功效。龜甲具有良好的滋陰效果，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》并被列為上品，《本草綱目》記載其“補(bǔ)心、補(bǔ)腎、補(bǔ)血，皆以養(yǎng)陰也……觀龜甲所主諸病，皆屬陰虛血弱”［1］。研究表明，龜甲治療陰虛火旺證不僅可改善臨床癥狀，能減輕化學(xué)藥物引發(fā)的不適反應(yīng)，提高機(jī)體免疫力，改善陰虛證患者的內(nèi)分泌與血液系統(tǒng)［2］。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，陰虛火旺患者血清中的環(huán)磷酸腺苷/環(huán)磷酸鳥苷（cAMP/cGMP）比值及皮質(zhì)醇（Cor）含量上升［3］，超氧化物歧化酶（SOD）與丙二醛（MDA）也呈現(xiàn)一定的變化趨勢［4］，并伴隨Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶含量上升［5-6］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用灌胃甲狀腺素致陰虛火旺病理模型，對(duì)龜苓膏是否通過調(diào)節(jié)機(jī)體的第二信使、能量代謝及氧化應(yīng)激等途徑改善陰虛火旺證進(jìn)行了初步探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)健康SD大鼠，雄性，鼠齡8～10周，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所SPF級(jí)動(dòng)物房，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2015-0041。飼養(yǎng)條件為12 h明暗交替，溫度（23±1）℃，濕度（50±15）%，自主飲水及進(jìn)食。

1.2 藥物與試劑 龜苓膏干膏粉（廣西梧州雙錢實(shí)業(yè)有限公司，1 g龜苓膏干膏粉相當(dāng)于5.13 g生藥）；左甲狀腺素鈉片（商品名：優(yōu)甲樂，每片50 μg，美國默克公司）；cAMP、cGMP ELISA檢測試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；SOD、MDA與Cor ELISA檢測試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器 電子分析天平（德國Sartorius公司）；電子天平（瑞士METTLER公司）；高速離心機(jī)（美國Beckman公司）；VICTOR X型多標(biāo)記酶標(biāo)儀（美國Perkin Elmer公司）。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組及龜苓膏低、中、高劑量組，每組10只。

2.2 給藥量計(jì)算 龜苓膏干膏粉1.4 g能制成200 g的龜苓膏，人每日食用龜苓膏的用量為400 g，則人每日服用劑量為0.047 g干膏粉/kg。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)劑量，其中中劑量為人的等效劑量的4倍，換算后大鼠低、中、高劑量分別為：0.66 g干膏粉/kg、1.32 g干膏粉/kg、2.64 g干膏粉/kg，即3.4 g生藥/kg、6.8 g生藥/kg、13.6 g生藥/kg。

2.3 造模與給藥 空白組、模型組每天正常飼喂，早上灌胃給予飲用水，給藥體積為10 ml/kg；龜苓膏低、中、高劑量組分別按3.4 g生藥/kg、6.8 g生藥/kg、13.6 g生藥/kg的劑量預(yù)給藥，給藥體積為10 ml/kg，連續(xù)7 d；第8 d起，模型組和龜苓膏低、中、高劑量組每天上午灌胃150 mg/kg優(yōu)甲樂混懸液（給藥質(zhì)量濃度為15 mg/ml，給藥體積為10 ml/kg），約90 min后龜苓膏低、中、高劑量組再灌胃相應(yīng)劑量的藥物，給藥體積為10 ml/kg，連續(xù)14 d。末次給藥（第21 d）后60 min，以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉（用量為3.5 ml/kg），麻醉后腹主動(dòng)脈取血置于離心管中備用，并剪取大鼠肝臟。

2.4 一般狀態(tài)觀察 每天觀察實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠的精神狀態(tài)、攝食、活動(dòng)情況與皮毛色澤，并于第1 d、第7 d、14 d和第21 d稱量大鼠體質(zhì)量，觀察大鼠的體質(zhì)量變化情況。

2.5 大鼠血漿cAMP、cGMP的含量測定 取大鼠全血置于肝素處理過的離心管中，4 000 r/min離心10 min后分離血漿，于-20℃凍存待測。采用酶聯(lián)免疫法檢測cAMP、cGMP的含量，具體操作按照試劑盒說明方法進(jìn)行。并計(jì)算cAMP/cGMP比值。

2.6 大鼠肝臟Na+-K+-ATP酶與Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的測定 稱取50～100 mg大鼠肝臟組織，用預(yù)冷的PBS沖洗去血漬，濾紙吸干剪碎，隨后放入加有鋼珠的研磨管內(nèi)，向研磨管中加入1 ml預(yù)冷并含有1% protein K蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，勻漿機(jī)進(jìn)行4 000 r/min勻漿處理后，冰上裂解30 min，以4℃12 000 r/min離心10 min，提取上清后，采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定，按照酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒說明書檢測Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性。

2.7 大鼠血清SOD活性及MDA、Cor含量的測定 取大鼠血于離心管中，室溫下靜置30 min，3 000 r/min離心5 min后取上清液，-20℃保存，按照酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒說明書檢測大鼠血清SOD活性與MDA、Cor含量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS Statistics 20統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）的形式表示，組間差異采用單因素方差分析（One-Way-Anova），P＜0.05為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 龜苓膏對(duì)陰虛火旺證模型大鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量的影響 在龜苓膏低、中、高劑量組預(yù)給藥期間，大鼠精神狀態(tài)良好，活潑好動(dòng)，毛色有光澤，飲水、進(jìn)食及二便均正常。大鼠灌胃給予優(yōu)甲樂進(jìn)行造模后，模型組大鼠前期出現(xiàn)煩躁、拱背扎堆、排泄物增多，后期出現(xiàn)明顯消瘦、毛發(fā)光澤度差、大便干結(jié)等癥狀。龜苓膏低、中、高劑量組大鼠部分出現(xiàn)煩躁、拱背扎堆情況，整體狀態(tài)優(yōu)于模型組。在體質(zhì)量方面，預(yù)給藥期間（第1～7 d）各組大鼠體質(zhì)量均呈現(xiàn)增長趨勢，模型組大鼠體質(zhì)量在造模7 d后（第14 d）時(shí)開始出現(xiàn)體質(zhì)量增長緩慢，在造模14 d后（第21 d），體質(zhì)量顯著低于空白組（P＜0.01）；與模型組比較，龜苓膏高劑量組的大鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.01），結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較 （g，）

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較 （g，）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01

組 別空白組模型組龜苓膏低劑量組龜苓膏中劑量組龜苓膏高劑量組n 10 10 10 10 10劑量（g生藥/kg）- -3.4 6.8 13.6第1 d 249.0±8.0 248.4±8.8 249.6±9.4 249.0±9.2 249.1±9.2第7 d 298.1±10.9 294.0±16.5 294.7±13.1 294.9±10.3 298.3±12.5第14 d 339.8±12.8 322.9±29.9 333.6±20.8 325.8±11.9 335.5±16.5第21 d 385.6±23.0 348.3±30.1①342.6±15.1 354.5±13.0 379.1±23.8②

3.2 龜苓膏對(duì)陰虛火旺模型大鼠血漿cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影響 見表2。與空白組比較，模型組大鼠血漿cAMP含量及cAMP/cGMP比值顯著升高（P＜0.01），cGMP含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，龜苓膏低、中、高劑量組大鼠血漿中cAMP的含量顯著降低（均P＜0.01）；龜苓膏中、高劑量組大鼠血漿中cGMP水平顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），cAMP/cGMP比值顯著降低（P＜0.01）。

表2 龜苓膏對(duì)陰虛火旺模型大鼠cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影響 （）

表2 龜苓膏對(duì)陰虛火旺模型大鼠cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影響 （）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別空白組模型組龜苓膏低劑量組龜苓膏中劑量組龜苓膏高劑量組n 10 10 10 10 10劑量（g生藥/kg）- -3.4 6.8 13.6 cAMP（pmol/ml）24.5±2.3 75.2±4.4①65.2±5.8③56.4±2.6③49.3±5.4③cGMP（pmol/ml）12.4±0.8 9.7±1.1①10.1±1.2 11.0±1.4②11.9±1.4③cAMP/cGMP 2.0±0.2 7.9±1.0①6.6±1.0 5.2±0.7③3.4±0.7③

3.3 龜苓膏對(duì)陰虛火旺模型大鼠肝臟中Na+-K+-ATP酶與Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響 見表3。與空白組比較，模型組大鼠肝臟中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，龜苓膏低、中、高劑量組大鼠肝臟中Na+-K+-ATP酶活性顯著降低（P＜0.01），Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈降低趨勢，但無顯著性差異。

表3 龜苓膏對(duì)陰虛火旺模型大鼠肝臟中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響 （）

表3 龜苓膏對(duì)陰虛火旺模型大鼠肝臟中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響 （）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01

組 別空白組模型組龜苓膏低劑量組龜苓膏中劑量組龜苓膏高劑量組n 10 10 10 10 10劑量（g生藥/kg）- -3.4 6.8 13.6 Na+-K+-ATP［μmol Pi/（mg·h）］0.94±0.20 1.65±0.11①1.44±0.09②1.34±0.20②1.32±0.18②Ca2+-Mg2+-ATP［μmol Pi/（mg·h）］1.12±0.09 1.69±0.14①1.59±0.15 1.54±0.13 1.50±0.20

3.4 龜苓膏對(duì)陰虛火旺模型大鼠血清SOD活性及MDA、Cor含量的影響 見表4。與空白組比較，模型組大鼠血清中SOD活性顯著下降，Cor和MDA含量顯著升高（均P＜0.01）。與模型組比較，龜苓膏低、中、高劑量組大鼠血清中SOD活性顯著上升（P＜0.05或P＜0.01），龜苓膏中、高劑量組大鼠血清中MDA含量顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），龜苓膏低、中、高劑量組的大鼠血清中Cor含量有降低趨勢，但無顯著性差異。

表4 龜苓膏對(duì)陰虛火旺模型大鼠SOD活性及MDA、Cor含量的影響 （）

表4 龜苓膏對(duì)陰虛火旺模型大鼠SOD活性及MDA、Cor含量的影響 （）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別空白組模型組龜苓膏低劑量組龜苓膏中劑量組龜苓膏高劑量組n 10 10 10 10 10劑量（g生藥/kg）- -3.4 6.8 13.6 SOD（U/ml）196.8±4.6 121.2±6.0①135.3±10.6②150.5±11.4③163.2±9.7③MDA（ng/ml）116.9±16.2 203.6±26.9①188.0±24.9 180.2±23.6②163.1±22.0③Cor（ng/ml）16.1±2.4 23.2±3.3①19.5±4.7 19.8±6.1 18.8±3.8

4 討論

陰虛火旺證是臨床常見的中醫(yī)證型，多因機(jī)體陰精或津液虧虛而不能制陽，致使陽氣亢盛，機(jī)體代謝加快，產(chǎn)熱增加，從而導(dǎo)致虛熱內(nèi)生的病理狀態(tài)。

甲狀腺素作為能量代謝的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以增加機(jī)體的基礎(chǔ)代謝，增加產(chǎn)熱，長時(shí)間使用甲狀腺素可引發(fā)形體消瘦、暴躁易怒等現(xiàn)象，這與陰虛火旺體質(zhì)表現(xiàn)相一致［7-8］。因此，采用甲狀腺素建立陰虛火旺模型的方法具有操作簡便、成模時(shí)間短、重復(fù)性好、動(dòng)物死亡率及成本低等優(yōu)點(diǎn)，是研究陰虛火旺證的傳統(tǒng)造模方法［9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，連續(xù)灌胃150 mg/kg優(yōu)甲樂混懸液14 d后，前期大鼠出現(xiàn)煩躁易怒、拱背扎堆、排泄物增多等現(xiàn)象，后期大鼠出現(xiàn)明顯消瘦、毛發(fā)光澤度差、大便干結(jié)等癥狀表現(xiàn)，均與陰虛火旺證的臨床癥狀相符，以上結(jié)果表明本研究陰虛火旺模型大鼠復(fù)制成功。

龜苓膏具有清熱解毒、滋陰補(bǔ)腎等功效［10］，其主要有效成分為皂苷、多糖、生物堿、胡蘿卜烴類、葉綠素、黃酮、傘花內(nèi)酯、揮發(fā)油、鈣、鐵、維生素C、維生素B1、β-谷甾醇等［11］。古人認(rèn)為“龜乃陰中至陰之物”，龜甲性平，不溫不涼，是滋陰效果最佳的藥物?，F(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)，龜甲可降低甲亢陰虛大鼠整體的耗氧量、減緩心率、增加飲水量及尿量。與此同時(shí)，龜甲還能提高陰虛證大鼠的抗氧化能力，并調(diào)節(jié)Bax與Bcl-2等衰老相關(guān)因子的蛋白表達(dá)［1］。

本研究重點(diǎn)關(guān)注與陰虛火旺證密切相關(guān)的生理指標(biāo)，其中包括第二信使cAMP、cGMP的含量及cAMP/cGMP比值的變化，與能量代謝相關(guān)的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性以及以SOD活性、MDA含量為代表的氧化應(yīng)激指標(biāo)。

有文獻(xiàn)報(bào)道，機(jī)體代謝調(diào)節(jié)因子cAMP與cGMP是細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，是生命信息傳遞的“第二信使”［12］，且機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌功能與血中cAMP和cGMP的水平密切相關(guān)［13-14］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)中醫(yī)陰陽理論的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了大量的研究與臨床觀察，發(fā)現(xiàn)陰虛火旺證患者神經(jīng)-腎上腺系統(tǒng)功能偏高，交感神經(jīng)異常興奮，cAMP水平升高，cGMP水平降低或維持不變，因此認(rèn)為選用cAMP/cGMP比值變化進(jìn)行評(píng)價(jià)更為準(zhǔn)確［15-16］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠血漿cAMP、cGMP含量與cAMP/cGMP比值，發(fā)現(xiàn)陰虛火旺模型組大鼠的血漿cAMP含量及cAMP/cGMP比值顯著升高，cGMP含量較空白組顯著降低，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相一致［17-18］。而與模型組比較，龜苓膏低、中、高劑量組大鼠血漿中cAMP的含量顯著降低，中、高劑量組龜苓膏組大鼠血漿cGMP水平顯著增加，cAMP/cGMP比值顯著降低，提示龜苓膏可以通過調(diào)節(jié)大鼠血漿cAMP、cGMP的含量及cAMP/cGMP比值起到滋陰瀉火的作用。

“陰虛則陽亢”，因此陰虛患者臨床癥狀多表現(xiàn)心悸脈數(shù)、五心煩熱、易于激動(dòng)，研究發(fā)現(xiàn)以上現(xiàn)象的發(fā)生可能與能量代謝的增高有關(guān)［19-20］。甲狀腺素不但能使大鼠產(chǎn)生煩躁易怒等陰虛火旺癥狀，在細(xì)胞水平還可以結(jié)合特異性受體，使細(xì)胞核RNA聚合酶被激活，增加細(xì)胞膜ATP酶的含量，進(jìn)而使細(xì)胞能量代謝速率增加，能量消耗加快，產(chǎn)熱增加，體溫升高［21-22］。因此，ATP酶活性的檢測也成為判斷大鼠是否具有陰虛火旺證的代表性指標(biāo)之一。同時(shí)肝臟作為體內(nèi)最大的實(shí)質(zhì)性臟器，肝臟細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的改變也會(huì)直接影響機(jī)體的“熱”。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肝臟中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均顯著升高，與模型組比較，龜苓膏低、中、高劑量組的大鼠肝臟中Na+-K+-ATP酶活性顯著降低，Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性呈降低趨勢。提示龜苓膏可以通過調(diào)節(jié)大鼠肝臟Na+-K+-ATP酶的活性減輕機(jī)體“火旺”的狀態(tài)。

文獻(xiàn)報(bào)道顯示，陰虛火旺證的病理生理學(xué)基礎(chǔ)也與體內(nèi)自由基代謝異常相關(guān)，其中“火旺”可能是機(jī)體氧化代謝過程增強(qiáng)、自由基生成增多的表現(xiàn)［23］。若不能及時(shí)清除，過量的自由基會(huì)攻擊機(jī)體內(nèi)各種細(xì)胞器以及生命大分子物質(zhì)，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體在分子水平、細(xì)胞水平及組織器官水平的損傷［24-25］。SOD作為清除氧自由基氧化的重要保護(hù)酶，能夠清除在生理過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，有效防止有害物質(zhì)對(duì)組織細(xì)胞造成的損傷。MDA為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中最具代表性的代謝產(chǎn)物，現(xiàn)代研究多用于對(duì)機(jī)體自由基代謝水平的衡量［26-27］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠的血清中SOD活性顯著下降，MDA含量顯著上升，符合陰虛火旺致氧化損傷表現(xiàn)。與模型組比較，龜苓膏低、中、高劑量組的大鼠血清中SOD活性顯著上升，龜苓膏中、高劑量組的大鼠血清中MDA含量顯著下降。提示龜苓膏可以通過調(diào)節(jié)SOD活性與MDA含量改善陰虛火旺證。

陰虛火旺證除以煩躁易怒、身形消瘦為主要表現(xiàn)外，還常表現(xiàn)為腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)［28］。作為一種類固醇類激素，皮質(zhì)醇主要由腎上腺皮質(zhì)合成并分泌，其在大鼠體內(nèi)主要以Cor的形式存在，因此本實(shí)驗(yàn)檢測大鼠血清中Cor的含量來進(jìn)一步評(píng)價(jià)龜苓膏對(duì)陰虛火旺模型大鼠的滋陰瀉火作用。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠的血清中Cor含量顯著升高。與模型組比較，龜苓膏低、中、高劑量組的大鼠血清中Cor含量有所降低，但無顯著性差異。

綜上所述，龜苓膏作為“藥食同源”的代表方劑，能下調(diào)cAMP/cGMP比值，降低能量代謝Na+-K+-ATP酶的活性，減慢能量消耗速率，同時(shí)通過上調(diào)SOD活性、降低MDA含量，進(jìn)而起到滋陰瀉火的作用。本研究為探討龜苓膏的滋陰瀉火作用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也為在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下“藥食同源”食品的合理應(yīng)用提供科學(xué)研究思路。