廣州地區(qū)2018-2021年非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株菌種鑒定結(jié)果分析

陳華 賴曉宇 陳品儒 胡錦興 鄧政先 許柳清 梁鋒

1廣州市胸科醫(yī)院內(nèi)一科（廣州 510095）；2廣東省結(jié)核病控制中心（廣州 510630）

非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）［1］新菌種不斷被發(fā)現(xiàn)，目前已逾200種（http：//www.bacterio.net/mycobacterium.html）。NTM 病的發(fā)病率和流行率在全球范圍內(nèi)不斷上升，且分離率及菌種分布呈現(xiàn)明顯國家和地區(qū)差異；我國幅員遼闊，氣候條件差異明顯，NTM 分布呈現(xiàn)明顯的地域區(qū)別，潮熱地帶、沿海地區(qū)多見［1-2］。廣東省處于潮熱及沿海地帶，筆者既往研究顯示［3］，廣州市NTM 菌種分離率明顯高于全國平均水平［4］，而且菌種分布與全國其他地區(qū)亦有區(qū)別［4］。中國非結(jié)核分枝桿菌監(jiān)測研究（CNTMS）的17 家醫(yī)院中對NTM 肺 ?。╪ontuberculous mycobacterialpulmonary disease，NTM-PD）進行前瞻性和全國性監(jiān)測顯示：中國約1/15 的PTB 患者伴有非結(jié)核分枝桿菌感染，NTM-PD 的比例表現(xiàn)出顯著的地理多樣性，從西北部的3.2%到南部的9.2%。胞內(nèi)分枝桿菌最多，其次是膿腫分枝桿菌復合體。本研究對2018-2021年廣州市胸科醫(yī)院臨床分離的NTM 菌株進行菌種鑒定，收治患者中NTM-PD 流行情況進行了回顧性分析，以了解廣州地區(qū)NTM 的菌種分布及NTM-PD 狀況變化，為NTM-PD 的防治提供參考依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018-2021年廣州市胸科醫(yī)院住院及門診就診患者的痰液、支氣管沖洗液、膿液、尿液、漿膜腔積液、腦脊液和穿刺物等標本進行分枝桿菌培養(yǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1 細菌、試劑與儀器 結(jié)核分枝桿菌標準菌株H37Rv 由國家結(jié)核病參比實驗室提供。晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（微陣列基因芯片法）、基因芯片檢測平臺及配套試劑、LuxScan-10K/B 微陣列芯片激光掃描儀均購自北京博奧生物有限公司；抗原檢測試劑（膠體金法）購自杭州創(chuàng)新生物公司；PCR 擴增儀、高速離心機購自德國Eppendorf公司；分枝桿菌細胞破碎儀購自上海仁度公司［3］。

1.2.2 菌種鑒定方法 NTM 菌種鑒定方法［4］：應用美國BD 公司BACTEC MGIT960 系統(tǒng)進行分枝桿菌培養(yǎng)；對培養(yǎng)所得的菌，應用成都博奧晶芯生物科技有限公司生產(chǎn)的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（DNA 微陣列芯片法）將培養(yǎng)菌鑒定至17 個種或群：結(jié)核分枝桿菌復合群、龜/膿腫分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、戈登分枝桿菌、偶然分枝桿菌、海/潰瘍分枝桿菌、蘇爾加/瑪爾摩分枝桿菌、蟾分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、土分枝桿菌、金色分枝桿菌、草分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌［3］。具體實驗操作嚴格按儀器與試劑說明書進行。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，計量資料為偏態(tài)分布，采用M（P25，P75）表示；計數(shù)資料以例（%）表示，組間差異的比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法，兩組間比較用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 標本來源分布 對臨床標本進行分枝桿菌培養(yǎng)，培養(yǎng)出陽性菌株后，需患者回院做檢測。其中18 501 株陽性菌采用基因芯片法進行菌種鑒定，共鑒定出結(jié)核分枝桿菌復合群11 512 株，NTM 6 558 株，無法分辨菌種431 株；NTM 菌株中，同一標本培養(yǎng)出2 種以上混合菌種376 株（2.03%）。分離出的臨床標本來源主要為痰和支氣管沖洗液94.71%（17 522/18 501），見表1。

表1 臨床標本來源分布Tab.1 Distribution of clinical specimen sources

2.2 每年度NTM 分離率與性別、年齡分布特點 臨床上，患者常多次行分枝桿菌培養(yǎng)檢測，若同一病例有多次培養(yǎng)陽性與菌種/群鑒定結(jié)果，每年度則以1 例計算，剔除重復后6 558 株NTM共來自于4 336 例患者/年（跨年度患者有重疊），不同年度NTM 分離率、性別、年齡分布特點，見表2。

表2 2018-2021年間各年度NTM 分離率與性別、年齡分布特點Tab.2 Characteristics of NTM separation rates，sex and age distribution in each year from 2018 to 2021

2.3 每年度病例數(shù)與菌種分布特點 對來自4 336例患者/年的非結(jié)核分枝桿菌進行了菌種或復合群鑒定，種群分布達16 種，鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復合群群（M. avium complex，MAC）和龜-膿腫分枝桿菌復合群在各年度均為廣州市主要NTM 分離菌種。2018-2021年間共有12 950 例患者分枝桿菌培養(yǎng)陽性，采用基因芯片法進行菌種鑒定，NTM的部分患者治療效果不佳，長期培養(yǎng)有分枝桿菌生長，四年間同一患者僅計算一次培養(yǎng)陽性與菌種/群鑒定結(jié)果，共來自于3 624 例患者，NTM 感染患者分離率27.98 %（3 624/12 950）。見表3。

表3 2018-2021年各年度NTM 病例數(shù)與菌種分布特點Tab.3 Number of NTM cases and distribution characteristics of bacteria in each year from 2018 to 2021 例（%）

2.4 NTM 感染者菌種與年齡分布特點 四年間NTM 感染菌種前五位順序為：MAC（占36.01%）、龜-膿腫分枝桿菌（占34.22%）、堪薩斯分枝桿菌（占7.89%）、偶發(fā)分枝桿菌（占7.86%）、戈登分枝桿菌（占3.78%）。3624 例NTM 感染患者，男女性別比為1∶139（1694∶1930），高峰年齡段均為51 ～70 歲（占46.36%），男女各占44.16%（748/1 694），48.29%（932/1 930）。MAC、龜-膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌等常見菌種與年齡段分布情況，見圖1。

圖1 各年齡段分布情況Fig.1 Distribution by age group

3 討論

NTM 病通常屬于機會性感染，與MTB 相比，NTM的毒力和致病性較低。但人與動物皆可感染，氣候和地域可影響其感染情況和菌種分布。研究發(fā)現(xiàn)，在世界范圍內(nèi)NTM 菌所導致疾病的發(fā)病率呈上升趨勢［5］。我國第五次結(jié)核病流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，NTM在分枝桿菌分離株中占22.9%［6］。

我國幅員遼闊，NTM 感染率和流行情況有著明顯的地區(qū)差異，且與氣候環(huán)境相關(guān)，某些地區(qū)其NTM 的發(fā)病率和患病率甚至超過結(jié)核病的發(fā)病率和患病率［1］。筆者既往研究顯示［3］，廣州市由于處于潮熱及沿海地帶，NTM 菌株分離率明顯高于全國平均水平［3，7］。

本研究顯示，2018-2021年間培養(yǎng)陽性的18 501 株進行菌種鑒定的標本中，NTM 菌株檢出率為35.45%（6 558/18 501），4年間NTM 感染的部分患者治療效果不佳，長期培養(yǎng)有分枝桿菌生長，四年間同一患者僅計算一次培養(yǎng)陽性與菌種/群鑒定結(jié)果，共來自于3 624 例患者，NTM 患者感染率為27.98 %（3 624/12 950）。高于第五次結(jié)核病流行病學調(diào)查的22.9 %；也高于本地區(qū)對2013-2015年NTM 分離率24.0%的報道［7］，呈明顯上升趨勢。世界范圍而言，隨著更多先進的實驗室技術(shù)的發(fā)展，臨床醫(yī)生意識的加強，全球報道的NTM 病發(fā)病率近十年呈增加趨勢［8-9］。

本研究的臨床標本中，以痰及支氣管沖洗液為主，共占臨床標本的94.71%（17 522/18 501），痰與支氣管沖洗液的NTM 總檢出率為36.67%（6 426/17 522）。但不容忽視的外科手術(shù)切除的組織塊培養(yǎng)陽性標本中，NTM 菌株分離率也高達27.34%（35/128），筆者既往研究指出，手術(shù)聯(lián)合化療治療NTM 病能夠提高患者痰菌陰轉(zhuǎn)率及治療成功率［10］。而膿液標本，則為皮膚膿腫或病灶膿液標本，NTM 菌株占21.99%（53/241），皮膚NTM 感染的特點及治療方法的探討，有待進一步研究。血液分枝桿菌培養(yǎng)陽性標本中，NTM 菌株占42.31%（11/26），隨血液播散導致播散性非結(jié)核分枝桿菌病，需引起重視。在漿膜腔積液及腦脊液中，NTM分離率非常低，僅胸水3.43%（11/321）、腹水5.88%（1/17），而腦脊液和心包積液中未見有NTM 生長，NTM 感染所致漿膜腔積液鮮有報道，考慮為NTM毒力較結(jié)核分枝桿菌弱，未侵犯漿膜所致，與筆者既往研究結(jié)論相似［11］。

廣州地區(qū)NTM 菌株分離率及NTM 感染者逐年增多的原因，除醫(yī)患對NTM 認識程度逐漸升高，而基層醫(yī)院對NTM 的檢測手段有限，華南地區(qū)患者逐漸匯集至廣州市胸科醫(yī)院就診有關(guān)。NTM 感染者占比低于NTM 菌株再進行菌種鑒定標本的占比，原因為結(jié)核患者，僅需要一次培養(yǎng)結(jié)果即可明確診斷，而NTM 確診標準中最常用的細菌學標準2 份分開送檢的痰標本NTM 培養(yǎng)陽性并鑒定為同一致病菌［1］，NTM 患者需至少行兩次培養(yǎng)檢測，導致NTM 感染者刪除重復的概率高于結(jié)核患者，NTM 感染者總體占比減少。男性NTM 感染者（1 979例）少于女性NTM 感染者（2 357例），男女比例四年均維持在1∶1.191 水平，與筆者2016年［12］報道的結(jié)果相同，但與其他地區(qū)報道NTM 男性多于女性有所不同［13］，考慮與地域及NTM 菌種差異有關(guān)。平均年齡（52.69±17.05）歲，年齡略呈升高趨勢，NTM 感染者是否呈老齡化趨勢，仍需多年大樣本研究進一步驗證。

NTM 的菌種鑒定是目前研究的重要方向，這對于了解相關(guān)地區(qū)NTM 的菌種分布及疾病防控有重要意義。研究顯示［1］我國常見的NTM 菌種中，臨床相關(guān)性較好的有胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和膿腫分枝桿菌，其次是鳥分枝桿菌。本研究對來自4 336 例患者/年的非結(jié)核分枝桿菌進行了菌種或復合群鑒定，種群分布達16 種，2018-2021年NTM 菌種占比第一、二位均為MAC、龜-膿腫分枝桿菌復合群，均超過35%；第三、四、五位均為堪薩斯分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、戈登分枝桿菌，占比在3.53% ～8.88%之間，四年間菌種構(gòu)成比無明顯變化，MAC 和龜-膿腫分枝桿菌復合群仍為主要致病菌，與筆者既往的研究結(jié)果相同［3，12］，亦與相關(guān)研究結(jié)果一致［7，14-15］。說明廣州地區(qū)近幾年菌種構(gòu)成比無明顯變化。鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復合群群（M. avium complex，MAC）和龜-膿腫分枝桿菌復合群在各年度均為廣州地區(qū)主要NTM 分離菌種。一項研究顯示，非結(jié)核分枝桿菌肺病，治愈率僅36%。因此有部分患者治療效果不佳，長期培養(yǎng)有分枝桿菌生長。2018-2021年間，因跨年度患者有重疊，同一患者僅計算一次培養(yǎng)陽性與菌種/群鑒定結(jié)果，共來自于3 624 例患者。占比前五位的菌種/群，為MAC（36.01%）、龜-膿腫分枝桿菌復合群（34.22%）、堪薩斯分枝桿菌（7.89%）、偶發(fā)分枝桿菌（7.86%）、戈登分枝桿菌（3.78%）。

但博奧分枝桿菌菌種鑒定基因芯片盒檢查試劑盒僅可鑒定包括結(jié)核復合群在內(nèi)的17 個種或群，4年間仍然有121 例（3.34%）的患者未能明確鑒定菌種，給臨床醫(yī)師與患者的診治帶來一定的困難。由于商業(yè)化菌種鑒定試劑盒納入菌種數(shù)量有限，無法完全覆蓋NTM 高流行地區(qū)實際分離到的菌種類型，導致鑒定失敗或錯誤［17］。因此有必要尋求更完善的檢查方法應用于臨床NTM 菌種的鑒定。近年來具有較高的靈敏度及強大的鑒別能力的全基因組測序技術(shù)臨床應用越來越廣泛，尤其是在臨床前階段無法獲得可能感染病原體線索的情況下，但全基因組測序技術(shù)需要相對復雜的操作技術(shù)和專業(yè)設備，目前只能在專業(yè)機構(gòu)完成，并且結(jié)果的判讀需要結(jié)合臨床醫(yī)學與微生物學知識才能做出正確的判斷。

分離出MAC、龜-膿腫分枝桿菌復合群、堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌等致病的可信度較高，環(huán)境中普遍存在且常分離到的菌種，如戈登分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌及土地分枝桿菌的致病率并不高。而培養(yǎng)鑒定為瑪爾摩分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌等除需要考慮污染菌可能，還要考慮本地區(qū)菌種感染的特點、臨床相關(guān)性可能等等。因為作為自然界普遍存在且普遍對消毒劑有抵抗作用的環(huán)境分枝桿菌，可以存在于患者有菌體液中，以及被污染的醫(yī)療器械，支氣管鏡洗滌劑或者實驗室樣本中，因此導致NTM 假陽性較常見，并不是所有分離出NTM 預示活動性NTM 病，臨床、放射、微生物學證據(jù)才能確診NTM 病。NTM 病原菌分布具有地域特異性［18］；故診斷上述菌種的NTM-PD 需更慎重。

有研究報道，膿腫分枝桿菌常與潮濕和高溫環(huán)境有關(guān)，所以在中國南部的流行率較高。本研究龜-膿腫分枝桿菌復合群（34.22%）與劉東鑫的報道一致［19］，明顯高于非南方地區(qū)的報道［18，20］。MAC（36.01%）考慮可能與其在不同地域分布及不同氣候環(huán)境的發(fā)病率不同有關(guān)；本研究還發(fā)現(xiàn)，廣州地區(qū)龜-膿腫與MAC 發(fā)病率差異不大，以及MAC 分離率低于中國東北部地區(qū)，其分離率的高低可能與其在環(huán)境中的廣泛分布，尤其是在飲用水中的分布廣泛有關(guān)。廣州地區(qū)連續(xù)多年以MAC和龜-膿腫分枝桿菌復合群分離率最高，具有一定的地區(qū)特點［19］。因此，對NTM 患者應盡早進行精準的菌種鑒定，以避免患者的治療方案錯誤，造成不必要的經(jīng)濟及心理負擔。

研究表明，NTM 菌種的分布具有地域差異，受緯度、溫度、濕度及患者個人的工作生活條件等因素的影響［20］。世界各地，NTM 菌種分布均有地域特點［21-25］，本文與同屬華南地區(qū)的海南研究結(jié)果MAC 和龜-膿腫分枝桿菌復合群的菌種分布比例相似［26］，也符合龜-膿腫分枝桿菌復合群在南方地區(qū)的分離率高的特點，但MAC 仍然是中國各地域最多見菌種。如胞內(nèi)分枝桿菌在中國不同地區(qū)的分布具有地理多樣性，其流行率隨緯度的降低而逐漸明顯下降；但與廣州市鄰近的深圳市NTM 流行率相比，與本研究結(jié)果不同，2013-2017年深圳市非結(jié)核分枝桿菌流行狀況顯示年NTM 菌株的檢出率僅為4.14%，各年度檢出率差異無統(tǒng)計學意義，并無南方地區(qū)分離率逐年上升的特點；其NTM菌種分布依次為膿腫分枝桿菌（41.64%）、MAC（22.18%）、堪薩斯分枝桿菌（16.04%）、戈登分枝桿菌（8.87%）、偶發(fā)分枝桿菌（6.48%）［27］，與本研究結(jié)果比較菌種的排序和MAC 的檢出率有較大的差別，分析原因：NTM 檢出率與病原菌分布除具有地域特異性，入口流動性相關(guān)，NTM 流行的區(qū)域差異還要歸因于本地區(qū)的感染者的NTM 環(huán)境暴露因素。

本研究NTM 多為21 ～80 歲患者，發(fā)病年齡方面，以老年人居多，發(fā)病年齡主要集中于51～70 歲（占46.36%），在MAC、龜-膿腫分枝桿菌復合群、堪薩斯分枝桿菌的菌種中，20 歲以下及80 歲以上者少見，均少于5%。廣州地區(qū)NTM-PD 好發(fā)年齡仍以老年女性為主，與筆者既往的研究結(jié)果相同［3，12］，與既往本地區(qū)的研究報道相似（55 ～74 歲/47.6%）［4］（55 ～74 歲/41.35%）［7］；與深圳報道差異較大，據(jù)分析：深圳地區(qū)屬于新發(fā)展勞動密集型移民城市，人口構(gòu)成相對年輕化，以年輕勞動力為主，老年人的基數(shù)相對較低，導致年長者的NTM檢測率相應降低［27］。

另外與國內(nèi)其他地區(qū)報道NTM 病中男性多于女性［28］不同，基于全國17 個中心研究顯示，女性、老年人和支氣管擴張或COPD 患者是NTM-PD 的高危人群［4］，與本研究結(jié)果相似。推測NTM 病多見于低血清雌二醇水平的老年婦女［29-30］。因此，性激素可能在女性NTM-PD 易感性中起重要作用。本研究的MAC 患者中：51 ～70 歲占61.09%（413/676）；龜-膿腫分枝桿菌復合群患者：有兩個高峰年齡段，分別為21 ～30 歲和51 ～70 歲共占59.00%（390/661）；堪薩斯分枝桿菌患者，年齡段分布無高峰段；三種NTM 菌種年齡段分布，差異有統(tǒng)計學意義（Z= 156.947，P＜0.001），與國內(nèi)外研究結(jié)果相似［22，31-33］。

綜上所述，廣州地區(qū)NTM 的檢出率處于逐年上升狀態(tài)，多年來菌種分布以龜-膿腫分枝桿菌、鳥-胞內(nèi)分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌為主的穩(wěn)定狀態(tài)，中老年患者易感，女性人群應重點關(guān)注；探討更適用于臨床常規(guī)使用的菌種鑒定技術(shù)是目前提高精確診斷的重要環(huán)節(jié)。