四分子交聯(lián)蛋白-5在母-胎界面表達與不明原因妊娠丟失相關(guān)性

梁營秋 陶鑫麗 劉敏茵 湯海瑜 權(quán)莉 鐘碧玲 高天旸

1石家莊市第四醫(yī)院（河北醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院）（石家莊050000）；廣東省第二人民醫(yī)院2生殖醫(yī)學(xué)中心，3病理科（廣州 510317）

胚胎著床的過程是非常復(fù)雜的，需要母-胎界面多種細(xì)胞分泌的多種激素、生長因子及細(xì)胞因子等協(xié)同作用，共同形成母-胎界面特殊的免疫微環(huán)境，允許作為半同種移植物的胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞對子宮內(nèi)膜恰當(dāng)?shù)淖R別、黏附、侵襲、種植。這個過程與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、種植十分相似，但又有不同，正常滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲行為受到母-胎界面免疫微環(huán)境的精確調(diào)控而具有“節(jié)制性”［1-2］。胚胎發(fā)育異常、母體免疫、感染、解剖、內(nèi)分泌異?；蚰柑ソ缑婷庖呶h(huán)境改變、滋養(yǎng)細(xì)胞增生、侵襲異常等，都可能導(dǎo)致妊娠丟失，從而導(dǎo)致胚胎種植失敗、流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。據(jù)估計，全世界每年有2 300 萬例流產(chǎn)，相當(dāng)于每分鐘就有44 例流產(chǎn)，自然流產(chǎn)的發(fā)生往往給患者及其家庭帶來巨大的傷害和壓力［3］，但目前自然流產(chǎn)的病因和治療還是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題。

四分子交聯(lián)體（Tetraspanins）是一組低分子質(zhì)量的糖蛋白，因其有四個跨膜區(qū)域，又稱四跨膜蛋白超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF）［4］。這個家族蛋白可以通過蛋白間的級聯(lián)效應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能，如細(xì)胞分化、變形、黏附、遷移和蛋白轉(zhuǎn)運，形成新生血管，降解和重排基質(zhì)細(xì)胞，參與多種腫瘤細(xì)胞的侵襲進展［5］。由于胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲蛻膜的行為與腫瘤細(xì)胞的侵襲行為的類似與不同。因此近年來不少學(xué)者研究Tetraspanins在胚胎種植中的作用，發(fā)現(xiàn)CD82、CD63、CD9 等在母-胎界面均有不同程度表達，并參與了滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的調(diào)節(jié)［6-7］。

四分子交聯(lián)體5（Tspan-5）就是四跨膜蛋白超家族中的一員，因其在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的大細(xì)胞外環(huán)中有8 個半胱氨酸（而其他四跨膜蛋白具有4 或6 個半胱氨酸），故又稱為TspanC8［8］。研究發(fā)現(xiàn)Tspan5 激活Notch 信號，增強上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞的肌動蛋白骨架重排，是肝癌細(xì)胞生長、遷移和侵襲所必需的［9-10］。前期研究發(fā)現(xiàn)Tspan-5 與植入過程中滋養(yǎng)細(xì)胞的增生和侵襲特性呈正相關(guān)，且發(fā)現(xiàn)輸卵管妊娠的滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲活性增強［11-12］。因此本文觀察Tspan-5 在母-胎界面的表達情況，并比較不明原因自然流產(chǎn)患者和正常早孕者絨毛、蛻膜中該蛋白的表達水平，以探討其與不明原因妊娠丟失及胚胎種植失敗的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組

1.1.1 觀察組 共37 例，系2018年1月至2020年1月就診于我院的稽留流產(chǎn)患者的清宮標(biāo)本。所有入組患者均行胚胎染色體的檢查。排除：胚胎染色體異常者，母體患有多囊卵巢綜合征、甲狀腺功能異常、宮腔粘連、生殖道畸形及感染等相關(guān)疾病者。

1.1.2 對照組 同期就診于我院，因計劃外妊娠要求人工流產(chǎn)的正常早孕患者，要求年齡孕周孕次等與觀察組相匹配，共41 例。排除：（1）既往有異常孕產(chǎn)史者（如自然流產(chǎn)、死產(chǎn)、死胎等）；（2）本次妊娠期間有先兆流產(chǎn)癥狀和體征者；（3）患有多囊卵巢綜合征、甲狀腺功能異常等內(nèi)分泌疾病者；（4）有自身免疫性疾病或感染者；（5）有泌尿生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)異常的患者。

所有標(biāo)本均經(jīng)過我院病理科醫(yī)師診斷驗證，且患者手術(shù)前3 個月內(nèi)未應(yīng)用激素類藥物治療。

1.1.3 未妊娠組 標(biāo)本為我院病理科同期存檔的育齡期女性刮宮的子宮內(nèi)膜蠟塊，共43 例。分為：（1）月經(jīng)期：10 例，因“子宮內(nèi)膜增厚”在我院刮宮，術(shù)后病理提示“月經(jīng)期子宮內(nèi)膜”。（2）增殖期：21 例，因“子宮內(nèi)膜增厚”在我院刮宮，術(shù)后病理提示“增殖期子宮內(nèi)膜”。（3）分泌期：12 例，因“男方因素”擬在我院行體外受精胚胎移植的患者，胚胎移植前行探宮和宮腔搔刮時所取子宮內(nèi)膜。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）泌尿生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)異常者；（2）既往有異常孕育史者；（3）有自身免疫性疾病或感染者；（4）有多囊卵巢綜合征、甲狀腺功能異常等內(nèi)分泌疾病者。

本研究已獲得廣東省第二人民醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：2018-SZYX-032），且所有患者知情同意。

1.2 主要試劑 一抗：由美國Santa Cruz 公司提供的兔抗人Tspan-5 蛋白多克隆抗體，稀釋濃度為1∶100；山羊血清封閉液由BOSTE 公司提供；二抗：由GT 公司提供的HRP 標(biāo)記聚合物（抗兔、鼠）。

1.3 方法 （1）采用免疫組化法檢測標(biāo)本中Tspan-5 蛋白表達，實驗方法按S-P 法操作。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒要求進行：石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，滴加一抗4 ℃過夜，二抗在室溫下孵育，DAB 顯色，用蘇木素復(fù)染，脫水后透明封片，在光鏡下觀察。以葡萄胎絨毛標(biāo)本作為陽性對照組，空白對照組以PBS 代替一抗。（2）檢測結(jié)果的判定：標(biāo)本染色為黃色或棕黃色處判定為陽性信號，每張照片均采用Image-Pro Plus 軟件測定平均積分光密度值（IOD 值），每張玻片選5 個視野，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計分析用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行，計量資料用（）表示。符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，采用完全隨機設(shè)計的方差分析（One-Way ANOVA）行多組均數(shù)的比較，用Dunnett 法行組間多重比較；若方差不齊，用Welch 法校正，用Dunnett′s T3 法進行組間多重比較。獨立樣本t檢驗（independent-sample T test）的方法進行兩組均數(shù)的比較；若方差不齊時用Satterthwaitet′檢驗。對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用兩獨立樣本的非參數(shù)檢驗（Kruskal WallisHtest）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

2.1.1 觀察組 稽留流產(chǎn)患者（共37 例），孕周為6 ～12周，孕次為1 ～10次，平均孕次（2.92±1.93）次，平均自然流產(chǎn)次數(shù)1.41 次；平均停經(jīng)時間（63.11±11.86）d；患者平均年齡為（27.84±4.94）歲。見表1。

2.1.2 對照組 正常早孕患者（共41 例），孕周為6 ～12周，孕次為1 ～7次，平均孕次（2.56±1.45）次；平均停經(jīng)時間（58.17 ± 11.69）d；患者平均年齡為（27.60±4.42）歲。見表1。

表1 各組患者基本臨床情況比較Tab.1 Comparison of clinical data between the two groups ±s

表1 各組患者基本臨床情況比較Tab.1 Comparison of clinical data between the two groups ±s

組別觀察組對照組t 值P 值例數(shù)37 41年齡（歲）27.83±4.94 27.61±4.42 0.215 0.83停經(jīng)時間（d）63.11±11.86 58.17±11.69 1.85 0.068孕次2.92±1.93 2.56±1.45 0.93 0.355

2.2 人絨毛組織中Tspan-5 的表達

2.2.1 妊娠絨毛組織中Tspan-5 的表達部位 無論是在正常早孕患者絨毛中，還是在自然流產(chǎn)患者絨毛組織中，Tspan-5 均主要定位于具有侵襲作用的絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞（EVCT）和具有增殖活性的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的胞漿和胞膜上，主要起分泌作用的合體滋養(yǎng)細(xì)胞中則是沒有表達的（圖1）。

圖1 在正常早孕和自然流產(chǎn)患者絨毛中Tspan-5 蛋白的表達（SP 法，×200）Fig.1 Expression of Tspan-5 protein in placental villi of patients with normal early pregnancy and those with spontaneous abortion（SP，×200）

2.2.2 人絨毛中Tspan-5 的表達水平 Tspan-5 蛋白在自然流產(chǎn)絨毛中表達水平顯著低于對照組［IOD 均值：（53.22±35.47）vs.（89.04±36.44）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表2。

表2 Tspan-5 蛋白在觀察組和對照組絨毛中表達水平的比較Tab.2 Comparison of the expression levels of Tspan-5 in placental villi between the observation group and the control group ±s

表2 Tspan-5 蛋白在觀察組和對照組絨毛中表達水平的比較Tab.2 Comparison of the expression levels of Tspan-5 in placental villi between the observation group and the control group ±s

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2.3 妊娠蛻膜組織中Tspan-5 的表達

2.3.1 妊娠蛻膜組織中Tspan-5的表達部位 Tspan-5在自然流產(chǎn)和正常早孕患者蛻膜組織中均有表達，表達部位主要是腺上皮細(xì)胞（glandular epithelial cells）和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞（decidual stromal cells，DSCs）的胞質(zhì)和胞膜（圖2）。

圖2 Tspan-5 的表達Fig.2 Expression of Tspan-5

2.3.2 蛻膜/子宮內(nèi)膜中Tspan-5 的表達水平的比較 Tspan-5 在觀察組蛻膜組織中表達水平顯著高于對照組［IOD均值：（184.49±119.69）vs.（93.43±67.10），P＜0.001］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

表3 Tspan-5 在觀察組和對照組蛻膜中表達水平的比較Tab.3 Comparison of the expression levels of Tspan-5 in the decidua between the the observation group and the control group ±s

表3 Tspan-5 在觀察組和對照組蛻膜中表達水平的比較Tab.3 Comparison of the expression levels of Tspan-5 in the decidua between the the observation group and the control group ±s

組別觀察組（自然流產(chǎn)）對照組（正常早孕）例數(shù)37 41 IOD 均值184.49±119.69 93.43±67.10 t 值4.084#P 值＜0.001

2.4 Tspan-5 在未妊娠子宮內(nèi)膜中的表達

2.4.1 Tspan-5 蛋白在未妊娠子宮內(nèi)膜中的表達部位 Tspan-5 主要表達于未妊娠患者的增生期和分泌期的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（endometrial stromal cells，ESC）的胞漿和胞膜，月經(jīng)期子宮內(nèi)膜則未見表達（圖3）。

圖3 未妊娠患者子宮內(nèi)膜中Tspan-5 中的表達（月經(jīng)期、增殖期、分泌期）（SP 法，×200）Fig.3 Expression of Tspan-5 in menstrual，proliferative and secretory phase endometrium（SP×200）

2.4.2 未妊娠子宮內(nèi)膜中Tspan-5 的表達水平Tspan-5 在正常早孕蛻膜中表達水平［IOD 均值：（93.43 ± 67.10）］略高于增殖期［IOD 均值：（75.71±29.87）］和分泌期子宮內(nèi)膜［IOD 均值：（88.56 ±33.24）］，但3 組總體均數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.26，P=0.296，表4）。

表4 Tspan-5 在正常早孕蛻膜和未妊娠女性子宮內(nèi)膜中表達水平的比較Tab.4 Comparison of the expression levels of Tspan-5 in the decidua of women with normal early pregnancy and in the endometrium of non-pregnant women ±s

表4 Tspan-5 在正常早孕蛻膜和未妊娠女性子宮內(nèi)膜中表達水平的比較Tab.4 Comparison of the expression levels of Tspan-5 in the decidua of women with normal early pregnancy and in the endometrium of non-pregnant women ±s

正常早孕蛻膜增殖期內(nèi)膜分泌期內(nèi)膜例數(shù)41 21 12 IOD 均值93.43±67.10 75.71±29.87 88.56±33.24 F 值1.26#P 值0.296

3 討論

正常情況下，滋養(yǎng)細(xì)胞對子宮內(nèi)膜的侵襲具有“節(jié)制性”，胚胎著床過程中滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲受滋養(yǎng)細(xì)胞本身因素和母體蛻膜微環(huán)境的精確的調(diào)控，僅發(fā)生于妊娠早期，且僅浸潤深度一般不超過母體子宮肌層的內(nèi)1/3，胎盤形成后其侵襲行為便自行終止。顯然，滋養(yǎng)細(xì)胞具有類似腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移特性，但滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性的“節(jié)制性”又與腫瘤細(xì)胞顯著不同。目前大量的研究認(rèn)為滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的激素、蛋白酶，蛻膜組織中的蛻膜間質(zhì)細(xì)胞（DSC）和uNK 細(xì)胞等分泌的白介素、促血管生長因子及胎盤局部氧含量變化等，具有抑制或促進滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲遷移的作用，從而參與胚胎種植過程［13］。但是，滋養(yǎng)細(xì)胞從侵襲到停止侵襲的轉(zhuǎn)化調(diào)控機制尚不清楚。研究認(rèn)為自然流產(chǎn)、先兆子癇、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩（FGR）等疾病均與滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤異常有關(guān)［14-15］。

目前，用于評估胚胎活性及滋養(yǎng)細(xì)胞生長狀態(tài)的主要指標(biāo)是母體外周血中β-HCG 的水平，但由于HCG 主要是由不具有增殖能力和侵襲活性的合體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的，并不能很好的反映滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲性和增殖能力。本課題組前期研究已經(jīng)證明Tspan-5 由執(zhí)行侵襲功能的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞（EVCT）和增生活躍的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞（CT）表達，與滋養(yǎng)細(xì)胞的增生和侵襲特性呈正相關(guān)［9］，認(rèn)為Tspan-5 能夠反映滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖狀態(tài)和侵襲特性。本研究發(fā)現(xiàn)自然流產(chǎn)患者絨毛組織中Tspan-5表達水平明顯低于正常早孕者。這提示母-胎界面某些因素可能通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞中Tspan-5 的表達水平，影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲特性，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足可能與自然流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。

蛻膜基質(zhì)細(xì)胞（decidual stromal cell，DSC）是母體蛻膜中的重要細(xì)胞，參與蛻膜營養(yǎng)供應(yīng)，具有很強的內(nèi)分泌功能，能夠分泌多種激素、各種細(xì)胞因子、白細(xì)胞抗原及特定的黏附分子，調(diào)節(jié)蛻膜局部微環(huán)境，在胚胎種植過程中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)Tspan-5 在蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的胞漿、胞膜有特異性表達，與自然流產(chǎn)患者滋養(yǎng)細(xì)胞中Tspan-5表達明顯下降不同，該蛋白在自然流產(chǎn)蛻膜中表達水平反而顯著升高，推測蛻膜基質(zhì)細(xì)胞在胚胎種植過程中可能不僅是“被侵襲”，還具有主動粘附和遷移特性。CRISTINA 和JUBIN 等［16-17］研究發(fā)現(xiàn)Tspan-5 表達于高遷移活性的神經(jīng)嵴細(xì)胞、遷徙的外顆粒細(xì)胞和浦肯野細(xì)胞，認(rèn)為該蛋白在細(xì)胞遷移過程中具有調(diào)控作用，這與本研究結(jié)果不謀而合。

多項研究也從不同途徑證明了蛻膜基質(zhì)細(xì)胞具有收縮和遷移活性，且對胚胎和滋養(yǎng)細(xì)胞具有識別和應(yīng)答。OLIVER 等［18］發(fā)現(xiàn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達運動相關(guān)的波形蛋白（vimentin）和微絲α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin），而這是成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞特有的超微結(jié)構(gòu)，認(rèn)為蛻膜基質(zhì)細(xì)胞可能具有收縮功能。CHARLOTTE 等［19］則用免疫熒光的方法觀察到蛻膜基質(zhì)細(xì)胞向滋養(yǎng)細(xì)胞團所在位置定向移動的現(xiàn)象，提示蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對滋養(yǎng)細(xì)胞可能有特定的識別反應(yīng)。GREWAL等［20-21］將人類蛻膜基質(zhì)細(xì)胞分別與鼠囊胚和人類胚胎共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)人蛻膜基質(zhì)細(xì)胞能夠抑制鼠胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入；而人蛻膜基質(zhì)細(xì)胞有向遠(yuǎn)離人胚胎著床位點的方向遷移的能力，認(rèn)為蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的這種反向活動有利于人類胚胎向子宮內(nèi)膜的侵入，說明人類蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對不同胚胎具有不同的“識別和應(yīng)答”。這些研究結(jié)果支持本研究的推論：胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力可能需要子宮內(nèi)膜的識別和遷移反應(yīng)，且子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移特性的變化可能影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲活性和侵襲程度。

一項在破骨細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Tspan-5 基因敲除可抑制子宮內(nèi)膜中Notch 信號活性，表明Tspan-5 是Notch 信號激活的促進因子［22］。研究認(rèn)為Notch 信號增強可促進蛻膜間質(zhì)細(xì)胞增殖及蛻膜化，有利于胚胎著床［23］。本研究中，分泌期子宮內(nèi)膜中Tspan-5 的表達高于增殖期，而子宮內(nèi)膜的蛻膜化始于分泌期，提示Tspan-5 可能與子宮內(nèi)膜的蛻膜化相關(guān)。

本研究通過檢測Tspan-5 在母-胎界面中的表達情況，探索該蛋白在胚胎種植中的作用及其與妊娠丟失的相關(guān)性，屬于原創(chuàng)性研究，對Tspan-5在胚胎種植中的作用進行了深入的思考和探索，對自然流產(chǎn)的診治提供了新的思路和方向。不足之處在于本研究主要基于組織學(xué)研究結(jié)果，還需要進一步深入的細(xì)胞實驗和動物實驗來探索Tspan-5 在母-胎界面的具體作用及調(diào)控通路。