超聲激勵(lì)bFGF納米微泡靶向治療對(duì)裸鼠瘢痕疙瘩及PTEN/PI3K/Akt通路的影響

陳珂 陳翠蘭 周雪萍 任斯 黃娟

1武漢市第三醫(yī)院超聲科（武漢 430060）；2武漢市肺科醫(yī)院功能科（武漢 430030）

瘢痕疙瘩是一種皮膚纖維化疾病，其形成主要因細(xì)胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生，而導(dǎo)致超出原始傷口邊緣無組織的纖維增殖性膠原反應(yīng)引起［1］。臨床上主要通過手術(shù)切除、放射、冷凍、激光等方式對(duì)瘢痕疙瘩進(jìn)行治療［2］，然而并不能徹底根除瘢痕疙瘩，因此急需開發(fā)一種安全、有效的瘢痕疙瘩治療方法。堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖，刺激血管再生［3］。研究表明bFGF 能夠加速創(chuàng)面愈合，減輕瘢痕，在瘢痕疙瘩治療中具有較好的應(yīng)用前景［4-5］。而納米粒是一種新型藥物載體，不僅能夠增加藥物穩(wěn)定性，還能夠穿透組織，實(shí)現(xiàn)藥物靶部位的緩釋［6］。超聲微泡是一種聲學(xué)敏感空心微泡，低頻超聲能誘導(dǎo)微泡空化效應(yīng)，增加細(xì)胞膜通透性，實(shí)現(xiàn)藥物的緩釋，還可以實(shí)現(xiàn)納米粒在靶組織或靶器官的靶向釋藥［7］。因此，納米超聲微泡可作為bFGF 基因的靶向系統(tǒng)，充分發(fā)揮bFGF 在臨床治療中的作用。研究表明第10 號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）/3-磷酸肌醇激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路與瘢痕疙瘩的發(fā)生有關(guān)［8］。但是，闡明超聲激勵(lì)bFGF 納米微泡對(duì)瘢痕疙瘩的治療作用鮮有報(bào)道，其對(duì)PTEN/PI3K/Akt 通路的影響?；诖?，本研究首次通過構(gòu)建裸鼠瘢痕疙瘩模型，并進(jìn)行超聲激勵(lì)bFGF納米微泡靶向治療，以期為瘢痕疙瘩的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性BALB/c裸鼠72只（16 ～18 g，5 ～6 周齡），購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2018-0002。裸鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好的SPF 環(huán)境（溫度22 ～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%），適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2021-0302）。

1.2 藥品及試劑 人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（human keloid fibroblasts，HKF），bFGF 納米微泡，均為實(shí)驗(yàn)室前期制備；胎牛血清，胰蛋白酶，DMEM 培養(yǎng)液，美國HyClone 公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒，武漢云克隆生物科技有限公司；兔抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（collagenⅠ）、PTEN、PI3K、Akt、GAPDH 一抗，山羊抗兔IgG H&L（ab150077），英國abcam 公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（C0105M）、一步法原位末端標(biāo)記（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（C1086），上海碧云天生物技術(shù)有限公司。DM2500 熒光顯微鏡，德國LEICA 公 司；Multiskan FC酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher 公司；Gel-Doc 凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 凍存的HKF 常規(guī)復(fù)蘇，培養(yǎng)于含10 %胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，進(jìn)行傳代。

1.4 細(xì)胞處理與接種 收集上述對(duì)數(shù)生長期的HKF，PBS 沖洗，胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液，離心棄上清，加DMEM 培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，離心，棄上清，加Matrigel 膠，調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0 × 107個(gè)/mL，于72 只裸鼠右側(cè)腋窩皮下接種，每只接種0.1 mL。隔日觀察裸鼠瘢痕疙瘩生長情況，記錄裸鼠瘢痕疙瘩體積和體質(zhì)量的變化。

1.5 動(dòng)物分組及給藥 裸鼠瘢痕疙瘩大小約為100 ～200 mm3時(shí)給藥，將裸鼠隨機(jī)分為6 組，對(duì)照組，bFGF 水溶液組，bFGF 納米微泡組，超聲空化組，超聲+bFGF 水溶液組，超聲+bFGF 納米微泡組，每組12 只。bFGF 水溶液、bFGF 納米微泡均為本實(shí)驗(yàn)室自行配置。bFGF 水溶液組、超聲+bFGF水溶液組，給予裸鼠1 mL 含0.2 mg bFGF 生理鹽水注射，超聲空化組注射1 mL 脂質(zhì)微泡溶液，bFGF納米微泡組、超聲+bFGF 納米微泡組，給予1 mL 含0.2 mg bFGF 的納米微泡溶液注射。注射方式為瘢痕疙瘩內(nèi)局部注射，隔日給藥，共10 次。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期摸索實(shí)驗(yàn)確定超聲注射條件，超聲空化組、超聲+bFGF 微泡組、超聲+bFGF 納米微泡組給藥后即刻在瘢痕疙瘩皮膚表面涂抹超聲耦合劑并進(jìn)行超聲照射（頻率3 MHz，功率2 W/cm2，刺激周期20%，超聲60 s）。隔日觀察裸鼠生存狀態(tài)和瘢痕疙瘩生長狀況，記錄瘢痕疙瘩體積和重量，繪制瘢痕疙瘩體積增長曲線。

1.6 ELISA 法檢測裸鼠血清炎癥因子水平 末次給藥結(jié)束后次日，腹主動(dòng)脈取血1 mL，ELISA 法檢測裸鼠血清TNF-α、TGF-β 水平，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.7 瘢痕疙瘩組織學(xué)和細(xì)胞凋亡觀察 取血結(jié)束，尾椎靜脈注射法處死裸鼠，剝離瘢痕疙瘩，每組隨機(jī)選取6 只裸鼠瘢痕疙瘩，4 %中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE 染色，顯微鏡下觀察裸鼠瘢痕疙瘩組織形態(tài)；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測瘢痕疙瘩組織中細(xì)胞凋亡情況，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，隨機(jī)選取5 視野，熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（綠色熒光標(biāo)記）數(shù)目。

1.8 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測裸鼠瘢痕疙瘩中蛋白表達(dá) 取剩余6 只裸鼠瘢痕疙瘩組織，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 蛋白試劑盒檢測蛋白濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。之后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入兔抗鼠caspase-3、α-SMA、collagen I、PTEN、PI3K、Akt、GAPDH 一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗稀釋液（1∶1 000 稀釋），室溫孵育1 h，TBST 洗膜。蛋白凝膠成像系統(tǒng)成像，Image Pro Plus 6.0 圖像軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 bFGF 納米微泡的理化性質(zhì)測定 bFGF 納米粒呈標(biāo)準(zhǔn)的圓球形，平均粒徑為（126.54±1.45）nm，粒徑的多分散指數(shù)（Polydispersion index，PI）為0.087，說明其分布均勻；Zeta 電位值的絕對(duì)值為15.78 mV，說明其穩(wěn)定性好、不容易聚集。

2.2 各組裸鼠瘢痕疙瘩體積和重量比較 各組裸鼠均生活狀態(tài)良好，活動(dòng)、飲食、大小便正常，實(shí)驗(yàn)過程中均存活，可初步評(píng)估，bFGF 納米微泡未對(duì)裸鼠的重要器官產(chǎn)生病理性危害，較為安全。對(duì)照組和超聲空化組瘢痕疙瘩體積隨時(shí)間的延長不斷增大（P＜0.05），bFGF 水溶液組和bFGF 納米微泡組瘢痕疙瘩體積隨時(shí)間的延長變化不大（P＞0.05），超聲+bFGF 水溶液組、超聲+bFGF 納米微泡組瘢痕疙瘩體積隨時(shí)間的延長不斷縮?。≒＜0.05，圖1）。治療結(jié)束后，與對(duì)照組比較，超聲空化組裸鼠瘢痕疙瘩體積和重量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），各bFGF 處理組裸鼠瘢痕疙瘩體積和重量均顯著降低（P＜0.05）；與bFGF 水溶液組、bFGF 納米微泡組比較，超聲+bFGF 水溶液組、超聲+bFGF 納米微泡組裸鼠瘢痕疙瘩體積和重量均顯著降低，超聲+bFGF 納米微泡組裸鼠瘢痕疙瘩體積和重量低于超聲+bFGF 水溶液組（P＜0.05，圖2）。

圖1 各組裸鼠瘢痕疙瘩生長曲線圖Fig.1 The growth curve of keloids in nude mice in each group

圖2 各組裸鼠瘢痕疙瘩體積和重量比較Fig.2 Comparison of the volume and weight of keloids in each group of nude mice

2.3 各組裸鼠瘢痕疙瘩組織形態(tài)對(duì)比 HE 染色結(jié)果表明，對(duì)照組、超聲空化組裸鼠瘢痕疙瘩組織中，膠原結(jié)構(gòu)未見明顯改變；bFGF 水溶液組、bFGF納米微泡組裸鼠瘢痕疙瘩組織表皮萎縮明顯，膠原結(jié)構(gòu)松散；超聲+bFGF 水溶液組、超聲+bFGF 納米微泡組表皮僅有少部分殘留，膠原結(jié)構(gòu)破壞，可見有較多血管形成（圖3）。

圖3 HE 染色檢測裸鼠瘢痕疙瘩組織形態(tài)（×200）Fig.3 HE staining of keloid tissue morphology in nude mice（×200）

2.4 各組裸鼠瘢痕疙瘩組織細(xì)胞凋亡比較 與對(duì)照組比較，超聲空化組裸鼠瘢痕疙瘩細(xì)胞凋亡數(shù)目、蛋白caspase-3 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各bFGF 處理組裸鼠瘢痕疙瘩細(xì)胞凋亡數(shù)目、蛋白caspase-3 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與bFGF 水溶液組、bFGF 納米微泡組比較，超聲+bFGF 水溶液組、超聲+bFGF 納米微泡組細(xì)胞凋亡數(shù)目、蛋白caspase-3 表達(dá)均顯著升高，且超聲+bFGF 納米微泡組細(xì)胞凋亡數(shù)目、蛋白caspase-3 表達(dá)顯著高于超聲+bFGF 水溶液組（P＜0.05，圖4、5）。

圖4 各組裸鼠瘢痕疙瘩組織細(xì)胞凋亡比較Fig.4 Comparison of cell apoptosis in keloid tissue of nude mice in each group

2.5 各組裸鼠血清中炎癥因子TNF-α、TGF-β 水平比較 與對(duì)照組比較，超聲空化組裸鼠血清炎癥因子TNF-α、TGF-β 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各bFGF 處理組裸鼠血清炎癥因子TNF-α、TGF-β 水平顯著降低（P＜0.05）；與bFGF水溶液組、bFGF 納米微泡組比較，超聲+bFGF 水溶液組、超聲+bFGF 納米微泡組血清TNF-α、TGFβ 水平均顯著降低，且超聲+bFGF 納米微泡組血清TNF-α、TGF-β 水平顯著低于超聲+bFGF 水溶液組（P＜0.05，圖6）。

圖5 各組裸鼠瘢痕疙瘩組織caspase-3 表達(dá)情況Fig.5 The expression of caspase-3 in keloid tissues of nude mice in each group

圖6 各組裸鼠血清中TNF-α、TGF-β 水平比較Fig.6 Comparison of serum TNF-α and TGF-β levels in nude mice in each group

2.6 各組裸鼠瘢痕疙瘩組織中α-SMA、collagen I水平比較 與對(duì)照組比較，超聲空化組裸鼠瘢痕疙瘩組織中蛋白α-SMA、collagen I 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各bFGF 處理組裸鼠瘢痕疙瘩組織中蛋白α-SMA、collagen I 水平顯著降低（P＜0.05）；與bFGF 水溶液組、bFGF 納米微泡組比較，超聲+bFGF 水溶液組、超聲+bFGF 納米微泡組蛋白α-SMA、collagen I 水平均顯著降低，且超聲+bFGF 納米微泡組蛋白α-SMA、collagen I 水平低于bFGF 水溶液組（P＜0.05，圖7、8）。

圖7 各組瘢痕疙瘩組織中α-SMA、collagenⅠ水平比較Fig.7 Comparison of α-SMA and collagen I levels in keloid tissues of each group

圖8 Western blot檢測各組瘢痕疙瘩組織中蛋白α-SMA、collagenⅠ表達(dá)Fig.8 Western blot detection of protein α-SMA and collagenⅠexpression in keloid tissues of each group

2.7 各組裸鼠瘢痕疙瘩組織中PTEN/PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，超聲空化組裸鼠瘢痕疙瘩組織中蛋白PTEN、PI3K、p-Akt 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各bFGF 處理組裸鼠瘢痕疙瘩組織中蛋白PTEN 水平顯著升高，PI3K、p-Akt 水平顯著降低（P＜0.05）；與bFGF 水溶液組、bFGF 納米微泡組比較，超聲+bFGF 水溶液組、超聲+bFGF 納米微泡組蛋白PTEN 水平升高，PI3K、p-Akt 水平均顯著降低（P＜0.05）；與超聲+bFGF 水溶液組比較，超聲+bFGF 納米微泡組蛋白PTEN水平升高，PI3K、p-Akt 水平顯著降低（P＜0.05，圖9、10）。

圖9 各組裸鼠瘢痕疙瘩組織中PTEN/PI3K/Akt 通路蛋白表達(dá)比較Fig.9 Comparison of PTEN/PI3K/Akt pathway protein expression in keloid tissues of nude mice in each group

圖10 Western blot檢測裸鼠瘢痕疙瘩組織中PTEN/PI3K/Akt 通路蛋白表達(dá)Fig.10 Western blot detection of PTEN/PI3K/Akt pathway protein expression in keloid tissue of nude mice

3 討論

瘢痕疙瘩主要表現(xiàn)為瘢痕過度增長超出原損傷界限，向周圍正常皮膚組織浸潤，被認(rèn)為是一種良性皮膚腫瘤［9］。瘢痕疙瘩主要組織學(xué)特征為成纖維細(xì)胞的持續(xù)性異常增殖及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過度沉淀，膠原沉積是正常傷口愈合的必要部分，然而過度沉積會(huì)導(dǎo)致瘢痕疙瘩的形成，膠原合成和降解的不平衡是導(dǎo)致疤痕疙瘩形成的主要原因之一［10］。雖然瘢痕疙瘩不是惡性腫瘤，但是其過度生長而引起的疼痛和高復(fù)發(fā)率值得關(guān)注［11］。抑制成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管新生是瘢痕疙瘩治療的主要機(jī)制，而bFGF 是一種重要的血管形成因子，可促進(jìn)血管生成［12］。赫佳等［13］研究發(fā)現(xiàn)bFGF 對(duì)成纖維細(xì)胞的生長趨勢和增殖活性有明顯的促進(jìn)作用，這在創(chuàng)傷愈合的早期起積極作用，但過量的bFGF 會(huì)導(dǎo)致病理性瘢痕的生成。納米粒廣泛應(yīng)用于藥物遞送系統(tǒng)，其不僅能夠遞送蛋白、核酸、多肽等多種類型藥物，還可穿透組織實(shí)現(xiàn)作用部位藥物緩釋，使藥物作用時(shí)間更加持久，增加組織細(xì)胞對(duì)藥物的攝取。低頻超聲結(jié)合微泡靶向技術(shù)一方面能夠?qū)崿F(xiàn)納米粒的靶向施藥，另一方面還能夠促進(jìn)靶組織細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，從而增加藥物療效［7］。本研究結(jié)果表明bFGF 水溶液、bFGF 納米微泡能夠抑制裸鼠瘢痕疙瘩的生長，提示bFGF 可能有助于瘢痕疙瘩的治療。SHI 等［4］研究表明bFGF 治療能夠降低膠原密度、α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的凋亡，而不影響正常的皮膚成纖維細(xì)胞。TNF-α 能夠?qū)魏思?xì)胞和T 細(xì)胞募集到損傷部位，是一種重要的促炎因子。TGF-β 能夠刺激ECM 的合成和沉淀，抑制膠原酶的產(chǎn)生，是成纖維細(xì)胞的趨化因子［14］。α-SMA是成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性產(chǎn)物，Ⅰ型膠原蛋白在創(chuàng)口愈合中具有重要作用。本研究結(jié)果表明，bFGF 水溶液、bFGF 納米微泡能夠抑制裸鼠炎癥反應(yīng)的發(fā)生，抑制膠原的過度沉積，促進(jìn)瘢痕疙瘩細(xì)胞凋亡，提示bFGF 可能通過抑制瘢痕疙瘩膠原沉積，促進(jìn)瘢痕疙瘩細(xì)胞的凋亡，從而抑制瘢痕疙瘩的進(jìn)展。

微泡既可以作為藥物載體，也可以作為基因載體［15］。超聲作用于靶向給藥部位，不僅能夠擊碎微泡釋放基因或藥物，還通過增加細(xì)胞膜的通透性，增加藥物的遞送效率［16-17］。SHENG 等［18］研究表明超聲靶向bFGF 脂質(zhì)體微泡能夠抑制糖尿病腎病大鼠模型的炎癥損傷和腎小管細(xì)胞凋亡，可能有助于早期糖尿病腎病的治療。王夢蛟等［19］研究結(jié)果表明N-（4-羥基苯基）維甲酰胺（4-HRP）脂質(zhì)微泡聯(lián)合超聲抑制成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的凋亡，且效果優(yōu)于4-HRP 溶液。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲后，bFGF 水溶液和bFGF 納米微泡組對(duì)裸鼠瘢痕疙瘩生長和纖維化的抑制及對(duì)瘢痕疙瘩細(xì)胞的凋亡顯著高于bFGF 水溶液組和bFGF 納米微泡組，提示超聲空化有助于bFGF 的釋放，抑制瘢痕疙瘩的生長，抑制膠原沉積，可能是瘢痕疙瘩治療的有效方法。

PTEN 是一個(gè)腫瘤抑制基因，可通過負(fù)調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路，抑制細(xì)胞的生長和存活［20］。研究表明TGF-β 通過激活PI3K/Akt 信號(hào)通路促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、分化和侵襲［21］。TANG 等［8］研究表明成纖維細(xì)胞中PTEN 蛋白表達(dá)顯著低于正常皮膚成纖維細(xì)胞，而PI3K、p-Akt 的表達(dá)顯著升高。田小雨等［22］研究表明抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的凋亡，抑制瘢痕疙瘩增生。本研究結(jié)果表明bFGF 處理組PTEN 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，而PI3K、p-Akt 表達(dá)降低，且超聲+bFGF 處理組進(jìn)一步增加PTEN 蛋白水平，抑制蛋白PI3K、p-Akt 的表達(dá)，提示超聲+bFGF 納米微泡促進(jìn)PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活，可能是超聲+bFGF 納米微泡在瘢痕疙瘩治療的潛在機(jī)制，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，bFGF 處理能夠抑制裸鼠瘢痕疙瘩的生長，超聲激勵(lì)bFGF 納米微泡能夠增強(qiáng)bFGF對(duì)瘢痕疙瘩生長的抑制，可能與PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活有關(guān)。然而本研究尚存在不足之處：未使用PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)通路抑制劑進(jìn)行回復(fù)試驗(yàn)，同時(shí)超聲激勵(lì)bFGF 納米微泡對(duì)裸鼠瘢痕疙瘩生長的抑制作用可能還涉及其他信號(hào)通路，且后續(xù)仍需進(jìn)行大樣本，多中心的隨機(jī)化臨床研究驗(yàn)，繼續(xù)深入研究。