環(huán)狀RNA circAAS1對(duì)人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及遷移的影響

高麗娜 董燕 何曉春 張玉芳 劉小玲 郝曼 張莉 劉小暉

甘肅省婦幼保健院產(chǎn)二科（蘭州 730050）

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種妊娠期特有的進(jìn)行性疾病，嚴(yán)重影響妊娠女性及胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育［1］，目前唯一有效的治療方法是終止妊娠［2］，因此，研究子癇前期發(fā)生的潛在機(jī)制對(duì)進(jìn)一步有效防治子癇前期具有重要意義。雖然子癇前期的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚［3］，但滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移不足引起胎盤發(fā)育缺陷是子癇前期發(fā)病的主要原因［4］。然而，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移在子癇前期進(jìn)展中的基本過程有待闡明。環(huán)狀RNA（circRNA）是由共價(jià)閉合環(huán)路形成的一種新的非編碼RNA［5］，參與細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、侵襲遷移等一系列細(xì)胞生理和病理活動(dòng)［6］。研究表明，circRNA 在子癇前期母胎界面失調(diào)［7］，這些失調(diào)的circRNA 與子癇前期的發(fā)生發(fā)展有著復(fù)雜的相互作用［8］。最近，競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（competitive endogenous RNAs，ceRNAs）假說提出，circRNA 可以通過microRNAs（miRNAs）反應(yīng)元件（MREs）調(diào)控miRNA 水平，參與子癇前期的發(fā)生［9］。此外，miRNA在子癇前期中表達(dá)異常，是子癇前期的潛在防治靶點(diǎn)［10］。其中，miR-15a-5p參與許多癌癥的發(fā)生發(fā)展，但在子癇前期中的研究鮮為少見。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)circAAS1 在子癇前期中的差異表達(dá)，通過生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)與miR-15a-5p 的結(jié)合位點(diǎn)，但其生物學(xué)功能和潛在機(jī)制尚不清楚。本研究通過構(gòu)建干擾和過表達(dá)circAAS1 滋養(yǎng)細(xì)胞系，探討circAAS1 對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能行為影響，并分析其在子癇前期中的臨床價(jià)值，為子癇前期的早期診斷及治療提供更多的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究經(jīng)甘肅省婦幼保健院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（2022GSFY 倫審［21］號(hào)）。選取2020年5月至2021年5月在甘肅省婦幼保健院住院患者納入研究。PE 組為子癇前期孕婦30 例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參見《婦產(chǎn)科學(xué)（第九版）》教材；對(duì)照組（PC 組）為同期妊娠單胎孕婦30 例。排除標(biāo)準(zhǔn)：吸煙、多胎妊娠、慢性高血壓、慢性腎炎、自身免疫性疾病、糖尿病、心臟病、血栓性疾病、HELLP 綜合征、胎兒畸形等。所有參與者在甘肅省婦幼保健院簽署知情同意書。兩組孕婦年齡、孕周方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），收縮壓、舒張壓及尿蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between PC and PE groups ±s

表1 兩組臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between PC and PE groups ±s

年齡（歲）孕周（周）收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）尿蛋白（24 h/g）PC 組28.80±1.94 36.60±0.67 118.60±1.18 75.20±2.84 0.13±0.16 PE 組30.50±4.86 36.37±2.63 146.50±3.59 99.15±2.34 2.10±0.25 P 值0.123 3 0.975 1＜0.001＜0.001＜0.001

1.2 主要試劑 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞（HTR8/SVneo）購(gòu)于上海蓋寧公司；胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)于日本Takara 公司；lip2000 購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司；青鏈霉素、胰蛋白酶消化液購(gòu)于北京索萊寶公司；Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD 公司；Transwell 小室購(gòu)于美國(guó)Corning 公司；總RNA 提取試劑盒購(gòu)于北京天根公司；circAAS1 和U6 引物由廣州銳博生物科技公司合成，GAPDH 引物由上海生工公司合成，circAAS1 干擾片段及過表達(dá)質(zhì)粒由上海吉瑪公司構(gòu)建。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 在適當(dāng)?shù)臈l件下（37 ℃、5% CO2）培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行傳代，按說明書添加助轉(zhuǎn)試劑，將細(xì)胞分5 組：control組（空白組）、si-NC 組（干擾對(duì)照組）、si-circAAS1組（干擾circAAS1 組）、OE-NC 組（過表達(dá)對(duì)照組）和OE-circAAS1 組（過表達(dá)circAAS1 組）。

1.4 Transwell 實(shí)驗(yàn) 提前將在-20 ℃冰箱保存的Matrigel基質(zhì)膠放4 ℃溶化，Transwell小室加Matrigel基質(zhì)膠（避免氣泡），放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱凝固（遷移實(shí)驗(yàn)不用加）。用純培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按照2 × 104個(gè)細(xì)胞數(shù)加入上室，對(duì)應(yīng)的下室加入800 μL 含15%血清培養(yǎng)基，孵育48 h 后，用4%多聚甲醛固定下室細(xì)胞，棉簽將上室細(xì)胞擦去后，結(jié)晶紫染色10 min，用顯微鏡拍照。染色細(xì)胞使用Image-J 來計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞至70%～90%加入轉(zhuǎn)染試劑，4 ～6 h換液后孵育48 h，用1 000 μL無菌槍頭劃痕，無血清培養(yǎng)基沖洗后用顯微鏡拍照，記錄為0 h，孵育24 h后拍照記錄為24 h，傷口愈合率計(jì)算公式：（初始面積-最終面積）/初始面積×100%。

1.6 Real-time PCR 檢測(cè) 按照總RNA 提取試劑標(biāo)準(zhǔn)程序，從胎盤樣本和滋養(yǎng)細(xì)胞中制備總RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后使用qRT-PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。GAPDH，上游，5′-TGGCAGGTAGGCGGTTGTGTAGA-3′；下游，5′-ATGGCATCGTGCCTGGTCATAT-3′；U6 上游，5′-GCATATATAACCACGAGTTCAGGAAT-3′；下游，5′-CGCGGAGTTCACTCGCTAGTGCAT-3′；miR-15a-5p 上游，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-15a-5p，下游，5′-CGGCTAGCAGCACATAATGG-3′；circAAS1，上游，5′-AACCAAGCGCCTCCA-3′；下游，5′-TTGGAAGGCGGAGGT-3′。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。circAAS1與PE 臨床指征的關(guān)系采用pearson 相關(guān)性分析，兩組間均數(shù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circAAS1 在子癇前期胎盤組織中的表達(dá)qRT-PCR 檢測(cè)顯示，與PC 組比較，PE 組胎盤樣本中circAAS1 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），提示circAAS1 調(diào)控異?？赡芘c子癇前期有關(guān)，見圖1。

圖1 PC 組和PE 組胎盤中circAAS1 的表達(dá)水平Fig.1 Expression of circAAS1 in placenta of PC and PE

2.2 circAAS1 的表達(dá)水平與臨床指征的相關(guān) 在PE 中，circAAS1 的表達(dá)水平與收縮壓（r= 0.530，P= 0.002）、舒張壓（r= 0.464，P=0.009）均有顯著正相關(guān)，進(jìn)一步提示circAAS1 的表達(dá)水平可能與子癇前期病情進(jìn)展有關(guān)，可作為子癇前期的診斷標(biāo)志物。見圖2。

圖2 PE 胎盤組織中circAAS1 的表達(dá)與臨床指征的關(guān)系Fig.2 Relationship between expression of circAAS1 and clinical features in preeclampsia placenta tissues

2.3 circAAS1 干擾及過表達(dá)自身驗(yàn)證 檢測(cè)過表達(dá)及干擾circAAS1 的效率，OE-circAAS1 組中circAAS1 表達(dá)高于OE-NC 組（P＜0.05），而si-circAAS1組中的circAAS1表達(dá)低于si-NC 組（P＜0.01），提示過表達(dá)circAAS1 及干擾circAAS1 細(xì)胞系構(gòu)建成功。見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染circAAS1 過表達(dá)質(zhì)粒和干擾片段后circAAS1 的表達(dá)Fig.3 Expression of circAAS1 after transfection of circAAS1 overexpression and interference

2.4 circAAS1對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力影響 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與OE-NC 組比較，OE-circAAS1組穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）；相反，與si-NC 組比較，si-circAAS1 組穿過基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05），提示circAAS1 過表達(dá)可阻止滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力，而干擾circAAS1 后則相反。見圖4。

圖4 circAAS1 對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲影響Fig.4 Effects of circAAS1 on trophoblast invasion

2.5 circAAS1對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移能力影響 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與OE-NC組比較，OE-circAAS1組穿過膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）；相反，與si-NC 組比較，si-circAAS1 組穿過膜的細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05）；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：OE-circAAS1 組的滋養(yǎng)細(xì)胞橫向遷移率明顯降低（P＜0.05），提示過表達(dá)circAAS1 可引起滋養(yǎng)細(xì)胞縱向及橫向遷移能力下降，而干擾circAAS1 后則相反。見圖5。

圖5 circAAS1 對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移影響Fig.5 Effect of circAAS1 on trophoblast cells migration

2.6 circAAS1 在滋養(yǎng)細(xì)胞的定位及生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-15a-5p是circAAS1可能作用的靶基因 通過滋養(yǎng)細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)circAAS1 在滋養(yǎng)細(xì)胞中主要定位于胞質(zhì)，提示circAAS1 在滋養(yǎng)細(xì)胞中可能在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮調(diào)控機(jī)制。通過StarBase 軟件分析發(fā)現(xiàn)，miR-15a-5p 具有circAAS1 的結(jié)合位點(diǎn)，提示miR-15a-5p 可能是circAAS1 的下游靶基因，見圖6。

圖6 circAAS1 在滋養(yǎng)細(xì)胞中的定位及與miR-15a-5p 的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)Fig.6 Localization of circAAS1 in trophoblast cells and predicted binding site of circAAS1 and miR-15a-5p

2.7 miR-15a-5p 在PE 胎盤組織中的表達(dá) qRTPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，PE 組miR-15a-5p 的表達(dá)水平顯著低于PC 組（P＜0.01），提示circAAS1 可能對(duì)miR-15a-5p 有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，見圖7。

圖7 miR-15a-5p 在PC 和PE 胎盤組織中的表達(dá)水平Fig.7 Expression of miR-15a-5p in placental tissues of PC and PE

2.8 circAAS1 對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞中miR-15a-5p 表達(dá)的影響 同時(shí)，qRT-PCR 結(jié)果顯示，OE-circAAS1 組過表達(dá)circAAS1 后，miR-15a-5p 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；相反，干擾circAAS1 后則增加miR-15a-5p 的表達(dá)（P＜0.05），提示circAAS1 可能與miR-15a-5p 結(jié)合，見圖8。

圖8 circAAS1 對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞中miR-15a-5p 表達(dá)的影響Fig.8 Effect of circAAS1 on the expression of miR-15a-5p in trophoblast cells

3 討論

子癇前期是一種胎盤疾?。?1］，其主要由胎盤功能不全引起。由于病因及機(jī)制尚不清楚，明顯降低了該病的防治率，目前只有少數(shù)有效的藥物能控制子癇前期的進(jìn)展［12］。因此，最近的研究一直致力于識(shí)別調(diào)控分子，如非編碼RNA，許多研究已證實(shí)其參與子癇前期的發(fā)展及其調(diào)控分子機(jī)制［13］。希望通過深入研究能找到特異性分子可作為子癇前期的無創(chuàng)診斷、預(yù)后生物標(biāo)記物及防治靶點(diǎn)。circRNA 是一類在物種間表現(xiàn)出高度穩(wěn)定性和保守性的非編碼RNA［14］，circRNA 與子癇前期的發(fā)展有關(guān)［15］，目前正在作為子癇前期治療的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)進(jìn)行研究［16-18］。例如，GAI 等［19］發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0007121 是一種早期子癇前期的潛在標(biāo)志物，其在子癇前期胎盤中下調(diào)，并且通過影響上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）正向調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移。ZHOU 等［20］在子癇前期的胎盤和血漿樣本中均顯示circPAPPA 表達(dá)下調(diào)，circPAPPA的下調(diào)導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和增殖減少。然而，目前關(guān)于circAAS1 在子癇前期中的作用的研究尚未報(bào)道。因此，本研究主要是為了明確circAAS1 在子癇前期發(fā)展中的作用。本研究顯示circAAS1 在子癇前期胎盤組織中高表達(dá)，并與子癇前期患者的收縮壓及舒張壓呈正相關(guān)，這表明circAAS1 可能是一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物。為了確定circAAS1 是否通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移參與子癇前期，筆者將HTR8/SVneo 細(xì)胞作為基質(zhì)細(xì)胞，通過Transwell 和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circAAS1 對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移的影響，過表達(dá)circAAS1 可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移，然而，干擾circAAS1 后可增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移，提示circAAS1 可能參與了子癇前期的發(fā)生和發(fā)展，并隨著子癇前期病情進(jìn)展而表達(dá)增加，circAAS1 可能成為子癇前期早期診斷的標(biāo)記物和防治靶點(diǎn)。

在人類疾病中，circRNAs 可以通過海綿吸附miRNA，調(diào)節(jié)親本基因等發(fā)揮重要作用。在子癇前期中，circRNA 的生物學(xué)作用是通過介導(dǎo)miRNA/mRNA 軸來實(shí)現(xiàn)的［16］。例如，circ_0111277 作為ceRNA，靶向miR-424-5p/NFAT5 軸調(diào)控子癇前期滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲［21］。hsa_circ_0026552上調(diào)通過miR-331-3p/TG-βR1 抑制子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［18］。本研究通過胞漿胞核定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，circAAS1 主要位于滋養(yǎng)細(xì)胞的胞漿中，故通過軟件預(yù)測(cè)了circAAS1 的靶miRNA為miR-15a-5p，miR-15a-5p 已被證明是一種腫瘤抑制因子［22］，其通過抑制CXCL17 轉(zhuǎn)錄抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力［23］。LIU 等［24］研究miR-15a-5p 在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的作用，發(fā)現(xiàn)miR-15a-5p 可通過調(diào)節(jié)AEBP1 顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展。以上研究均表明miR-15a-5p 對(duì)細(xì)胞表型有顯著影響，包括抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等。因此，在子癇前期中，miR-15a-5p 可能促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的再生，抑制子癇前期的發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-15a-5p 在子癇前期胎盤中低表達(dá)，結(jié)合上述的研究結(jié)果，提示miR-15a-5p 可能是抑制子癇前期發(fā)展的靶點(diǎn)，為了進(jìn)一步證實(shí)circAAS1 在滋養(yǎng)細(xì)胞中對(duì)miR-15a-5p 表達(dá)的影響，本課題組構(gòu)建了過表達(dá)和干擾circAAS1 細(xì)胞系，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circAAS1 可以明顯下調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞中miR-15a-5p的表達(dá)，而抑制circAAS1 則增加miR-15a-5p 的表達(dá)，以上結(jié)果表明circAAS1 可以與miR-15a-5p 相互作用來調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞功能行為。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)circAAS1 直接靶向miR-15a-5p 抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移能力，其可能是子癇前期診斷和治療的有效靶點(diǎn)。然而，本研究也存在一些局限性。首先，miR-15a-5p 的下游靶基因尚不清楚；其次，臨床樣本較少。因此，本課題組將繼續(xù)增加臨床樣本量，探究miR-15a-5p 的下游靶基因，更進(jìn)一步明確circAAS1 在子癇前期進(jìn)展中的分子機(jī)制，將為進(jìn)一步探索circRNA在子癇前期研究領(lǐng)域奠定良好的基礎(chǔ)。