E2F轉(zhuǎn)錄因子7在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及生物學(xué)作用

范會利 趙如華 張赫 林旭 薛剛 吳靖芳

河北北方學(xué)院1形態(tài)學(xué)實驗室，2耳鼻咽喉頭頸外科教研室（河北張家口 075000）

甲狀腺乳頭狀癌（papillarythyroidcarcinoma，PTC）是甲狀腺癌最常見的病理類型。近30年甲狀腺癌發(fā)病率增長迅速，與PTC 發(fā)病率增加密切相關(guān)［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌可從緩慢進展的惰性腫瘤發(fā)展為高度侵襲性腫瘤［3］。通過切除術(shù)和放射性碘等治療PTC 達到一定的治療效果，但是未能有效降低它的復(fù)發(fā)率，PTC 的發(fā)病機制尚未闡明［4-5］。因此，迫切需要深入研究PTC 發(fā)生發(fā)展的分子機制，降低PTC 復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

E2F 轉(zhuǎn)錄因子家族有E2F1- 8 八個成員，E2F1- 3 是轉(zhuǎn)錄活化因子，而E2F4- 8 作用相反。E2F 轉(zhuǎn)錄因子7（E2F7）作為非典型E2F 家族一員，在腫瘤中的作用存在爭議。其在肺腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膽管癌等多種惡性腫瘤中上調(diào)，是一種促腫瘤的轉(zhuǎn)錄因子［6-8］；但在皮膚鱗狀細胞癌中作為保護因子，E2F7 通過對細胞周期基因的轉(zhuǎn)錄抑制來發(fā)揮保護作用［9］。然而，E2F7 在PTC 的臨床意義及其作用機制尚不清楚。因此，進一步探究E2F7基因在PTC 中作用機制具有深遠意義。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和耗材 人甲狀腺乳頭狀癌K1、TPC-1 和BCPAP 細胞系購自中國科學(xué)院上海細胞所，正常甲狀腺濾泡上皮Nthy-ori 3-1 細胞購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；FBS、H-DMEM 和RMPI1640 培養(yǎng)基購自Gibco公司；shE2F7和shRNAC質(zhì)粒由北京合生有限公司構(gòu)建；Trizol 試劑購自Invitrogen 公司；RT-PCR 試劑盒購自天根生物科技（北京）有限公司；抗體購自Affinity 公司；PowerUpTMSYBR TM Green Master Mix 購自Thermo Fisher Scientific 公司；PTC 組織芯片（OD-CT EdThy03）購自上海芯超有限公司，該芯片已經(jīng)通過倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)實驗 組織芯片經(jīng)脫蠟、復(fù)水，枸櫞酸抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷后，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜（E2F7 工作濃度1∶100），Ⅱ抗（羊抗鼠lgG）37 ℃孵育30 min，用HRP 標(biāo)記鏈霉卵白素37 ℃孵育30 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。用雙盲法確定組織的陽性率，結(jié)果以胞質(zhì)出現(xiàn)淺黃色至棕褐色者為陽性，染色強度評分標(biāo)準為基本不著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色依次記為0、1、2、3 分；陽性細胞所占比例評分標(biāo)準為：0、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%依次計為0、1、2、3、4 分。相乘兩項指標(biāo)評分，判定結(jié)果如下：陰性為0 ～3 分、陽性為4 ～12 分。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染分組 Nthy-ori 3-1、K1、TPC-1 和BCPAP 細胞分別用含有10%FBS、1%青、鏈霉素雙抗的H-DMEM、RMPI1640 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。1∶2 傳代取對數(shù)生長期細胞用于實驗。選出E2F7的表達水平最高的K1細胞株進行沉默效率的檢測。將shE2F7 重組質(zhì)粒、空載體和只含有等量轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000 的溶液分別轉(zhuǎn)染K1 細胞，即為：基因沉默組（shE2F7）、空載體對照組shRNAC-K1（shRNAC）和空白對照組（K1 組）。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法 RIPA 裂解法提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE 和轉(zhuǎn)膜，4 ℃孵育I 抗β-actin（1∶4 000）、E2F7（1∶1 000）、cyclinD1（1∶1 000）、cyclinE1（1∶800）、EIF4A3（1∶1 000）、CDK4（1∶1 200）、AKT，p-AKT（1∶1 500）過夜；Ⅱ抗（1∶4 000）孵育1 h，以β-actin 作為內(nèi)參，ECL 發(fā)光液顯影，應(yīng)用Image J 1.48 圖像分析軟件分析蛋白相對表達量。

1.2.4 qRT-PCR Trizol 法分別提取3 組細胞的總RNA、定量后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin 為內(nèi)參，反應(yīng)體系和條件根據(jù)試劑盒說明進行。采用2-ΔΔCt方法計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 檢測細胞增殖、遷移能力

1.2.5.1 生長曲線 將三組細胞制成1 × 107/L 細胞懸液接種于96 孔板，設(shè)3 個平行的復(fù)孔，放于機器IncuCyte ZOOM 進行培養(yǎng)。根據(jù)儀器攝片結(jié)果統(tǒng)計并繪制出生長曲線。

1.2.5.2 細胞克隆形成實驗 三組細胞以每500個/孔的細胞密度接種于六孔板，各3 個復(fù)孔，培養(yǎng)至一周后終止培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定，Giemsa染色，流水沖洗，自然干燥。選取克隆細胞數(shù)大于50 的集落團計數(shù)。

1.2.5.3 細胞劃痕 三組細胞以5 × 108/L 細胞懸液接種于6 孔板，用ZOOM40731 的96 孔劃痕器（Wound Maker Tool）單向移動“一”字劃痕。PBS洗，繼續(xù)培養(yǎng)。3 個復(fù)孔，分別在0、12、24 h 進行攝片，計算劃痕愈合率。應(yīng)用Image J1.48 圖像分析軟件計算遷移面積分析。

1.2.6 檢測細胞周期及細胞凋亡 將三組細胞消化離心，PBS 重懸細胞，儲存于4 ℃75%乙醇4h 備用。離心去除酒精，PBS 清洗加入PI 溶液和RNase溶液，避光15 min ，流式細胞儀檢測細胞周期。用1×Binding Buffer 重懸細胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC 與PI，避光孵育10 min，加入PBS 至500 μL，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料表示為均值±標(biāo)準差，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)和百分數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片驗證PTC 中E2F7 的表達 PTC 患者組織E2F7 陽性率為88%（51/58），癌旁組織陽性率為12%（7/58），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。不同性別、年齡的PTC 患者E2F7 陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），不同腫瘤大小、腫瘤分期以及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 患者E2F7 陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1 和表1。

表1 PTC 中E2F7 的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Relationship between E2F7 expression in PTC and clinicopathological parameters 例

圖1 E2F7 在PTC 和癌旁正?？椫械谋磉_（免疫組織化學(xué)染色×100，Bar=50 μm）Fig.1 E2F7 in PTC and adjacent normal tissues（IHC×200，Bar=50 μm）

2.2 E2F7 在PTC 細胞系及正常甲狀腺濾泡細胞中的表達 三株P(guān)TC 細胞系E2F7 蛋白表達水平高于Nthy-ori 3-1 細胞（P＜0.01）。K1 細胞表達水平最高，故選擇K1 細胞敲低E2F7 進一步驗證E2F7 對PTC 細胞生物學(xué)行為的影響。見圖2。

圖2 濾泡上皮Nthy-ori 3-1 細胞及甲狀腺乳頭狀癌K1、BCPAP、TPC-1 細胞和E2F7 蛋白表達Fig.2 E2F7 expression among Papillary thyroid carcinoma K1，TPC-1，BCPAP cells and thyroid follicular Nthy-ori3-1 epithelial cells

2.3 K1 細胞轉(zhuǎn)染后E2F7 沉默效率 qRT-PCR 結(jié)果顯示shE2F7 沉默效率為shRNAC 組的60.2%，為K1組的59.8%。WB顯示與K1、shRNAC相比，shE2F7組E2F7 翻譯水平分別降低了70%和60%左右，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

圖3 沉默E2F7 對K1 細胞mRNA 及蛋白水平的影響Fig.3 Effects of Silencing E2F7 on mRNA and protein levels of K1 cells

2.4 沉默E2F7 對K1 細胞增殖、遷移能力的影響 shE2F7 細胞生長速度在第2、3 天明顯慢于shRNAC 組和K1 組（P＜0.01，圖4A-B）。細胞克隆數(shù)與shRNAC組和K1組相比明顯減少，克隆形成能力明顯降低（P＜0.01，圖5C-D）。12 h和24 h細胞遷移速度慢于shRNAC組和K1組（P＜0.01，圖4E-F）。

圖4 沉默E2F7 細胞增殖、克隆能力和遷移能力變化Fig.4 Changes of proliferation，cloning and migration ability after inhibition of E2F7 expression

2.5 干擾E2F7 對K1 細胞周期及凋亡的影響shE2F7組G0/G1期細胞比例為（65.13±4.25）%高于shRNAC 組的（37.65±3.09）%和K1組細胞的（40.06± 3.75）% ，而S 期細胞比例為（20.07 ± 0.94）%，明顯低于shRNAC 組的（40.63 ± 3.89）%和K1 組的（40.06 ± 1.45）%，G2 期細胞比例也有所減少（P＜0.01，圖5A-B）；說明shE2F7延長了K1細胞在G0/G1期滯留的時間，細胞周期受到阻滯。shE2F7 組細胞凋亡率比空載體組和K1 組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖5C-D）。

圖5 沉默shE2F7 對K1 細胞周期，凋亡的影響Fig.5 The effect of shE2F7on apoptosis of K1 cells

2.6 干擾E2F7 對K1 細胞周期相關(guān)蛋白及AKT信號通路的影響 敲低E2F7 后cyclin D1 和CDK4、cyclinE1、EIF4A3 mRNA和蛋白水平降低（P＜0.01）；Akt，pAkt 蛋白表達水平下調(diào)（P＜0.05）。見圖6。

圖6 E2F7 參與細胞周期和信號通路調(diào)控Fig.6 E2F7 is involved in regulating the cell cycle and signaling pathways

3 討論

E2F 轉(zhuǎn)錄因子家族是細胞增殖的重要調(diào)節(jié)因子，細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）CDK-RB-E2F 軸構(gòu)成了細胞周期進程的核心轉(zhuǎn)錄機制，CDK 的激活，RB 的磷酸化等均可導(dǎo)致E2F 活性升高，細胞增殖失控，致瘤性增強［8，10］。研究發(fā)現(xiàn)E2F7 作為一種潛在的致癌基因可導(dǎo)致膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖，進而促進膠質(zhì)母細胞瘤的進展，并作為一個有希望的抗膠質(zhì)母細胞瘤治療靶點［11］。

本研究分析了E2F7 在PTC 中高表達并驗證了E2F7 在PTC 表達水平高于癌旁組織，并與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。為明確E2F7 在PTC 中的作用機制，選擇三株P(guān)TC 細胞中E2F7 基因表達最高的K1 細胞進行E2F7 敲減，證明E2F7mRNA 及蛋白表達水平明顯降低。K1 細胞遷移和克隆能力明顯下降，增殖能力減弱。

為明確E2F7 促進K1 細胞增殖的機制，細胞周期實驗顯示shE2F7 組細胞大多停滯于G0/G1 期或S 期，細胞生長停滯。ZHAO 等［12］報道了肝細胞癌miR-424-5p 下調(diào)，靶基因E2F7 上調(diào)，促進G0/G1向S 轉(zhuǎn)換促進細胞增殖。細胞周期的進展是由CDKs 與相應(yīng)的周期蛋白結(jié)合控制的［13］。楊閃閃等［14］發(fā)現(xiàn)CCNL1 家族成員CyclinD1 能夠抑制人絨毛膜滋養(yǎng)細胞的增殖并影響細胞周期分布。WB結(jié)果顯示shE2F7 組G0/G1 關(guān)鍵周期蛋白cyclinD1/CDK4明顯下調(diào)，G1期進入向S期的關(guān)鍵基因cyclin E1/CDK2 也下調(diào)，與流式細胞周期結(jié)果一致。凋亡實驗結(jié)果顯示shE2F7 組細胞凋亡率增加。真核生物起始因子4A-III（eIF4A3）是外顯子連接復(fù)合物（exon junction complex，EJC）的核心解旋酶成分，作為EJC 的一種新成分，研究發(fā)現(xiàn)eIF4A3 存在于細胞核中。EIF4A3 可能直接與細胞周期調(diào)節(jié)基因CDK1、CDK2、CHEK1 和E2F1 等外顯子區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)其表達［15］。Lnc casc11在肝癌中上調(diào)并與預(yù)后不良相關(guān)，證明Lnc casc11 通過招募eIF4A3 調(diào)節(jié)E2F1，影響肝癌細胞的增殖、細胞活動、凋亡和細胞代謝，促進肝癌的進展［16］。上述提示本研究沉默E2F7后可能通過eIF4A3下調(diào)抑制了cyclinD1，E/CDK4 等基因轉(zhuǎn)錄，引起細胞周期阻滯。

Akt在PI3K/Akt 信號通路中起主要作用。磷酸化的Akt（pAkt）參與調(diào)節(jié)凋亡、增殖和細胞運動［12］。WANG 等［17］研究發(fā)現(xiàn)黃芩素下調(diào)PI3K/AKT 通路蛋白可以抑制TC 細胞的生長和遷移，激活凋亡信號通路。本研究顯示沉默E2F7 基因可以誘導(dǎo)K1細胞凋亡，PI3K/AKT 通路相關(guān)蛋白p-Akt/Akt 蛋白表達明顯X 下調(diào)，提示PI3K/Akt 通路參與K1 細胞增殖。Ma 的研究顯示microRNA-302a/d 通過靶向E2F7/Akt 軸抑制肝癌干細胞的自我更新能力促進AKT1-cyclin D1進入細胞周期［18］。Mir-129-5p 和si-E2F7 均能顯著誘導(dǎo)直腸腺癌sw1463 細胞凋亡，上調(diào)E2F7 抑制凋亡［19］。有研究發(fā)現(xiàn)LINC00284 可作 為ceRNA 吸附miR-3127-5p 靶 向E2F7 發(fā)揮促進PTC 增殖。GUO 等［20］報道m(xù)iR-30a 通過直接靶向E2F7 在PTC 中起腫瘤抑制作用，而miR-30a 可能是PTC 患者的新型治療靶點。但是這兩項研究均未在組織層面系統(tǒng)探索E2F7 和TPC 之間作用機制。本研究在組織水平、細胞層面對E2F7 促增殖機制進行了系統(tǒng)研究。表明沉默E2F7 可通過Akt信號通路抑制甲狀腺乳頭狀癌K1 細胞增殖、促進凋亡。但尚有待對E2F7 在PTC 中上調(diào)機制及體內(nèi)實驗進行深入研究。