小尾寒羊不同生長階段肌球蛋白與肌球 蛋白重鏈相關基因的變化

薛寶玲，宋曉彬

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學職業(yè)技術學院，內(nèi)蒙古 包頭 014109；2.烏蘭察布市食品藥品檢驗所，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000）

肌球蛋白是參與肌肉伸縮活動的一種形似“Y”形且具有ATP酶活性的大基團生物活性物質(zhì)，由2 條肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MyHC）和4 條輕鏈組成。2 條重鏈分子質(zhì)量約為210 kDa，大部分空間區(qū)域相互纏繞螺旋形成桿狀的尾部，4 條輕鏈分子質(zhì)量為18～32 kDa，構成“Y”形的頭部。肌肉伸縮依靠MyHC參與，MyHC的功能多樣性與肌動蛋白的特異性與受到Ca作用時ATP酶活性的功能多樣性相關。紅肌纖維與白肌纖維都有對應的基因進行翻譯編碼，Chang等研究表明，MyHC相關基因的特異性表達是骨骼肌肌纖維進行相應分型的依據(jù)。

不同的MyHC進行轉錄時都有相對應的基因進行編碼，研究證實，骨骼肌肌纖維依據(jù)MyHC相關基因的特異性表達分為Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型和Ⅱx型。本研究采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）法分離1～18 月齡小尾寒羊股二頭肌中MyHC異構體，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術測定MyHC相關基因mRNA的相對表達量并分析其與肌球蛋白含量之間的相關性，旨在為提高肉品質(zhì)和農(nóng)畜產(chǎn)品的深度加工所需參數(shù)提供有效數(shù)據(jù)支撐，為自然放牧條件下小尾寒羊的最佳育肥月齡提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取自然放牧條件下的1～18 月齡小尾寒羊股二頭肌作為研究對象（=3）。將股二頭肌迅速分裝，保存于無酶無菌EP管中避免肌纖維受到破壞，液氮快速冷凍， -80 ℃保存以備后續(xù)實驗測定使用。

核酸染料 北京擎科生物科技有限公司；反轉錄試劑盒 寶生物工程（北京）有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、四甲基乙二胺 上海浦予工業(yè)科技有限公司；SDS 河南派廣化工有限公司；-巰基乙醇 上海至吉生化科技有限公司；過硫酸銨 邯鄲市叢臺區(qū)少杰化工有限公司；考馬斯亮藍G-250 合肥健砷化工有限公司；丙烯酰胺 天津西典化學科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CX31光學顯微鏡 上?；菡\生物科技有限公司；MS-H-S磁力攪拌器 信鈺儀器（北京）有限公司；FSH-2A勻漿機 濟南童鑫生物科技有限公司；TD5A臺式離心機 常州金壇良友儀器有限公司；DYY-6C穩(wěn)流恒壓電泳儀 濟南歐萊博科學儀器有限公司； LB-E05050電子天平 蘇州卡吉德化學科技有限公司；LHS-80HC-1恒溫恒濕箱 濟南思明特科技有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 武漢鑫九星電子科技有限公司；ZT-288凝膠成像儀 上海金鵬分析儀器有限公司；CFX96TM實時熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad 公司；WSB-18恒溫水浴振蕩器 北京漢達森機械技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

參考Light等方法進行提取。取1.5～2.0 cm肌肉組織，去掉結締與脂肪組織并切碎。稱取15 mg切碎的肌肉組織，加入750 μL蛋白準備液（pH 6.8、0.05 mol/L KPO），3 000 V、0.3 s勻漿5 次，4 ℃靜置50 min，3 000 r/min離心15 min后取上層液體，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 肌球蛋白含量的測定

采用BCA法測定肌球蛋白含量。準確稱取所需用量的BSA，保存?zhèn)溆谩７謩e稱取10 g BCA二鈉鹽、20 g無水NaCO、1.6 g NaCHO、4 g NaOH與9.5 g NaHCO混合，定容至1 L。液體混合均勻后pH值調(diào)至11即為BCA法A溶液；4 g CuSO定容至100 mL即為BCA法B溶液。BCA法A溶液與B溶液按照體積比49∶1充分混勻后配制成BCA法工作液C。標準品（400 μg/mL BSA溶液）與工作液C等體積混勻，置于35 ℃恒溫恒濕保存50 min。

根據(jù)表1的比例進行配制，以BSA含量作為橫坐標（），測得的作為縱坐標（），繪制標準曲線，方程為=0.025 6+0.137 7（=0.990 3），表明與BSA含量的相關性良好。根據(jù)所測標準品與樣品的及標準曲線方程計算出樣品的肌球蛋白含量。

表1 肌球蛋白含量測定標準曲線的繪制Table 1 Preparation of standard curve for quantitative analysis of myosin

1.3.3 SDS-PAGE分離MyHC異構體

參考Light等的方法。配制樣品緩沖液、下槽緩沖液、上槽緩沖液、分離膠與濃縮膠；2×樣品緩沖液與提取得到的上清液按照體積比1∶2混合均勻配制為樣品溶液，振蕩45 s，煮沸5 min，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，樣液終質(zhì)量濃度10～110 ng/μL；下槽緩沖液注入下槽，上槽緩沖液注入上槽，4 ℃條件下用微量進樣器在膠孔中按順序注入25 μL樣液；接通電源，調(diào)節(jié)層析柜溫度始終保持4 ℃，電泳儀140 V電壓進行SDS-PAGE，至藍色移動條距離凝膠板底部2 cm位置時停止電泳；染色時間為1.5 h，脫色液定時更換至染色凝膠清晰，取下凝膠板。

1.3.4 骨骼肌總RNA的提取

參考TRIzol法，快速研磨肌肉組織，隨時補充液氮使其始終處于冷凍狀態(tài)，取300～500 mg備用，將100～150 mg樣品組織放入1.5 mL滅酶滅菌EP管中低溫放置12 min；4 ℃、3 000 r/min離心8 min取上清液，加入約為其體積20%的氯仿，強烈混勻20 s，20 ℃靜置至無分相沉淀產(chǎn)生；4 ℃、3 000 r/min離心20 min，保留上清液，加入與其等體積的異丙醇于滅酶滅菌管中，20 ℃保存20 min；4 ℃、3 000 r/min離心15 min棄上清液，下層沉淀即為白色膠狀RNA，加入1 mL滅酶滅菌水配制的體積分數(shù)75%乙醇溶液，上下顛倒洗滌沉淀；4 ℃、3 000 r/min離心8 min棄上清液；反置于20 ℃下干燥；加入30～60 μL滅酶滅菌水溶解凝膠沉淀至完全溶解， -80 ℃放置；取10 μL RNA溶液與4 μL試劑盒緩沖液混勻，測定總RNA質(zhì)量，對其含量進行判定；根據(jù)樣品RNA的OD/OD值，將其質(zhì)量濃度調(diào)整為500 ng/μL。

1.3.5 反轉錄與引物合成

利用反轉錄試劑盒合成c D N A第1鏈；按照、、和4 種基因的核苷酸序列，應用Primer Premier軟件進行分析，由博覽特生物技術有限公司進行引物的設計和合成。

1.3.6 實時熒光定量PCR

利用實時PCR系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR擴增。以反轉錄的cDNA為模板，看家基因為內(nèi)參，每個樣品進行3 個重復。實時熒光定量PCR反應總體系為50 μL，其中：滅菌ddHO 17 μL、cDNA模板4 μL、上游引物 （1 μmol/L）2 μL、下游引物（1 μmol/L）2 μL、SYBR Premix ExII（2×）25 μL。采用兩步法PCR反應程序：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環(huán)。采用2法計算基因相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SAS 9.4軟件進行數(shù)據(jù)分析，結果用平均值±標準差表示，方差分析采用PROC ANOVA程序，多重比較采用Duncan程序，相關性分析采用Proc Corr程序。

2 結果與分析

2.1 股二頭肌中肌球蛋白含量測定結果

由表2可知，1～9 月齡小尾寒羊股二頭肌中肌球蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢，且1～6 月齡間差異顯著 （＜0.05），6～12 月齡肌球蛋白含量差異不顯著，在9 月齡達到峰值，肌球蛋白含量與吸光度總體呈現(xiàn)線性規(guī)律。

表2 1～18 月齡小尾寒羊股二頭肌的肌球蛋白含量Table 2 Content of myosin in the Biceps femoris muscle of Small Tailed Han sheep aged from 1 to 18 months

2.2 SDS-PAGE分離MyHC

Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb與Ⅰ型的MyHC主要是由其所在的基因所決定的。Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb與Ⅰ型的MyHC分子質(zhì)量有所差異，通過SDS-PAGE將Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb與Ⅰ型的MyHC進行分離。通常情況下，不同類型基因的特異性表達與不同類型的肌纖維之間存在相互對應關系，不同基因之間也存在相互轉化關系，這也是導致Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb與Ⅰ型MyHC之間相互轉化的誘導因素。由圖1可知，分離出MyHC中的4 種類型，這一結果與本團隊前期ATPase組織化學染色結果相一致，表明小尾寒羊股二頭肌中存在上述類型的MyHC。Ⅱa、Ⅱb型的MyHC條帶較Ⅱx型的MyHC略為清晰，是由于Ⅱx型MyHC屬于中間型MyHC，易于轉化。

圖1 1～18 月齡小尾寒羊股二頭肌肌球蛋白異構體SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE profile of myosin heavy isoforms in Biceps femoris muscle of Small Tailed Han sheep aged from 1 to 18 months

2.3 骨骼肌中總RNA含量和純度及質(zhì)量檢測

由表3可知，3～12 月齡小尾寒羊股二頭肌OD/OD差異不顯著，1～3 月齡與12～18 月齡之間差異顯著 （＜0.05），并且呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在3 月齡達到最大。1～18 月齡樣品的OD/OD為1.8～2.0，表明總RNA在后續(xù)實驗中可被繼續(xù)使用。

表3 1～18 月齡小尾寒羊股二頭肌OD260 nm/OD280 nm及總RNA含量Table 3 OD260 nm/OD260 nm and total RNA content in Biceps femoris muscle in Small Tailed Han sheep aged from 1 to 18 months

2.4 MyHC相關基因PCR產(chǎn)物擴增結果

由圖2可知，普通實時熒光定量P C R擴增出的基因長度為200 bp、基因長度為284 bp、型基因長度為216 bp、型基因長度為165 bp，看家（內(nèi)參）基因長度為233 bp。與Marker進行比對得出，Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb與Ⅰ型基因長度與預計相一致，并且沒有其他條帶，說明Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb與Ⅰ型基因片段出現(xiàn)明顯的特異性擴增條帶，基因引物的特異性良好，滿足后續(xù)的反轉錄實驗精度要求。

圖2 實時熒光定量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of real-time PCR amplified products

2.5 股二頭肌實時熒光定量PCR

圖4 MyHC基因?qū)崟r熒光定量PCR溶解峰Fig. 4 Real-time PCR melting peaks of MyHC gene

由圖3～4可知，實時熒光定量PCR擴增曲線達到所設閾值范圍，溶解曲線說明、、、和基因序列都是單一峰值，各引物特異性良好，沒有出現(xiàn)非特異性擴增并且沒有產(chǎn)生引物二聚體。表明實驗結果所得的相對表達量分析數(shù)據(jù)可信。

圖3 MyHC基因?qū)崟r熒光定量PCR擴增曲線Fig. 3 Real-time PCR amplification curve of MyHC gene

由表4可知，小尾寒羊股二頭肌基因總體呈現(xiàn)隨著月齡的遞增相對表達量穩(wěn)步遞減的趨勢，1～18 月齡中兩端月齡分別為最高值與最低值?；蚩傮w呈現(xiàn)隨著月齡的遞增相對表達量先降低后增加的趨勢，差異均顯著（＜0.05），12 月齡為最高值，6 月齡為最低值。基因的相對表達量與基因總體呈現(xiàn)出相反的趨勢，隨著月齡的增加逐漸增加，1～18 月齡中兩端月齡分別為最低值與最高值?；蛳鄬Ρ磉_量總體上差異均顯著，12 月齡為最高值，9 月齡為最低值?；蛳鄬Ρ磉_量測定結果與SDS-PAGE結果一致?？傮w上看，隨著月齡的增加，小尾寒羊股二頭肌中、基因的相對表達量高于基因。

表4 1～18 月齡小尾寒羊股二頭肌MyHC基因相對表達量Table 4 Relative expression levels of MyHC gene in Biceps femoris muscle during one to 18 months of age

3 結 論

隨著1～18 月齡的變化，小尾寒羊股二頭肌中基因的相對表達量與同月齡時肌球蛋白含量變化規(guī)律一致。小尾寒羊股二頭肌中基因相對表達量高于基因，基因相對表達量低于基因和基因相對表達量之和，與前期研究肌纖維含量變化相一致。基因相對表達量在6～9 月齡變化范圍較大，9～12 月齡變化范圍較小，6～9 月齡生長緩慢，9～12 月齡生長較快。肌球蛋白含量可能是由于1～18 月齡小尾寒羊在天然放牧條件下由于受自然條件的變化發(fā)生變化。小尾寒羊自身發(fā)育時，可能由于品種、部位、外界飼養(yǎng)條件、營養(yǎng)因素區(qū)別等，導致骨骼肌中不同肌纖維類型之間能夠相互轉化。通過實時熒光定量PCR測定MyHC相關基因mRNA的相對表達量可以確定股二頭肌中不同類型肌纖維，本實驗所用到的分析方法是建立在分子水平上，因此用到的實驗樣品較少卻能反映出樣品的整體情況，在遺傳育種、飼養(yǎng)等實踐中有廣泛的應用和潛在的價值。