魚油DHA脂質(zhì)體的制備及穩(wěn)定性

楊水兵，劉 麗，易國(guó)富，余海霞

（1.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 滁州 239000；2.浙江大學(xué)舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316021）

我國(guó)魚油資源豐富，近幾年年產(chǎn)量維持在大約3 萬t。 魚油是從魚類或其加工副產(chǎn)物中提取的脂質(zhì)成分，富含-3多不飽和脂肪酸，主要包含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。其中DHA主要存在于視網(wǎng)膜和大腦皮層中，具有促進(jìn)嬰幼兒大腦發(fā)育、保護(hù)視力、預(yù)防心腦血管疾病、抗炎癥等功能，已引起食品、保健品等領(lǐng)域研究人員的廣泛關(guān)注。但由于DHA含有6 個(gè)雙鍵，導(dǎo)致其易受到如光、熱、氧等外環(huán)境的影響，且其氣味、水溶性和流動(dòng)性較差，極大限制了其應(yīng)用。

脂質(zhì)體是由磷脂雙分子層組成的具有類生物膜結(jié)構(gòu)的囊泡，可包裹水溶性和脂溶性的芯材，以達(dá)到對(duì)包埋營(yíng)養(yǎng)物的緩控釋、靶向等作用，在農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)及醫(yī)藥等領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。針對(duì)脂溶性魚油DHA的生理功能及脂質(zhì)體的特性，采用運(yùn)載包埋技術(shù)將魚油DHA制備成脂質(zhì)體，可有利于快速發(fā)揮它的功能作用。

常用的制備脂質(zhì)體的方法有薄膜法、逆向蒸發(fā)法、乙醇注入法及高壓乳勻法等。薄膜法適用于脂溶性物質(zhì)的包覆，但一般粒徑較大。動(dòng)態(tài)高壓微射流（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）技術(shù)是一種連續(xù)化處理手段，由于其強(qiáng)剪切、高速撞擊、氣蝕、振蕩和膨化等作用，在運(yùn)載體系的均質(zhì)、細(xì)化和乳化等過程中有重要應(yīng)用。因此，本研究以脂溶性魚油DHA為原料，分別采用薄膜分散法及薄膜分散法聯(lián)合DHPM技術(shù)制備包載魚油DHA的粗脂質(zhì)體（crude liposomes-DHA，CLs-DHA）和納米脂質(zhì)體（nanoliposomes-DHA，NLs-DHA），以平均粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）、Zeta電位等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同方法制備的魚油DHA脂質(zhì)體的pH值和貯藏穩(wěn)定性；并通過差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法分析不同方法制備的魚油DHA脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性差異。旨在開發(fā)一種低粒徑、穩(wěn)定性好的脂質(zhì)體運(yùn)載體系，以方便在實(shí)際生產(chǎn)中使用，擴(kuò)大DHA魚油的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10/70 EE-DHA魚油（DHA含量70%，2021年10月18日 制備，食品級(jí)），來源于鳀魚廢棄物提取，舟山新諾佳生物工程有限責(zé)任公司提供。

無水乙醇（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限 公司；大豆卵磷脂（純度＞92%） 北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司；膽固醇（分析純） 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；吐溫-80（分析純） 上海申宇醫(yī)藥化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；Nicomp 380 ZLS超細(xì)微粒粒度分析儀 美國(guó)Santa Barbara公司；T6紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Microfluidizer Processor M-700微射流儀 美國(guó)Microfluidics公司；DSC 7000X DSC儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 魚油DHA脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法制備CLs-DHA，將大豆卵磷脂、膽固醇、吐溫-80和10/70 EE-DHA魚油按質(zhì)量比15∶3.75∶5∶5混合，在40 ℃水浴中溶于一定量的無水乙醇中，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，形成脂質(zhì)薄膜，加入磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，0.05 mol/L），在減壓條件下充分旋轉(zhuǎn)洗膜，獲得CLs-DHA懸液。將CLs-DHA懸液加入DHPM均質(zhì)機(jī)中，在120 MPa下處理2 次，得到均勻的NLs-DHA。NLs-DHA外觀透亮、均勻、無沉淀，而 CLs-DHA呈現(xiàn)出乳白色的外觀。

1.3.2 平均粒徑、PDI、Zeta電位測(cè)定

將待測(cè)脂質(zhì)體懸液稀釋至一定濃度，采用激光納米粒度儀在25 ℃下測(cè)定平均粒徑、PDI和Zeta電位，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。

1.3.3 DHA脂質(zhì)體的穩(wěn)定性測(cè)定

1.3.3.1 pH值穩(wěn)定性

參考付咪等的方法并做適當(dāng)修改，將CLs-DHA和NLs-DHA分別調(diào)節(jié)pH值至1.5、4.0、5.5及7.4，并于4 ℃冷藏放置7 d，考察CLs-DHA和NLs-DHA平均粒徑、PDI和Zeta電位的變化。

1.3.3.2 貯藏穩(wěn)定性

將CLs-DHA和NLs-DHA置于4 ℃冷藏放置95 d，間隔取樣測(cè)定CLs-DHA和NLs-DHA平均粒徑、PDI和Zeta電位的變化。

1.3.4 DHA脂質(zhì)體的DSC分析

用DSC儀對(duì)CLs-DHA和NLs-DHA的相變溫度進(jìn)行測(cè)定。取8.0 mg CLs-DHA和NLs-DHA凍干樣品放入密閉鋁坩堝底部，在加熱溫度20～200 ℃條件下掃描樣品，設(shè)定升溫速率為10 ℃/min，以空白坩堝作為對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，本研究所列數(shù)據(jù)為3 個(gè)試樣的平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚油DHA脂質(zhì)體的pH值穩(wěn)定性

PDI是反映膠體體系中粒徑分布的指標(biāo)，PDI＜0.4表明體系粒徑分布均勻，PDI越小說明粒徑分布的范圍越小，體系中顆粒的規(guī)整度越好，分散度越均勻。Zeta電位是表征脂質(zhì)體穩(wěn)定性的一個(gè)重要物理特性。Zeta電位絕對(duì)值越高，脂質(zhì)體相互凝聚而沉降的阻力越大， 越穩(wěn)定。環(huán)境pH值會(huì)影響磷脂的水解，改變脂膜的通透性，同時(shí)會(huì)對(duì)粒子表面電荷產(chǎn)生影響，引起聚集，影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

圖2 pH值對(duì)CLs-DHA和NLs-DHA PDI的影響Fig. 2 Effect of pH value on PDI of CLs-DHA and NLs-DHA

由圖1～2可知，隨著pH值逐漸增大，NLs-DHA的平均粒徑和PDI均呈下降趨勢(shì)，平均粒徑從172.4 nm降至124 nm左右，PDI從0.349降至0.269，粒徑分布比較均一，體系相對(duì)穩(wěn)定，尤其在pH 7.4時(shí)NLs-DHA有較好的穩(wěn)定性。隨pH值升高，CLs-DHA的平均粒徑和PDI均呈先上升后下降的趨勢(shì)，不同pH值處理組之間的平均粒徑差異也較明顯。pH值對(duì)脂質(zhì)體穩(wěn)定性影響較大，pH值越低，H濃度增加，H會(huì)穿透雙分子層膜，造成雙分子層膜被破壞，脂質(zhì)體越不穩(wěn)定，越容易發(fā)生絮凝和沉淀。

圖1 pH值對(duì)CLs-DHA和NLs-DHA平均粒徑的影響Fig. 1 Effect of pH value on average particle size of CLs-DHA and NLs-DHA

由圖3可知，隨著pH值逐漸增大，CLs-DHA和NLs-DHA的Zeta電位絕對(duì)值均逐漸升高，在接近中性pH值（7.4）條件下Zeta電位絕對(duì)值最大，脂質(zhì)體貯藏穩(wěn)定性較好，而當(dāng)脂質(zhì)體處于強(qiáng)酸（pH 1.5）環(huán)境下，其Zeta電位絕對(duì)值大幅下降，接近于0 mV，變得很不穩(wěn)定；總體來說，CLs-DHA的Zeta電位絕對(duì)值略低于NLs-DHA，NLs-DHA表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。江連洲等制備的大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液在酸性條件下不穩(wěn)定，堿性條件下穩(wěn)定，不同魚油運(yùn)載體系的穩(wěn)定性受乳化劑種類和濃度的影響，pH值會(huì)影響大豆蛋白的電離程度和乳化性，從而影響體系的穩(wěn)定性，而pH值對(duì)吐溫穩(wěn)定的魚油運(yùn)載體系的平均粒徑影響不大。

圖3 pH值對(duì)CLs-DHA和NLs-DHA Zeta電位絕對(duì)值的影響Fig. 3 Effect of pH value on absolute value of zeta potential of CLs-DHA and NLs-DHA

2.2 魚油DHA脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性

圖5 貯藏時(shí)間對(duì)CLs-DHA和NLs-DHA PDI的影響Fig. 5 Effect of storage time on PDI of CLs-DHA and NLs-DHA

由圖4～5可知，在貯藏95 d過程中，CLs-DHA粒徑變化幅度相對(duì)較大，平均粒徑大致呈先下降后升高的趨勢(shì)，貯藏66 d之后平均粒徑明顯上升，從（368.4±4.4） nm增加至（394.0±3.7） nm。這可能是因?yàn)樵谇捌谥苽涞闹|(zhì)體發(fā)生了重組，粒徑變小，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，脂質(zhì)體出現(xiàn)顆粒聚集、破裂等物理不穩(wěn)定現(xiàn)象，引起粒徑和粒徑分布范圍增大；NLs-DHA的平均粒徑和PDI變化幅度相對(duì)較小，平均粒徑為88 nm左右，PDI波動(dòng)也較小（0.220～0.246），粒徑分布較均勻，分散體系較為穩(wěn)定。

圖4 貯藏時(shí)間對(duì)CLs-DHA和NLs-DHA平均粒徑的影響Fig. 4 Effect of storage time on average particle size of CLs-DHA and NLs-DHA

由圖6可知，2 組樣品Zeta電位絕對(duì)值均呈降低趨勢(shì)，NLs-DHA的Zeta電位變化小于CLs-DHA，也表明NLs-DHA的長(zhǎng)期穩(wěn)定性優(yōu)于CLs-DHA，適度的DHPM技術(shù)處理可增強(qiáng)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。邰克東等采用傳統(tǒng)薄膜水化法輔助高壓均質(zhì)制備脂質(zhì)體，也發(fā)現(xiàn)均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)的增加可明顯降低脂質(zhì)體囊泡的粒徑并提高其離心物理穩(wěn)定性。

圖6 貯藏時(shí)間對(duì)CLs-DHA和NLs-DHA Zeta電位絕對(duì)值的影響Fig. 6 Effect of storage time on absolute value of zeta potential of CLs-DHA and NLs-DHA

2.3 魚油DHA脂質(zhì)體的DSC分析

脂質(zhì)體雙層膜的性質(zhì)與介質(zhì)溫度密切相關(guān)。當(dāng)介質(zhì)溫度升高時(shí)，脂質(zhì)雙分子層中?；鶄?cè)鏈從有序排列變成無序排列，引起脂膜的物理性質(zhì)產(chǎn)生一系列變化，可由“膠晶態(tài)”變成“液晶態(tài)”，膜的橫切面增加，厚度減小，流動(dòng)性增加，發(fā)生這種轉(zhuǎn)變時(shí)的溫度稱為相變溫度（）?？捎脕碓u(píng)估脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性，脂質(zhì)體膜的剛性或流動(dòng)性密切影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，從而影響脂質(zhì)體的載體性質(zhì)。一般來說，越大，焓值越小，物質(zhì)狀態(tài)會(huì)越好，完整度加大，產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性越好。

圖8 CLs-DHA的DSC曲線Fig. 8 DSC profile of CLs-DHA

圖9 NLs-DHA的DSC曲線Fig. 9 DSC profile of NLs-DHA

由圖7～9可知，CLs-DHA的為126.37 ℃，NLs-DHA的為133.73 ℃，均比大豆卵磷脂的（125.19 ℃）高。其中CLs-DHA的接近于磷脂。將大豆卵磷脂制備成魚油DHA脂質(zhì)體后，有所升高，原因可能是膽固醇增加了磷脂雙分子層膜的剛性，降低了膜流動(dòng)性，從而使上升，穩(wěn)定性增加。NLs-DHA的較CLs-DHA上升較大，膜的穩(wěn)定性更大，可能是因?yàn)镈HPM技術(shù)處理的高速撞擊、高速剪切、瞬時(shí)壓降、高頻振蕩和氣穴作用有效提高了脂質(zhì)體的，對(duì)脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性產(chǎn)生一定的影響，增強(qiáng)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，與前面pH值和貯藏穩(wěn)定性的結(jié)果一致。Wang Qianqian等通過DSC分析儀測(cè)得制備的魚油粗脂質(zhì)體為56.17 ℃，低于本研究中制備的DHA魚油脂質(zhì)體的。不同脂質(zhì)體制備相關(guān)研究中的差異可能是由于制備時(shí)使用的磷脂等不同導(dǎo)致的。

圖7 大豆卵磷脂DSC曲線Fig. 7 DSC profile of soybean lecithin

3 結(jié) 論

本研究分別采用薄膜分散法及薄膜分散法聯(lián)合DHPM技術(shù)制備包載魚油DHA的CLs-DHA和NLs-DHA，以平均粒徑、PDI、Zeta電位為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察 CLs-DHA和NLs-DHA的pH值穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性，并通過DSC儀分析其熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明：NLs-DHA表現(xiàn)出更好的pH值和貯藏穩(wěn)定性；通過DSC分析表明，與未經(jīng)DHPM均質(zhì)處理的脂質(zhì)體CLs-DHA相比，NLs-DHA 具有較高的，也表明適度的DHPM技術(shù)處理可增強(qiáng)魚油DHA脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。本研究結(jié)果表明，相比于 CLs-DHA，NLs-DHA具有更優(yōu)良的穩(wěn)定性。