巨自噬與細(xì)胞泡沫化在動脈粥樣硬化中的研究進(jìn)展

楊永兆 陳 鵬

隨著人們生活水平的提高和全球人口老齡化的加劇，心血管疾病(cardiovascular diseases, CVDS)已成為威脅人類生命健康的主要因素之一，其發(fā)生率和病死率已經(jīng)超過惡性腫瘤而躍居首位，成為近年來主要疾病負(fù)擔(dān)。作為CVDS的主要發(fā)病基礎(chǔ)，動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)與缺血性心臟病、缺血性腦卒中和外周動脈疾病等密切相關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，富含膽固醇酯的泡沫細(xì)胞(foam cell, FC)是AS斑塊的重要組成部分，F(xiàn)C壞死會誘發(fā)大量炎性細(xì)胞因子釋放，并最終導(dǎo)致AS斑塊的進(jìn)展和不穩(wěn)定。因此，在逆轉(zhuǎn)AS進(jìn)程方面，阻止FC形成和壞死一直備受關(guān)注。即使有各種各樣的藥物和療法可用，但目前仍沒有針對FC來治療AS的有效方法。已有研究表明，自噬可以促進(jìn)脂滴降解為膽固醇，并促進(jìn)后者的外排，有利于AS的轉(zhuǎn)歸，提示通過靶向調(diào)節(jié)自噬，減少FC內(nèi)脂質(zhì)沉積有望成為AS治療的新策略。本文就自噬在細(xì)胞泡沫化形成中的作用與AS的關(guān)系做重點(diǎn)闡述，為AS的防治研究提供理論依據(jù)。

一、細(xì)胞泡沫化與AS

血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell, VEC)、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)和巨噬細(xì)胞(macrophages, M?)是AS發(fā)生、發(fā)展過程中的3種關(guān)鍵細(xì)胞，都參與了FC的形成。FC根據(jù)來源不同被劃分為兩類，即M?源性FC和VSMC源性FC。

M?源性FC的形成是AS早期病變的標(biāo)志性事件。早期內(nèi)皮損傷后，伴隨著炎癥的發(fā)生，VEC通透性增強(qiáng)，低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)攜帶大量膽固醇透過VEC，聚集到VEC的間隙中，隨后VEC表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)和血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附到血管內(nèi)膜并分化為M?，M?被激活后，通過產(chǎn)生NO、超氧化物陰離子、羥基自由基等活性氧介導(dǎo)LDL氧化修飾，形成氧化型低密度脂蛋白膽固醇(oxidized low density lipoprotein cholesterol, ox-LDL-C)，隨后ox-LDL-C被M?表達(dá)的清道夫受體CD36、CD68、SR-A、SRB1等迅速識別，M?捕獲吞噬修飾后的LDL，導(dǎo)致大量膽固醇在胞內(nèi)蓄積，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為FC，隨著M?泡沫化程度的加深和非受體介導(dǎo)的大顆粒脂蛋白吞噬，膽固醇酯在胞內(nèi)不斷堆積，形成早期脂質(zhì)條紋病變。

長期以來，人們一直認(rèn)為AS病變部位的FC全部來源于M?，然而，有研究者在人體的研究中發(fā)現(xiàn)，VSMC也是FC的主要來源之一。AS的發(fā)展期，在血小板源生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)的共同刺激下，位于動脈中膜的VSMC遷入內(nèi)膜，與M?類似，VSMC在炎癥刺激下發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化為具有與M?相似吞噬功能的細(xì)胞，大量攝取ox-LDL形成FC，隨著VSMC源性FC的大量聚集，斑塊纖維帽形成。

無論是M?源性FC還是VSMC源性FC，它們都參與了斑塊的形成和發(fā)展。早期M?源性FC在內(nèi)膜的聚集，促進(jìn)了脂紋的形成，隨著脂質(zhì)的不斷堆積，大量VSMC發(fā)生增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化，在內(nèi)膜中蓄積吞噬脂質(zhì)，位于脂紋深層的VSMC會發(fā)生凋亡，引起M?進(jìn)一步積聚和微泡，而后者可以鈣化，促進(jìn)脂紋轉(zhuǎn)化為纖維斑塊，斑塊中膽固醇在FC里大量沉積，會導(dǎo)致FC分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)，降解斑塊中的膠原纖維，同時FC通過凋亡、自噬等機(jī)制不斷死亡吸引更多的M?遷移到內(nèi)膜區(qū)域，形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步加劇AS斑塊的不穩(wěn)定性。總之，F(xiàn)C堆積是AS的標(biāo)志，其數(shù)量反映了AS發(fā)病的嚴(yán)重程度。

二、細(xì)胞自噬及其調(diào)控因子

細(xì)胞自噬(autophagy)是一種主要通過形成溶酶體系統(tǒng)來降解自身受損細(xì)胞器、異常蛋白等物質(zhì)的生理過程。當(dāng)細(xì)胞受到理化刺激，如饑餓、缺氧時，可通過自噬的方式來維持細(xì)胞的健康狀態(tài)。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)方式和降解機(jī)制的不同，可將自噬分為3類，即巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。其中巨自噬參與了AS脂質(zhì)代謝過程，因此，本文主要綜述巨自噬在細(xì)胞泡沫化中的作用。

由于自噬在生物進(jìn)化過程中高度保守，其調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未完全闡明。目前，與調(diào)控細(xì)胞自噬有關(guān)的基因被統(tǒng)一命名為自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene, ATG)，這些基因編碼的不同蛋白參與了細(xì)胞自噬過程的各個環(huán)節(jié)，形成了多個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、Beclin1、p62等是自噬調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，可作為自噬發(fā)生的標(biāo)志。Beclin1是Atg6在哺乳動物中的同源基因，在自噬的起始階段，其與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(PIKⅢ)形成復(fù)合物，募集自噬特異性蛋白定位到自噬泡，參與自噬體的形成，其表達(dá)量隨著自噬程度加深而增加。此外，unc-51樣激酶1(Ulk1)在這個過程中會與Atg5、Atg12、Atg13和Atg16相互作用，之后泛素樣蛋白Atg12和Atg8/LC3結(jié)合，參與自噬體的延伸和成熟。與Beclin1類似，LC3是Atg8在哺乳動物中的同源物，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種亞型。在自噬體形成過程中，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素化處理轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，之后LC3-Ⅱ靶向結(jié)合到自噬體膜上，促進(jìn)自噬體的成熟，LC3-Ⅱ的含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值與自噬泡的數(shù)量呈正相關(guān)。最終，成熟的自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，此時，多功能蛋白p62可將泛素化底物連接到自噬小體中，使泛素化的底物降解，同時自身也被降解。而降解過程形成的小分子物質(zhì)又可為細(xì)胞代謝提供營養(yǎng)和原料。這個階段，p62蛋白的升高，提示細(xì)胞自噬活性受到抑制。

三、巨自噬與細(xì)胞泡沫化

1.概述：在AS發(fā)展過程中，過量的游離膽固醇對VSMC和M?來說是有毒的，為了維持自身的正常生理功能，二者會啟動復(fù)雜的反饋機(jī)制來減少膽固醇的攝入，當(dāng)膽固醇代謝失衡后，膽固醇酯便在VSMC和M?中積聚形成FC?，F(xiàn)有證據(jù)表明，F(xiàn)C中的脂滴主要由膽固醇酯構(gòu)成，自噬激活有利于脂滴降解為膽固醇并促進(jìn)其逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，減少脂質(zhì)在FC中的聚積，從而抑制FC的形成，延緩AS進(jìn)展。因此，自噬對維持VSMC和M?脂質(zhì)代謝平衡顯得尤為重要。

2.巨自噬與巨噬細(xì)胞泡沫化：M?是一種基本的免疫吞噬細(xì)胞，在AS斑塊中大量存在，參與了AS發(fā)生、發(fā)展的全過程，M?源性FC的出現(xiàn)被認(rèn)為是AS早期的關(guān)鍵信號。Yang等指出，自噬可減輕斑塊內(nèi)M?浸潤和泡沫化程度，在高脂飼料喂養(yǎng)的載脂蛋白E基因缺失(ApoE)小鼠中，抑制能誘導(dǎo)自噬的調(diào)節(jié)因子SIRT1后，ApoE小鼠AS病變部位斑塊面積增大，F(xiàn)C增多。此外，在ox-LDL誘導(dǎo)的M?源性FC模型中，通過敲除SIRT1引起自噬缺陷，M?中p62的表達(dá)升高，同時Beclin1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值均降低，M?泡沫化增強(qiáng)，而過表達(dá)SIRT1后上述情況出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，表明自噬能保護(hù)M?免受脂質(zhì)侵害。然而，該研究主要使用體外研究的方法，具有一定局限性，面對復(fù)雜的體內(nèi)微環(huán)境，SIRT1是否控制ApoE小鼠的自噬過程還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。Wang等同樣認(rèn)為M?自噬可減少FC形成，抑制AS發(fā)展，敲除基因SIRT6后，M?中p62的表達(dá)升高，LC3-Ⅱ表達(dá)降低，自噬受損，M?源性FC形成增多，加劇了AS斑塊的不穩(wěn)定性，而過表達(dá)SIRT6顯著增加了M?的自噬通量，F(xiàn)C形成減少的同時，還抑制了血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和P-選擇素的表達(dá)，使M?和FC的浸潤均減少，斑塊穩(wěn)定性增加。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過激活SIRT1介導(dǎo)的自噬，可促進(jìn)M?向M2型轉(zhuǎn)化，減少FC的形成并減輕AS。上述研究表明，上調(diào)自噬對M?泡沫化具有保護(hù)作用，但所選靶基因均過于單一，仍有許多靶點(diǎn)尚待探索。

3.巨自噬與血管平滑肌細(xì)胞泡沫化：與M?源性FC比較，VSMC源性FC形成后會穩(wěn)定存在于AS斑塊中無法脫離，因此，VSMC源性FC的形成和發(fā)展可能與斑塊穩(wěn)定性關(guān)系更大。當(dāng)VSMC內(nèi)脂質(zhì)代謝失衡時，自噬會被激活。Li等研究證實(shí)，自噬激活可減少VSMC內(nèi)脂質(zhì)堆積，抑制其泡沫化，在原代培養(yǎng)的小鼠胸主動脈VSMC中，通過ox-LDL誘導(dǎo)泡沫化模型，敲除自噬相關(guān)基因Atg7，自噬受到抑制，VSMC內(nèi)脂滴堆積增加并伴隨膽固醇水平升高，當(dāng)激活PPARγ介導(dǎo)的自噬途徑后，VSMC中Beclin1的表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值均顯著增加，VSMC泡沫化程度減弱。此外，Li等的另一項(xiàng)研究再次證實(shí)了自噬對VSMC泡沫化的保護(hù)作用，在ApoE小鼠中，特異性敲除VSMC中SCAP(一種膽固醇傳感器)后，小鼠斑塊中自噬相關(guān)蛋白p62表達(dá)降低，LC3表達(dá)升高，小鼠斑塊面積減小，此外，在SCAP敲除的VSMC中，自噬體數(shù)量增加，p62表達(dá)水平降低，自噬被激活，VSMC中的脂質(zhì)積累減少，其泡沫化程度降低。在近年來的一項(xiàng)研究中也得出了與上述同樣的結(jié)論，在敲除自噬必須基因Atg5后，自噬缺失，VSMC內(nèi)膽固醇外排受阻，脂質(zhì)沉積增加，促進(jìn)了VSMC源性FC的形成。以上研究說明，自噬在調(diào)節(jié)VSMC源性FC形成中起著難以替代的作用，但這些研究應(yīng)用的主要是體內(nèi)模型，對于體外模型仍有待于深入研究。

四、以巨自噬調(diào)控細(xì)胞泡沫化為靶點(diǎn)的AS防治策略探索

AS是一種與脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)的慢性炎癥性疾病，其特征是脂質(zhì)的異常積累和FC的大量沉積。作為AS的主要病理成分之一，F(xiàn)C的蓄積會加劇斑塊的不穩(wěn)定性，因此，抑制FC的形成可以有效預(yù)防AS和急性心血管事件的發(fā)生。大量研究表明，自噬通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝參與了FC的形成，自噬的激活可以減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累并促進(jìn)膽固醇流出，從而減緩AS的發(fā)展。Zheng等研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀通過AMPK/mTOR途徑促進(jìn)脂肪自噬來抑制FC的形成。于紅紅等研究證實(shí)，黃連解毒湯含藥血清可以通過Akt/mTOR通路激活自噬抑制M?源性FC形成，以起到抗AS作用。Ma等研究表明，毛蕊異黃素(calycosin)通過上調(diào)KLF2-MLKL介導(dǎo)的自噬來抑制ApoE小鼠AS斑塊中的細(xì)胞泡沫化，增強(qiáng)了斑塊穩(wěn)定性。另有研究發(fā)現(xiàn)，天麻素可通過激活A(yù)MPK-FoxO1-TFEB信號軸誘導(dǎo)溶酶體生物發(fā)生和細(xì)胞自噬，從而增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇外流，減少了脂質(zhì)的積聚并防止了FC的形成。此外，丁暢等在體外AS模型中研究發(fā)現(xiàn)，荷葉堿可抑制PIK/Akt/mTOR信號通路激活自噬來減少FC的形成并改善AS。值得一提的是降糖藥二甲雙胍也可以通過激活自噬對CVDS起到保護(hù)作用。近年來Wu等在小鼠AS模型中研究二甲雙胍，發(fā)現(xiàn)了其通過激活KLF2介導(dǎo)的自噬抑制細(xì)胞泡沫化來抗AS的新機(jī)制。由此可見，有較多研究支持自噬通過調(diào)控細(xì)胞泡沫化改善AS病變，并且對藥物的研究并不局限于傳統(tǒng)的抗AS藥物。

五、展 望

M?和VSMC是構(gòu)成AS病灶中的兩大主要細(xì)胞，在推動AS病程發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。此外，AS病變標(biāo)志物FC，來源于脂質(zhì)代謝失衡的M?和VSMC，F(xiàn)C的大量形成和堆疊壞死是推動AS斑塊朝不穩(wěn)定方向發(fā)展的罪魁禍?zhǔn)?。作為?xì)胞維持正常生理功能的途徑，自噬在調(diào)控FC內(nèi)脂質(zhì)運(yùn)輸，維持膽固醇穩(wěn)態(tài)方面作用顯著。因而，從細(xì)胞自噬調(diào)控M?和VSMC泡沫化的角度來探索AS的防治無疑是一個更有前景的方向。盡管在過去的幾年中，AS與自噬的報(bào)道逐漸增多，但我們對這一領(lǐng)域仍然知之甚少，還有許多問題有待于闡明。值得留意的是，自噬的激活并不總是有利于AS的治療。自噬的過度激活會導(dǎo)致FC自噬性死亡，促進(jìn)AS發(fā)展?？紤]到自噬的雙重效應(yīng)，未來需要進(jìn)一步權(quán)衡自噬對AS的抑制和促進(jìn)作用，根據(jù)AS發(fā)生、發(fā)展和病理變化的情況來精準(zhǔn)把控干預(yù)自噬的時間點(diǎn)、自噬激活的強(qiáng)度和持續(xù)時間，確保對自噬的調(diào)控總是朝著對AS病情有利的方向發(fā)展。對于治療藥物而言，目前已經(jīng)報(bào)道了許多自噬誘導(dǎo)劑對AS的有利作用，但這些藥物大都對多種細(xì)胞自噬都有調(diào)控功能，缺乏特異性。開發(fā)出安全性更高、靶向性更強(qiáng)的藥物仍然是未來藥物研發(fā)的目標(biāo)。另外，目前對于自噬的研究還主要集中在PIK/Akt/mTOR這條經(jīng)典通路上，其他通路的研究還有待于拓展?？傊?，通過干預(yù)自噬調(diào)控M?和VSMC泡沫化來防治AS及以自噬為著力點(diǎn)的藥物開發(fā)將是未來很長一段時間的研究熱點(diǎn)之一。