間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體與眼免疫性疾病

梁春蘭 師 齊 劉 蓮 鐘敬祥

眼睛是一個(gè)典型的免疫赦免區(qū)，外來移植組織或其他抗原無法被眼部免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除。眼睛有3層連續(xù)的防御機(jī)制以維持免疫赦免狀態(tài)，包括有效的血-眼屏障(包括血-房水屏障及血-視網(wǎng)膜屏障)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cell,Treg)誘導(dǎo)的眼部微環(huán)境，以及前房相關(guān)性免疫偏離。然而一旦眼睛的免疫系統(tǒng)被破壞，眼部一些免疫性疾病可能會(huì)導(dǎo)致災(zāi)難性后果。臨床上常見的眼免疫性疾病，如眼超敏反應(yīng)、角膜移植排斥反應(yīng)、自身免疫性眼病等，可嚴(yán)重地威脅人們的視力。然而目前臨床上治療眼免疫性疾病的藥物或手術(shù)療效仍有一定的局限性。

近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因其免疫調(diào)節(jié)潛力而被廣泛應(yīng)用于免疫相關(guān)疾病的實(shí)驗(yàn)與臨床研究。MSCs是具有自我更新和多向分化能力的多能干細(xì)胞，可以從許多組織中分離出來，如骨、脂肪組織、臍帶、肝臟、羊水、胎盤以及牙髓等。MSCs主要通過旁分泌細(xì)胞外囊泡的機(jī)制介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，例如釋放外泌體。幾乎所有的細(xì)胞都能分泌外泌體。MSCs像所有其他細(xì)胞一樣產(chǎn)生外泌體，但也有一些差異。MSCs是已知產(chǎn)生外泌體的細(xì)胞類型中最多產(chǎn)的。這些外泌體不僅表達(dá)共同的表面蛋白CD9、CD81，而且還特異地表達(dá)一些黏附分子，如CD29、CD44和CD73。外泌體是一種無細(xì)胞的治療方法，具有顯著的治療效益：它們易于分離、管理和存儲(chǔ)，并且不會(huì)觸發(fā)免疫排斥和成瘤的風(fēng)險(xiǎn)。與MSCs比較，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(messenchymal stem cell-derived exosomes,MSC-EXOs)具有與MSCs相似的功能。由于納米大小和脂質(zhì)雙分子層的結(jié)構(gòu)，外泌體可以很容易地通過生物屏障，進(jìn)入靶器官，從而發(fā)揮作用。MSC-EXOs也因此憑借自身優(yōu)勢(shì)發(fā)揮著細(xì)胞間通訊、物質(zhì)傳遞和免疫調(diào)節(jié)作用，推動(dòng)著納米載藥技術(shù)、基因工程等技術(shù)的發(fā)展。

一、MSC-EXOs的免疫調(diào)節(jié)作用

研究表明，不同來源的MSCs-EXOs可以有效地激活或抑制免疫反應(yīng)，調(diào)控炎性反應(yīng)、自身免疫，并參與腫瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)展。MSC-EXOs可以通過調(diào)控多種免疫細(xì)胞從而調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。例如促進(jìn)Treg分化、抑制樹突細(xì)胞的分化和成熟、抑制T淋巴細(xì)胞的增殖與活性、抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用等。

1.MSC-EXOs調(diào)節(jié)先天性免疫反應(yīng):先天性免疫在作為人體防御的第一道防線，在早期炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。MSCs可以調(diào)節(jié)多種類型的先天免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、NK細(xì)胞等。MSC-EXOs可以影響巨噬細(xì)胞的極化，即M1向M2表型的轉(zhuǎn)化。巨噬細(xì)胞是先天免疫中的重要細(xì)胞，它們至少有兩種分化形式，即M1型和M2型。促進(jìn)炎癥的M1型巨噬細(xì)胞在宿主抵御細(xì)菌和病毒感染中起著核心作用，而抗炎的M2型巨噬細(xì)胞與寄生蟲感染、組織重塑、纖維化和腫瘤疾病相關(guān)。Sun等結(jié)果表明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes,UCMSC-EXOs)可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型極化，抑制炎癥，促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)。類似地，Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(adipose stem cell-derived exosomes,ADSC-EXOs)可以通過攜帶的活性STAT3來減少巨噬細(xì)胞極化為M2型。NK細(xì)胞是先天免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，可有效介導(dǎo)在炎性反應(yīng)中殺死腫瘤細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫。目前關(guān)于MSC-EXOs與NK細(xì)胞相互作用的研究較少。Spaggiari等研究表明，MSCs在IL-2誘導(dǎo)下的可以抑制靜息狀態(tài)時(shí)NK細(xì)胞的增殖，而對(duì)激活狀態(tài)時(shí)的NK細(xì)胞無效。然而，活化的NK細(xì)胞可以有效降解MSCs，這在應(yīng)用MSCs治療移植物抗宿主病時(shí)應(yīng)予以考慮。MSCs/MSC-EXOs可以調(diào)控先天性免疫細(xì)胞，同樣地免疫細(xì)胞也可能影響前者的功能，兩者相互作用?？梢?，MSCs/MSC-EXOs與先天免疫細(xì)胞之間的免疫調(diào)控機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜。

2.MSC-EXOs調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)：適應(yīng)性免疫指后天獲得的，是淋巴細(xì)胞在特定抗原刺激下做出的特異性反應(yīng)，主要包括細(xì)胞免疫和體液免疫。T淋巴細(xì)胞是參與細(xì)胞免疫的淋巴細(xì)胞，受抗原刺激并轉(zhuǎn)化為淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞中有許多亞群，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)、抑制T細(xì)胞(Ts)、Treg和輔助T細(xì)胞(Th)等。研究數(shù)據(jù)表明，T淋巴細(xì)胞在許多自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。MSCs-EXOs可影響T淋巴細(xì)胞的分化和功能調(diào)控。ADSC-EXOs可以抑制T淋巴細(xì)胞的分化、激活、增殖，以及促炎性細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes,BMSC-EXOs)可誘導(dǎo)Th1轉(zhuǎn)化為Th2，顯著降低促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的水平，提高抗炎性細(xì)胞因子TGF-β的水平。B淋巴細(xì)胞也是重要的適應(yīng)性免疫細(xì)胞，它介導(dǎo)體液免疫和分泌抗體。MSCs-EXOs可影響B(tài)淋巴細(xì)胞的狀態(tài)和功能。Khare等將BMSC-EXOs和外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)BMSC-EXOs通過調(diào)控活化B淋巴細(xì)胞mRNA可顯著抑制B淋巴細(xì)胞的增殖、成熟，從而影響B(tài)淋巴細(xì)胞的功能。

二、眼免疫學(xué)疾病與MSC-EXOs的關(guān)系

鑒于目前來源于骨髓、脂肪及臍帶組織的MSC-EXOs被廣泛地研究，本文重點(diǎn)總結(jié)了BMSC-EXOs、ADSC-EXOs、UCMSC-EXOs在眼免疫性疾病的研究進(jìn)展，包括干燥綜合征角膜結(jié)膜炎、自身免疫性葡萄炎和同種異體角膜移植排斥反應(yīng)。此外，一些可能與免疫相關(guān)的疾病也引起了越來越多的關(guān)注。年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)、青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和其他與年齡相關(guān)的退行性眼病，被認(rèn)為有很強(qiáng)的免疫學(xué)基礎(chǔ)。

1.免疫相關(guān)性淚腺疾?。簻I腺是眼部分泌免疫系統(tǒng)的主要組織。干燥綜合征是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，具有外分泌腺和黏膜上皮淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和特異性自身抗體的特征，可引起眼干和口干。干燥綜合征的發(fā)病機(jī)制是由Th1/Th17細(xì)胞和異常的Treg引起的免疫失衡，包括大量的B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集。巨噬細(xì)胞表型M1/M2極化在慢性炎癥的過程中起著關(guān)鍵作用。Lu等研究表明，UCMSC可有效抑制兔模型中干燥綜合征角膜結(jié)膜炎的炎癥，從而恢復(fù)淚腺功能。這種效應(yīng)可能部分歸因于蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)通路的激活，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為抗炎M2表型，抑制巨噬細(xì)胞相關(guān)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的分泌，增加抗炎性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β的表達(dá)。

MSCs-EXOs可以通過Treg來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)能力。另有研究分別使用BMSC和BMSC-EXOs治療干燥綜合征的模型小鼠。研究表明，BMSC和BMSC-EXOs治療：①成功地保留了小鼠唾液腺和淚腺的功能；②通過誘導(dǎo)病變周圍更多的T淋巴細(xì)胞、下調(diào)TNF-α、IL-1β和上調(diào)IL-10來調(diào)節(jié)免疫；③與BMSC治療比較，BMSC-EXOs具有安全性、生物利用度高、使用方便等優(yōu)勢(shì)。

2.同種異體角膜移植排斥：角膜移植是全球常見的移植形式，由于角膜無血管和淋巴管的特性，角膜作為移植組織具有相對(duì)的免疫特權(quán)。有研究報(bào)道，角膜移植失敗的主要原因是同種異體移植排斥反應(yīng)，其中抗炎Treg在識(shí)別同種異體抗原和促進(jìn)移植耐受性方面發(fā)揮重要作用。目前對(duì)角膜移植排斥反應(yīng)的藥物治療并不理想。Lu等把BMSC注射到大鼠的結(jié)膜下，發(fā)現(xiàn)角膜移植的存活率和透明度提高，水腫以及新生血管減少，這可能是由于CD4細(xì)胞和CD68巨噬細(xì)胞減少，抗炎Treg的增加有關(guān)。有證據(jù)表明同種異體的移植物釋放的外泌體可以用于延長(zhǎng)異體移植的存活率。然而，MSC-EXOs在角膜移植模型中療效仍然缺乏直接證據(jù)。

3.免疫相關(guān)的葡萄膜疾?。浩咸涯ぱ资强蓪?dǎo)致失明的眼科疾病。雖然葡萄膜炎早期階段的病因可能存在差異(特別是感染性和非感染性葡萄膜炎之間的區(qū)別)，但這是由一種快速、常見的炎癥途徑引起的，導(dǎo)致多種常見的臨床表現(xiàn)。對(duì)于非感染性葡萄膜炎，如自身免疫性葡萄膜炎，是一種由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。Xie等在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)的小鼠模型中探究了BMSC-EXOs的作用，表明BMSC-EXOs通過下調(diào)TH1、TH17、Treg、抑制T淋巴細(xì)胞增殖，從而減輕EAU的臨床及病理表現(xiàn)。但是Bai等通過在EAU的小鼠眼周注射UCMSC-EXOs，結(jié)果顯示UCMSC-EXOs通過抑制白細(xì)胞遷移發(fā)揮治療作用。然而，他們沒有觀察到UCMSC-EXOs對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用，并表明UCMSC-EXOs抑制自身免疫反應(yīng)炎癥的機(jī)制并不依賴于T淋巴細(xì)胞抑制和凋亡誘導(dǎo)。如上所述，BMSC-EXOs和UCMSC-EXOs在EAU的小鼠模型中的分子機(jī)制似乎有很大的差別。筆者推測(cè)這種差異可能歸因于MSC-EXOs組織來源上的差異造成不同的微環(huán)境。從不同來源MSC-EXOs的治療潛力，特別是其抗炎和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，仍有待于進(jìn)一步研究。

4.其他潛在的免疫相關(guān)眼?。呵喙庋凼且环N常見的與年齡相關(guān)的視神經(jīng)疾病，是世界范圍內(nèi)失明的主要原因。一種自身免疫成分參與了青光眼的發(fā)病機(jī)制，而最直接的證據(jù)是在患者青光眼視網(wǎng)膜中檢測(cè)到IgG抗體沉積。T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在青光眼的進(jìn)展中相互作用。研究表明，MSCs可能是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞保護(hù)的潛在治療方法。Pan等研究表明，UCMSC-EXOs通過促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活和膠質(zhì)細(xì)胞的活化而不是軸突再生，在神經(jīng)保護(hù)中至關(guān)重要。值得注意的是，自身免疫與青光眼之間的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議。能否將青光眼亞型歸類為自身免疫性青光眼，仍有待于進(jìn)一步研究。

老年性黃斑變性(age-relatedmacular-degeneration,AMD)是一種進(jìn)行性致盲疾病，是50歲以上不可逆轉(zhuǎn)失明的主要原因。AMD的病理損傷積累視網(wǎng)膜色素上皮和Bruch膜，可導(dǎo)致晚期光感受器變性、玻璃膜疣樣變性，地圖樣萎縮(干性/萎縮性)和脈絡(luò)膜新生血管(濕性/新生血管性)。臨床上針對(duì)濕性AMD患者主要采用玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的藥物,費(fèi)用較高且需患者較好的依從性進(jìn)行多次藥物注射。研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EXOs顯著抑制VEGF表達(dá)和分泌，且呈劑量依賴性。以上證據(jù)可以使筆者進(jìn)一步了解AMD的病理情況，也可以為治療AMD提供新的思路。

三、展 望

MSCs與MSC-EXOs比較，兩種方式各有優(yōu)缺點(diǎn)，例如MSCs可以直接運(yùn)用于研究中，無需額外的分離和純化步驟。但MSC-EXOs是一種無細(xì)胞的治療方法，仍然具有一定的優(yōu)勢(shì)。目前MSCs常見的組織來源有骨髓、脂肪和臍帶等，因此本文重點(diǎn)綜述了BMSC-EXOs、ADSC-EXOs、UCMSC-EXOs在干燥綜合征角膜結(jié)膜炎、同種移植角膜移植排斥反應(yīng)和自身免疫性葡萄膜炎的研究進(jìn)展。有趣的是，使用不同來源的MSCs或MSC-EXOs的不同研究在相似疾病模型中具有不同的分子機(jī)制，但均表明MSCs或MSC-EXOs具有一定的療效。然而，MSCs或MSC-EXOs的免疫機(jī)制尚不完全清楚。不同組織來源MSC-EXOs的含量、免疫調(diào)節(jié)能力、分泌細(xì)胞因子譜等方面的差異是否對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果或結(jié)論產(chǎn)生影響，在今后的研究中仍需保持謹(jǐn)慎的態(tài)度。此外，除了不同的組織來源，實(shí)驗(yàn)中外泌體不同的分離方法、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境、建模引起的不同微環(huán)境、患者與動(dòng)物疾病模型之間的區(qū)別等因素也同樣值得注意。MSC-EXOs治療不同疾病的基礎(chǔ)方法尚不明確，最佳的MSCs來源、給藥方式、劑量、臨床的有效性及安全性等仍有待于進(jìn)一步探索。否則，可能無法在臨床上發(fā)揮MSC-EXOs的真正治療潛力。