間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體與眼免疫性疾病

梁春蘭 師 齊 劉 蓮 鐘敬祥

眼睛是一個典型的免疫赦免區(qū)，外來移植組織或其他抗原無法被眼部免疫系統(tǒng)識別和清除。眼睛有3層連續(xù)的防御機(jī)制以維持免疫赦免狀態(tài)，包括有效的血-眼屏障(包括血-房水屏障及血-視網(wǎng)膜屏障)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cell,Treg)誘導(dǎo)的眼部微環(huán)境，以及前房相關(guān)性免疫偏離。然而一旦眼睛的免疫系統(tǒng)被破壞，眼部一些免疫性疾病可能會導(dǎo)致災(zāi)難性后果。臨床上常見的眼免疫性疾病，如眼超敏反應(yīng)、角膜移植排斥反應(yīng)、自身免疫性眼病等，可嚴(yán)重地威脅人們的視力。然而目前臨床上治療眼免疫性疾病的藥物或手術(shù)療效仍有一定的局限性。

近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因其免疫調(diào)節(jié)潛力而被廣泛應(yīng)用于免疫相關(guān)疾病的實驗與臨床研究。MSCs是具有自我更新和多向分化能力的多能干細(xì)胞，可以從許多組織中分離出來，如骨、脂肪組織、臍帶、肝臟、羊水、胎盤以及牙髓等。MSCs主要通過旁分泌細(xì)胞外囊泡的機(jī)制介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，例如釋放外泌體。幾乎所有的細(xì)胞都能分泌外泌體。MSCs像所有其他細(xì)胞一樣產(chǎn)生外泌體，但也有一些差異。MSCs是已知產(chǎn)生外泌體的細(xì)胞類型中最多產(chǎn)的。這些外泌體不僅表達(dá)共同的表面蛋白CD9、CD81，而且還特異地表達(dá)一些黏附分子，如CD29、CD44和CD73。外泌體是一種無細(xì)胞的治療方法，具有顯著的治療效益：它們易于分離、管理和存儲，并且不會觸發(fā)免疫排斥和成瘤的風(fēng)險。與MSCs比較，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(messenchymal stem cell-derived exosomes,MSC-EXOs)具有與MSCs相似的功能。由于納米大小和脂質(zhì)雙分子層的結(jié)構(gòu)，外泌體可以很容易地通過生物屏障，進(jìn)入靶器官，從而發(fā)揮作用。MSC-EXOs也因此憑借自身優(yōu)勢發(fā)揮著細(xì)胞間通訊、物質(zhì)傳遞和免疫調(diào)節(jié)作用，推動著納米載藥技術(shù)、基因工程等技術(shù)的發(fā)展。

一、MSC-EXOs的免疫調(diào)節(jié)作用

研究表明，不同來源的MSCs-EXOs可以有效地激活或抑制免疫反應(yīng)，調(diào)控炎性反應(yīng)、自身免疫，并參與腫瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)展。MSC-EXOs可以通過調(diào)控多種免疫細(xì)胞從而調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。例如促進(jìn)Treg分化、抑制樹突細(xì)胞的分化和成熟、抑制T淋巴細(xì)胞的增殖與活性、抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用等。

1.MSC-EXOs調(diào)節(jié)先天性免疫反應(yīng):先天性免疫在作為人體防御的第一道防線，在早期炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。MSCs可以調(diào)節(jié)多種類型的先天免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、NK細(xì)胞等。MSC-EXOs可以影響巨噬細(xì)胞的極化，即M1向M2表型的轉(zhuǎn)化。巨噬細(xì)胞是先天免疫中的重要細(xì)胞，它們至少有兩種分化形式，即M1型和M2型。促進(jìn)炎癥的M1型巨噬細(xì)胞在宿主抵御細(xì)菌和病毒感染中起著核心作用，而抗炎的M2型巨噬細(xì)胞與寄生蟲感染、組織重塑、纖維化和腫瘤疾病相關(guān)。Sun等結(jié)果表明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes,UCMSC-EXOs)可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型極化，抑制炎癥，促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)。類似地，Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(adipose stem cell-derived exosomes,ADSC-EXOs)可以通過攜帶的活性STAT3來減少巨噬細(xì)胞極化為M2型。NK細(xì)胞是先天免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，可有效介導(dǎo)在炎性反應(yīng)中殺死腫瘤細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫。目前關(guān)于MSC-EXOs與NK細(xì)胞相互作用的研究較少。Spaggiari等研究表明，MSCs在IL-2誘導(dǎo)下的可以抑制靜息狀態(tài)時NK細(xì)胞的增殖，而對激活狀態(tài)時的NK細(xì)胞無效。然而，活化的NK細(xì)胞可以有效降解MSCs，這在應(yīng)用MSCs治療移植物抗宿主病時應(yīng)予以考慮。MSCs/MSC-EXOs可以調(diào)控先天性免疫細(xì)胞，同樣地免疫細(xì)胞也可能影響前者的功能，兩者相互作用?？梢?，MSCs/MSC-EXOs與先天免疫細(xì)胞之間的免疫調(diào)控機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜。

2.MSC-EXOs調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)：適應(yīng)性免疫指后天獲得的，是淋巴細(xì)胞在特定抗原刺激下做出的特異性反應(yīng)，主要包括細(xì)胞免疫和體液免疫。T淋巴細(xì)胞是參與細(xì)胞免疫的淋巴細(xì)胞，受抗原刺激并轉(zhuǎn)化為淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞中有許多亞群，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)、抑制T細(xì)胞(Ts)、Treg和輔助T細(xì)胞(Th)等。研究數(shù)據(jù)表明，T淋巴細(xì)胞在許多自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。MSCs-EXOs可影響T淋巴細(xì)胞的分化和功能調(diào)控。ADSC-EXOs可以抑制T淋巴細(xì)胞的分化、激活、增殖，以及促炎性細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes,BMSC-EXOs)可誘導(dǎo)Th1轉(zhuǎn)化為Th2，顯著降低促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的水平，提高抗炎性細(xì)胞因子TGF-β的水平。B淋巴細(xì)胞也是重要的適應(yīng)性免疫細(xì)胞，它介導(dǎo)體液免疫和分泌抗體。MSCs-EXOs可影響B(tài)淋巴細(xì)胞的狀態(tài)和功能。Khare等將BMSC-EXOs和外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)BMSC-EXOs通過調(diào)控活化B淋巴細(xì)胞mRNA可顯著抑制B淋巴細(xì)胞的增殖、成熟，從而影響B(tài)淋巴細(xì)胞的功能。

二、眼免疫學(xué)疾病與MSC-EXOs的關(guān)系

鑒于目前來源于骨髓、脂肪及臍帶組織的MSC-EXOs被廣泛地研究，本文重點總結(jié)了BMSC-EXOs、ADSC-EXOs、UCMSC-EXOs在眼免疫性疾病的研究進(jìn)展，包括干燥綜合征角膜結(jié)膜炎、自身免疫性葡萄炎和同種異體角膜移植排斥反應(yīng)。此外，一些可能與免疫相關(guān)的疾病也引起了越來越多的關(guān)注。年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)、青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和其他與年齡相關(guān)的退行性眼病，被認(rèn)為有很強(qiáng)的免疫學(xué)基礎(chǔ)。

1.免疫相關(guān)性淚腺疾?。簻I腺是眼部分泌免疫系統(tǒng)的主要組織。干燥綜合征是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，具有外分泌腺和黏膜上皮淋巴細(xì)胞浸潤和特異性自身抗體的特征，可引起眼干和口干。干燥綜合征的發(fā)病機(jī)制是由Th1/Th17細(xì)胞和異常的Treg引起的免疫失衡，包括大量的B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集。巨噬細(xì)胞表型M1/M2極化在慢性炎癥的過程中起著關(guān)鍵作用。Lu等研究表明，UCMSC可有效抑制兔模型中干燥綜合征角膜結(jié)膜炎的炎癥，從而恢復(fù)淚腺功能。這種效應(yīng)可能部分歸因于蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)通路的激活，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為抗炎M2表型，抑制巨噬細(xì)胞相關(guān)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的分泌，增加抗炎性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β的表達(dá)。

MSCs-EXOs可以通過Treg來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)能力。另有研究分別使用BMSC和BMSC-EXOs治療干燥綜合征的模型小鼠。研究表明，BMSC和BMSC-EXOs治療：①成功地保留了小鼠唾液腺和淚腺的功能；②通過誘導(dǎo)病變周圍更多的T淋巴細(xì)胞、下調(diào)TNF-α、IL-1β和上調(diào)IL-10來調(diào)節(jié)免疫；③與BMSC治療比較，BMSC-EXOs具有安全性、生物利用度高、使用方便等優(yōu)勢。

2.同種異體角膜移植排斥：角膜移植是全球常見的移植形式，由于角膜無血管和淋巴管的特性，角膜作為移植組織具有相對的免疫特權(quán)。有研究報道，角膜移植失敗的主要原因是同種異體移植排斥反應(yīng)，其中抗炎Treg在識別同種異體抗原和促進(jìn)移植耐受性方面發(fā)揮重要作用。目前對角膜移植排斥反應(yīng)的藥物治療并不理想。Lu等把BMSC注射到大鼠的結(jié)膜下，發(fā)現(xiàn)角膜移植的存活率和透明度提高，水腫以及新生血管減少，這可能是由于CD4細(xì)胞和CD68巨噬細(xì)胞減少，抗炎Treg的增加有關(guān)。有證據(jù)表明同種異體的移植物釋放的外泌體可以用于延長異體移植的存活率。然而，MSC-EXOs在角膜移植模型中療效仍然缺乏直接證據(jù)。

3.免疫相關(guān)的葡萄膜疾?。浩咸涯ぱ资强蓪?dǎo)致失明的眼科疾病。雖然葡萄膜炎早期階段的病因可能存在差異(特別是感染性和非感染性葡萄膜炎之間的區(qū)別)，但這是由一種快速、常見的炎癥途徑引起的，導(dǎo)致多種常見的臨床表現(xiàn)。對于非感染性葡萄膜炎，如自身免疫性葡萄膜炎，是一種由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。Xie等在實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)的小鼠模型中探究了BMSC-EXOs的作用，表明BMSC-EXOs通過下調(diào)TH1、TH17、Treg、抑制T淋巴細(xì)胞增殖，從而減輕EAU的臨床及病理表現(xiàn)。但是Bai等通過在EAU的小鼠眼周注射UCMSC-EXOs，結(jié)果顯示UCMSC-EXOs通過抑制白細(xì)胞遷移發(fā)揮治療作用。然而，他們沒有觀察到UCMSC-EXOs對T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用，并表明UCMSC-EXOs抑制自身免疫反應(yīng)炎癥的機(jī)制并不依賴于T淋巴細(xì)胞抑制和凋亡誘導(dǎo)。如上所述，BMSC-EXOs和UCMSC-EXOs在EAU的小鼠模型中的分子機(jī)制似乎有很大的差別。筆者推測這種差異可能歸因于MSC-EXOs組織來源上的差異造成不同的微環(huán)境。從不同來源MSC-EXOs的治療潛力，特別是其抗炎和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，仍有待于進(jìn)一步研究。

4.其他潛在的免疫相關(guān)眼病：青光眼是一種常見的與年齡相關(guān)的視神經(jīng)疾病，是世界范圍內(nèi)失明的主要原因。一種自身免疫成分參與了青光眼的發(fā)病機(jī)制，而最直接的證據(jù)是在患者青光眼視網(wǎng)膜中檢測到IgG抗體沉積。T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在青光眼的進(jìn)展中相互作用。研究表明，MSCs可能是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞保護(hù)的潛在治療方法。Pan等研究表明，UCMSC-EXOs通過促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活和膠質(zhì)細(xì)胞的活化而不是軸突再生，在神經(jīng)保護(hù)中至關(guān)重要。值得注意的是，自身免疫與青光眼之間的關(guān)系仍存在爭議。能否將青光眼亞型歸類為自身免疫性青光眼，仍有待于進(jìn)一步研究。

老年性黃斑變性(age-relatedmacular-degeneration,AMD)是一種進(jìn)行性致盲疾病，是50歲以上不可逆轉(zhuǎn)失明的主要原因。AMD的病理損傷積累視網(wǎng)膜色素上皮和Bruch膜，可導(dǎo)致晚期光感受器變性、玻璃膜疣樣變性，地圖樣萎縮(干性/萎縮性)和脈絡(luò)膜新生血管(濕性/新生血管性)。臨床上針對濕性AMD患者主要采用玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的藥物,費(fèi)用較高且需患者較好的依從性進(jìn)行多次藥物注射。研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EXOs顯著抑制VEGF表達(dá)和分泌，且呈劑量依賴性。以上證據(jù)可以使筆者進(jìn)一步了解AMD的病理情況，也可以為治療AMD提供新的思路。

三、展 望

MSCs與MSC-EXOs比較，兩種方式各有優(yōu)缺點，例如MSCs可以直接運(yùn)用于研究中，無需額外的分離和純化步驟。但MSC-EXOs是一種無細(xì)胞的治療方法，仍然具有一定的優(yōu)勢。目前MSCs常見的組織來源有骨髓、脂肪和臍帶等，因此本文重點綜述了BMSC-EXOs、ADSC-EXOs、UCMSC-EXOs在干燥綜合征角膜結(jié)膜炎、同種移植角膜移植排斥反應(yīng)和自身免疫性葡萄膜炎的研究進(jìn)展。有趣的是，使用不同來源的MSCs或MSC-EXOs的不同研究在相似疾病模型中具有不同的分子機(jī)制，但均表明MSCs或MSC-EXOs具有一定的療效。然而，MSCs或MSC-EXOs的免疫機(jī)制尚不完全清楚。不同組織來源MSC-EXOs的含量、免疫調(diào)節(jié)能力、分泌細(xì)胞因子譜等方面的差異是否對實驗結(jié)果或結(jié)論產(chǎn)生影響，在今后的研究中仍需保持謹(jǐn)慎的態(tài)度。此外，除了不同的組織來源，實驗中外泌體不同的分離方法、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境、建模引起的不同微環(huán)境、患者與動物疾病模型之間的區(qū)別等因素也同樣值得注意。MSC-EXOs治療不同疾病的基礎(chǔ)方法尚不明確，最佳的MSCs來源、給藥方式、劑量、臨床的有效性及安全性等仍有待于進(jìn)一步探索。否則，可能無法在臨床上發(fā)揮MSC-EXOs的真正治療潛力。