具有抑菌活性植物乳桿菌細菌素生物穩(wěn)定性研究

王虹軍，田 星，陳芝娟

（杭州博日科技股份有限公司，浙江 杭州 310053）

乳酸菌是具有十分重要的益生功能的微生物，在其自身生長過程中能夠代謝產(chǎn)生乳酸，改善過敏人群對乳制品的乳糖不耐癥，還可以顯著促進人體消化吸收能力，防止便秘[1]。乳酸菌對食品感官品質(zhì)的提高也具有非常重要的作用，可以改善食品風味[2]。另外乳酸菌的代謝產(chǎn)物如有機酸、過氧化氫和細菌素等，能對引起食品腐敗變質(zhì)的微生物產(chǎn)生抑制作用[3]。因此，乳酸菌可作為益生菌被廣泛地應用于食品工業(yè)中[4-5]。近年來，關(guān)于乳酸菌在不同行業(yè)、不同領域應用的研究越來越多，而且乳酸菌的其他生理功能也正在被進一步地開發(fā)利用。

現(xiàn)代社會消費者對食品安全問題關(guān)注度越來越高，尤其是防腐劑的使用。因此，開發(fā)無毒副作用、無化學殘留、能夠延長食品的儲存期的生物防腐劑代替化學防腐劑的使用，是食品安全領域一個亟待解決的問題[6]。目前食品生產(chǎn)過程中，化學防腐劑的使用更加地普遍，但添加化學防腐劑可能導致食品原有風味的變化，也可能會危害人體健康。因此，從天然產(chǎn)物中獲取安全無害的抑菌劑從而抑制腐敗微生物引起的食品變質(zhì)問題成為確保食品安全和貨架壽命的創(chuàng)新途徑。而乳酸菌在生長過程中的一些代謝產(chǎn)物如細菌素等具有較好的抑菌作用，因此乳酸菌成為具有潛在研究價值的無公害防腐劑[7]。

細菌素是乳酸菌在生長過程中代謝產(chǎn)生的能夠抑制多種微生物的物質(zhì)[8]。它成本低，生產(chǎn)快速，可對食物腐敗菌起到抑制或殺滅作用，因此在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥中作用廣泛。細菌素大多數(shù)都具有無污染、無毒副作用及無抗藥性的特征[9]，在今后發(fā)展過程中有取代抗生素的趨勢。細菌素一般對熱、酸堿、紫外的作用不敏感，但對各種蛋白酶的作用比較敏感[10]。細菌素作為一種生物防腐劑，可以不同程度上抑制一些革蘭氏陽性致病細菌及革蘭氏陰性致病細菌的生長，代替化學防腐劑在食品中的使用，不僅可以大大降低對環(huán)境的污染，又能增加食品的安全性，從而獲得安全可靠的食品[11-12]。雖然細菌素有較好的抑菌作用，但是微生物產(chǎn)細菌素的量非常少，投資成本較高，而且在實際的生產(chǎn)應用中效果也不穩(wěn)定，極易受到其他環(huán)境和條件的影響，這些情況嚴重影響到細菌素的應用13-16]。

本試驗是以植物乳桿菌為試用菌株，測定其所產(chǎn)的細菌素在不同溫度、pH、蛋白酶以及紫外線4種不同因素的處理下對大腸桿菌的抑菌效果，為促進乳酸菌細菌素在不同領域、不同行業(yè)的研究與應用尤其是在食品中替代化學防腐劑應用方面提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌由中國計量大學生命科技學院食品系提供。

液體MRS培養(yǎng)基（1 L）：酵母浸粉5 g、葡萄糖20 g、牛肉膏10 g、檸檬酸氫二銨2 g、硫酸鎂0.58 g、胰蛋白胨10 g、磷酸氫二鉀2 g、吐溫80 1 mL、硫酸錳0.25 g、瓊脂25 g、無水乙酸鈉5 g、pH 6.2～6.6，121 ℃滅菌30 min。

固體MRS培養(yǎng)基（1 L）：在液體培養(yǎng)基的基礎上加入25 g瓊脂。

液體LB培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母浸粉5 g、pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。

固體LB培養(yǎng)基（1 L）：在液體培養(yǎng)基的基礎上再加18 g瓊脂。

胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、蛋白酶K、堿性蛋白酶均產(chǎn)自上海億欣生物科技有限公司。乙酸乙酯、乳酸、乙酸均為分析純。

1.2 儀器與設備

HeraguardTMECO超凈工作臺，美國Thermo Fisher公司；70F23N1P-M8（S0）型微波爐，廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司；HH-S4 型電子數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金怡科技有限公司；UV5型紫外可見分光光度計，瑞士Mettler Toledo 公司；YXO-LS-50G 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；PHSJ-6L 型pH 計，上海儀電科學儀器有限公司；SorvaII ST1/ST4F PLUS 型離心機，美國Thermo Fisher 公司；902型超低溫冰箱，美國Thermo Fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵上清液的制備

取保藏在-80 ℃的冰箱中的植物乳桿菌菌種，平板劃線于固體MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯單菌落。挑選合適大小的單菌落，37 ℃恒溫條件下在液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，然后在50 mL MRS液體培養(yǎng)基中接種1%的培養(yǎng)液，置于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)18 h后取出，在冷凍離心機中離心（參數(shù)為離心溫度4 ℃，轉(zhuǎn)速8000 r/min，離心時間15 min），離心完成后分離上清液過0.22 μm濾膜，置于4 ℃冰箱中保藏備用，將離心得到的沉淀棄去。

1.3.2 抑菌活性測定

指示菌菌液的制備[17]：以大腸桿菌作為指示的菌種，按1%的接種量接種到液體LB培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫條件下過夜培養(yǎng)，備用。

產(chǎn)細菌素能力的測定參照董春嗜酸乳桿菌產(chǎn)細菌素能力的測定[18]。按照指示菌菌液的制備步驟得到大腸桿菌發(fā)酵液，吸取200 μL大腸桿菌的菌液涂布于LB平板上，烘干后打孔。吸取100 μL植物乳桿菌的發(fā)酵上清液加入孔內(nèi)，37 ℃倒置培養(yǎng)8 h，測量抑菌圈直徑的大小。

1.3.3 抑菌物質(zhì)排除試驗

過氧化氫排除試驗：取2 mL 植物乳桿菌細菌素的發(fā)酵上清液，先用NaOH 溶液（1 mol/L）或HCl 溶液（1 mol/L）將植物乳桿菌發(fā)酵上清液pH值調(diào)至7.0，再加入10 mg過氧化氫酶，在37 ℃水浴中靜置2 h后，再將pH調(diào)回5.0。通過牛津杯法測試其抑菌效果[19]。

有機酸排除試驗：取2 mL 植物乳桿菌發(fā)酵上清液，用NaOH 溶液（1 mol/L）或HCl 溶液（1 mol/L）將植物乳桿菌發(fā)酵上清液pH值調(diào)至5.0。同時用乳酸、乙酸調(diào)節(jié)空白培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）至pH為5.0作為空白對照，通過牛津杯法測試其抑菌效果[19]。

1.3.4 細菌素粗提取

用乙酸乙酯對植物乳桿菌細菌素萃取后進行旋蒸，可得植物乳桿菌細菌素粗提液。具體步驟如下：將植物乳桿菌發(fā)酵上清液與乙酸乙酯按1∶1比例充分混合均勻，置于萃取瓶中靜止萃取1 h，然后將上層溶液取出再加入相同體積的乙酸乙酯繼續(xù)萃取1 h，將2次萃取的上層溶液混在一起置于薄膜蒸發(fā)器中進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，溫度為50 ℃，時間為15 min，用pH 6.8的PBS緩沖液溶液旋蒸產(chǎn)物（緩沖液與發(fā)酵液比例為1∶100）。

1.3.5 細菌素穩(wěn)定性測定

熱穩(wěn)定性測定：取8等份已經(jīng)制備好的植物乳桿菌細菌素粗提液置于10 mL離心管中，將離心管分別置于-80 ℃、-20 ℃、4 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100℃、121 ℃不同的溫度下靜置30 min，取出置于室溫30 min后測定細菌素粗提液的抑菌活性，室溫狀態(tài)下未被處理的細菌素粗提液為對照，確定該植物乳桿菌細菌素的熱穩(wěn)定性。

pH值穩(wěn)定性測定：采用NaOH和HCl溶液（濃度均為1 mol/L）分別調(diào)節(jié)細菌素粗提液pH為3、4、5、6、7、8，室溫下靜置24 h后再用NaOH 和HCl 溶液調(diào)回至細菌素粗提液的初始pH，測定不同pH處理下細菌素的抑菌活性，以未處理的細菌素粗提取物作為對照，抑菌活性測定采用牛津杯法測定，確定植物乳桿菌細菌素的pH 穩(wěn)定性。

酶的穩(wěn)定性測定：取6份2 mL的細菌素的粗提物，添加10 mg蛋白酶K、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶，混勻，用NaOH和HCl溶液（濃度均為1 mol/L）將細菌素粗提液的pH分別調(diào)節(jié)至蛋白酶K、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶的最適pH，在37 ℃水浴條件下處理1 h，取出置于室溫下24 h，再將pH調(diào)回細菌素粗提液的初始值，測定不同蛋白酶處理下的抑菌活性，以不加蛋白酶處理的細菌素粗提取物作為對照[20]。

紫外穩(wěn)定性測定：取等量的6 份細菌素粗提液分裝于不同的試管中，于紫外光下分別照射0.25 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h，并以不用紫外光照射的粗提液為對照，以大腸桿菌為指示菌，進行抑菌試驗。比較不同紫外條件處理下細菌素抑菌效果的變化情況，確定該細菌素的紫外穩(wěn)定性[21]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實驗做3次平行，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0軟件進行，試驗結(jié)果采用平均值±標準偏差表示，P＜0.05表示數(shù)據(jù)之間存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌物質(zhì)排除

植物乳桿菌發(fā)酵過程除了產(chǎn)生細菌素外，還有可能產(chǎn)生有機酸、過氧化氫等其他物質(zhì)抑菌物質(zhì)。所以在確定抑菌物質(zhì)時要排除有機酸和過氧化氫的干擾。通過試驗得到表1結(jié)果。MRS培養(yǎng)基添加乳酸和乙酸后均沒有出現(xiàn)抑菌圈，說明乳酸和乙酸沒有抑菌作用，可以排除其影響；加入過氧化氫酶處理的植物乳桿菌發(fā)酵上清液抑菌圈直徑小于植物乳桿菌發(fā)酵上清液，所以可以說明其主要抑菌作用的物質(zhì)不是過氧化氫[22]，可排除過氧化氫的干擾。

表1 有機酸及過氧化氫作用的排除Table 1 Elimination of organic acids and hydrogen peroxide

2.2 植物乳桿菌細菌素穩(wěn)定性

植物乳桿菌細菌素粗體液的熱穩(wěn)定性、pH 值穩(wěn)定性、酶的穩(wěn)定性測定、紫外穩(wěn)定性測定的結(jié)果如圖2所示。

細菌素粗提液在不同溫度下處理后，以大腸桿菌被用作指示菌做抑菌測試，結(jié)果示于圖1A中。結(jié)果顯示：在經(jīng)過-80 ℃處理后其抑菌效果比室溫對照的抑菌效果好。在經(jīng)過121℃處理30 min后，植物乳桿菌細菌素粗提液保留81%的抑菌效果，說明植物乳桿菌細菌素熱穩(wěn)定性較好。

圖1 植物乳桿菌細菌素穩(wěn)定性Figure 1 stability of lactobacillus plantarum bacteriocin

植物乳桿菌細菌素的原始pH為2.0。將粗提液經(jīng)不同的pH處理后，結(jié)果如圖1B所示，植物乳桿菌細菌素的抗菌活性逐漸隨pH 值的增加而降低。當pH 為6.0 和7.0 時，該細菌素的抑菌圈直徑分別為20 和19.5 mm，抑菌圈直徑?jīng)]有顯著變化，說明在酸性和中性條件下，植物乳桿菌產(chǎn)生的細菌素穩(wěn)定。在pH為8.0時仍保留69%的抑菌活性，說明該細菌素具有較為廣泛的pH適用范圍。

將粗提液經(jīng)幾種不同的蛋白酶處理后，抑菌效果結(jié)果如圖1C所示。植物乳桿菌細菌素被6種蛋白酶處理過后，發(fā)現(xiàn)其抑菌活性均有不同程度的減小，證明其對蛋白酶有不同程度的敏感性。植物乳桿菌細菌素在經(jīng)過胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶及蛋白酶K的處理后，抑菌活性分別保留84%、98%、67%、91%、88%和98%，說明植物乳桿菌細菌素對蛋白酶K和堿性蛋白酶最不敏感，對胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶較為敏感，對中性蛋白酶最為敏感。

將植物乳桿菌細菌素粗提液在不同的紫外照射時長處理后，抑菌結(jié)果如圖1D所示。經(jīng)過紫外線的照射，植物乳桿菌細菌素抑菌活性明顯較小，且試驗結(jié)果整體上呈現(xiàn)出隨著紫外照射時間的升高抑菌活性逐漸降低的趨勢。在經(jīng)過紫外照射0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 h 后，抑菌活性分別保留94%、92%、90%、87%、83%。在經(jīng)過紫外照射2 h后，該細菌素依然保留83%的抑菌效果，說明植物乳桿菌細菌素紫外穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

本試驗表明植物乳桿菌具有產(chǎn)細菌素能力，且其細菌素的穩(wěn)定性較好。去除有機酸和過氧化氫的影響后，植物乳桿菌發(fā)酵液仍具有抗菌活性。將乙酸乙酯萃取法得到的植物乳桿菌細菌素粗提液進行抑菌性試驗和生物學特性研究，證明植物乳桿菌細菌素不僅具有良好的抑菌效果，而且對溫度的變化、pH的變化、紫外照射等條件不敏感，穩(wěn)定性較強，但對部分蛋白酶敏感。植物乳桿菌細菌素在121 ℃高溫處理30 min后仍存有81%的抑菌活性，具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性；植物乳桿菌細菌素在pH 3.0～8.0 內(nèi)均有優(yōu)良的抑菌效果，在pH為8.0時仍保留69%的抑菌活性，有較為普遍的pH適用范圍。該細菌素在經(jīng)過胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶及蛋白酶K 的處理后，抑菌活性分別保留84%、98%、67%、91%、88%和98%，說明該細菌素對蛋白酶較敏感。在經(jīng)過紫外照射0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 h后，抑菌活性分別保留94%、92%、90%、87%、83%。在經(jīng)過紫外照射2 h后，該細菌素依然保留83%的抑菌效果，說明植物乳桿菌細菌素紫外穩(wěn)定性良好。通過試驗結(jié)果表明植物乳桿菌產(chǎn)生的細菌素可作為生物防腐劑在食品中應用。