籽瓜多糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)促進(jìn)效應(yīng)及其結(jié)構(gòu)表征

常雪花，錢雅雯，王振菊，魏佳，吳斌，張政*

（1.巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院 新疆 庫(kù)爾勒 841000；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆 烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)產(chǎn)品加工與保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091）

籽瓜（Citrullus lanatus ssp.Vulgaris var.megalaspermus Lin et Chao），屬葫蘆科（Cucurbitaceae）西瓜屬（Citrullus genus），是新疆重要的特色農(nóng)作物之一。隨著新疆優(yōu)勢(shì)農(nóng)產(chǎn)品區(qū)域化布局的進(jìn)一步推進(jìn)，籽瓜產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展。2020年，籽瓜播種面積達(dá)84 990萬(wàn)m2，產(chǎn)量為195 451 t，其產(chǎn)量?jī)H次于番茄和辣椒[1]。長(zhǎng)期以來，取籽加工為籽瓜最主要產(chǎn)品形式，超過籽瓜總質(zhì)量90%以上的瓜瓤和瓜皮被直接廢棄，其副產(chǎn)物綜合利用率較低，這導(dǎo)致籽瓜產(chǎn)業(yè)整體產(chǎn)品附加值不高，嚴(yán)重阻礙了籽瓜產(chǎn)業(yè)升級(jí)轉(zhuǎn)型和可持續(xù)發(fā)展[2-3]。

近年來，多糖在功能性食品領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注。以益生元為導(dǎo)向的多糖篩選和開發(fā)已逐漸成熟，成為調(diào)節(jié)腸道菌群以維持身體健康的主要策略之一[4-5]。枸杞多糖具有益生元特性，能增強(qiáng)腸道微生物群，促進(jìn)嗜酸乳桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌的體外生長(zhǎng)[6]。此外，Ouyang等[7]從山藥中分離出的 YPN、YPN-Ⅰ、YPN-Ⅱ和YPN-Ⅲ4個(gè)多糖組分能明顯促進(jìn)嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)。課題組前期利用響應(yīng)面法優(yōu)化籽瓜多糖的超聲輔助水提取工藝，提取出的籽瓜多糖含量達(dá)到6.03%[8]。這表明籽瓜可作為一種多糖的生物來源。籽瓜粗多糖能夠緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[9]。從“內(nèi)蒙黑中片”籽瓜中分離純化的多糖SI具有較好的抗氧化能力，能抑制酵母菌的體外生長(zhǎng)[10]。目前，人們對(duì)籽瓜多糖功能性作用的認(rèn)知主要局限于其抗氧化活性和抑菌活性，這不能充分和科學(xué)地評(píng)價(jià)籽瓜多糖的功能特性。籽瓜多糖是否能與枸杞和山藥多糖等一樣，作為一種潛在的益生元仍需進(jìn)一步研究。

本文以新疆籽瓜為試驗(yàn)材料，對(duì)籽瓜多糖進(jìn)行分離、純化，比較各組分對(duì)益生菌生長(zhǎng)影響的差異性，明確最優(yōu)組分的一級(jí)結(jié)構(gòu)，為籽瓜多糖生物活性與結(jié)構(gòu)表征間構(gòu)效關(guān)系以及籽瓜高附加產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

籽瓜于2021年8月采摘于新疆焉耆縣籽瓜種植園。

青春雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；DEAE纖維素DE-52填料：上海遠(yuǎn)業(yè)生物科技有限公司；石油醚、氫氧化鈉、硫酸：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；溴化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸鐵、葡萄糖：福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；牛肉浸粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、肝浸粉：青島海博生物技術(shù)有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；GCMS-QP2010 SE氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀：天津港東科技股份有限公司；Bruker AV-600MHz核磁共振儀：布魯克（北京）科技有限公司；GJ-25C冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；RE100-Pro旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：美國(guó)SCILOGEX公司；HH-2恒溫水浴鍋：江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)、PHS-3C pH計(jì)：上海耶茂儀器設(shè)備有限公司；LDZX-30KB高壓滅菌鍋：上海鼎謙生物科技有限公司；圓底立式厭氧培養(yǎng)袋：青島海博生物技術(shù)有限公司；DHG-9023A鼓風(fēng)干燥箱、SHP-250生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 籽瓜多糖的提取和分離

將籽瓜去翠衣皮、切塊、去籽、留瓜瓤，經(jīng)40℃低溫干燥48 h后粉碎，經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾得到籽瓜干粉。將籽瓜干粉按原料：石油醚為1∶3（g/mL）的料液比加入石油醚原液，室溫（20±5）℃下浸泡12 h后，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮體積，回收石油醚。重復(fù)2次，除去脂溶性雜質(zhì)，最后放入40℃烘箱內(nèi)干燥，得到籽瓜干粉原料。

采用課題組前期優(yōu)化的超聲輔助水提法提取籽瓜多糖[6]。籽瓜多糖分離參考Zhu等[11]的方法，略有修改。取1g籽瓜干粉溶解在30mL蒸餾水中，42℃、220W超聲輔助提取2 h后，12 000 r/min離心10 min。將上清液緩慢倒入DEAE纖維素色譜柱中。隨后調(diào)整流速至15 mL/min，分別用4組溶劑（3倍柱體積的蒸餾水、0.2 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl和 2.0 mol/L NaCl）洗脫。采用苯酚硫酸法在490 nm處檢測(cè)洗脫液吸光度。

1.3.2 菌株培養(yǎng)

稱取牛肉浸粉3.0 g，可溶性淀粉0.5 g，L-半胱氨酸0.5 g，大豆蛋白胨、胰蛋白胨各5.0 g，酵母浸粉、肝浸粉各 5.0 g，葡萄糖 10.0 g，NaCl、K2HPO4、KH2PO4各1.0 g以及 FeSO4·7H2O 0.01 g，用蒸餾水溶解，定容至1 000 mL并調(diào)節(jié)pH值為7.2，再加入20.0 g瓊脂，即為雙歧桿菌培養(yǎng)基。

取蛋白胨、牛肉浸粉各10.0 g，酵母提取物5.0 g，葡萄糖20.0 g，K2HPO42.0 g和MgSO40.1 g溶解后，定容至1 000 mL并調(diào)節(jié)pH值為6.5，再加入15.0 g瓊脂，即為嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基。

配制的液體培養(yǎng)基在121℃高壓滅菌30 min后，置于滅菌厭氧培養(yǎng)袋中，形成厭氧環(huán)境。使用0.3 mL無菌水對(duì)不同菌種凍干粉進(jìn)行溶解，并在培養(yǎng)基中接種。將接種后的培養(yǎng)基放入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋中迅速加入?yún)捬醍a(chǎn)氣包，并且快速封口。隨后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。通過劃線平板法，對(duì)培養(yǎng)完畢的菌液進(jìn)行接種，37℃環(huán)境下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)48 h。抽取單菌置于滅菌處理后的液體培養(yǎng)基，再于37℃培養(yǎng)48 h。

1.3.3 益生菌的增殖和產(chǎn)酸測(cè)定

益生菌的增殖測(cè)定參考包曉瑋等[12]的方法，略有修改。試管中加入10 mL培養(yǎng)基，在121℃下高溫滅菌20 min。向培養(yǎng)基中添加籽瓜多糖組分使其終濃度為2%。對(duì)活化狀態(tài)的試驗(yàn)菌株進(jìn)行接種，37℃厭氧密封條件下培養(yǎng)48 h，以1.3.2中配制的培養(yǎng)基為對(duì)照（CK）。測(cè)定各液體培養(yǎng)基的pH值，從而探究籽瓜多糖對(duì)試驗(yàn)菌株增殖和產(chǎn)酸影響的差異。

1.3.4 籽瓜多糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)速率的影響

益生菌生長(zhǎng)速率的測(cè)定參考Ouyang等[7]的方法，稍作修改。在試管內(nèi)倒入10 mL培養(yǎng)基，再分別加入200 mg的SMP-1、SMP-2和SMP-3，得到3種含2.0%多糖組分培養(yǎng)基。經(jīng)蒸餾水溶解，4 000 r/min下離心10 min，取上清液。在121℃下對(duì)該培養(yǎng)基進(jìn)行高溫滅菌20 min。對(duì)活化狀態(tài)的4種菌株依次進(jìn)行接種，厭氧條件下培養(yǎng)48 h。以1.3.2中配制的培養(yǎng)基為對(duì)照（CK）。分別在 0、4、8、16、24、32、40 和 48 h 測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度（660 nm）。繪制4株菌在添加籽瓜多糖的培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線，評(píng)價(jià)4種腸道益生菌在多糖環(huán)境下的生長(zhǎng)速率。

1.3.5 分子量的測(cè)定

分子量的測(cè)定參考Zhou等[13]的方法，略有改動(dòng)。將100 mg粗多糖溶解至3 mL蒸餾水中，12 000 r/min離心10 min，取多糖溶液上清液進(jìn)行上樣，利用多糖凝膠純化系統(tǒng)結(jié)合示差檢測(cè)器進(jìn)行純化樣品，并且在線檢測(cè)收集。將收集液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮、冷凍干燥，得到凝膠柱分離純化過的多糖用于分子量測(cè)定。

取適量SMP-1配制成5 mg/mL溶液，12 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，然后將樣品轉(zhuǎn)置于1.8 mL進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣量20 μL。以不同相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖[分子質(zhì)量分別為1 152、11 600、23 800、48 600、80 900、148 000、273 000、409 800 重均分子量（Mw）]作為標(biāo)準(zhǔn)品，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定多糖的相對(duì)分子質(zhì)量，得到峰位分子量、重均分子量、數(shù)均分子量校正曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線，計(jì)算出樣品的分子量大小。

1.3.6 多糖的單糖組成分析

多糖的單糖組成分析參考Xu等[14]的方法，采用高效液相色譜儀進(jìn)行分析。

1.3.7 紅外光譜分析

精密稱取SMP-1 2 mg和溴化鉀200 mg，壓制成片，空白采用溴化鉀粉末壓片而成。分別置于FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀中進(jìn)行掃描記錄。

1.3.8 甲基化分析

甲基化分析參考Xu等[14]的方法。采用GCMS-QP-2010 SE氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)乙?；a(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）條件：色譜柱30 m×0.25 mm×0.25 μm；升溫條件為起始120℃，從3℃/min逐漸升溫，直到250℃；進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為250℃，以氦氣為載氣，使流速達(dá)1 mL/min。

1.3.9 核磁共振分析

稱取SMP-1樣品50 mg，將其溶于0.5 mL重水中并冷凍干燥，重復(fù)3次，以充分交換活潑氫。然后將冷凍干燥后的樣品再用0.5 mL重水溶解。采用Bruker AV-600 MHz核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）采集1H NMR譜、13C NMR譜、DEPT 135譜、氫-氫相關(guān)譜（H-H correlation spectroscopy，HH-COSY）、異核單量子關(guān)系譜（heteronuclear singular quantum correlation，HSQC）、異核多鍵相關(guān)譜（heteronuclear multiple bond correlation，HMBC）和核歐沃豪斯效應(yīng)譜（nuclear overhauser effect spectroscopy，NOESY）分析多糖結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft excel 2010和SPSS 22.0進(jìn)行圖形處理和分析。單個(gè)試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽瓜多糖的分離

籽瓜多糖的洗脫曲線見圖1。

不同多糖組分的荷電性質(zhì)存在差異，通過提高洗脫溶劑（NaCl）的離子強(qiáng)度從離子交換器中分離多糖組分。DEAE纖維素DE-52是分離多糖的常用介質(zhì)，適用于各種中性和酸性多糖的分離。由圖1可知，籽瓜多糖在使用DEAE纖維素DE-52分離后，觀察到3個(gè)洗脫峰，并分別命名為SMP-1、SMP-2和SMP-3。收集3個(gè)組分，濃縮、脫鹽和凍干以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 籽瓜多糖組分對(duì)益生菌產(chǎn)酸的影響

培養(yǎng)基pH值的變化可以間接反映益生菌的生長(zhǎng)狀況，青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基pH值變化見圖2。

圖2 籽瓜多糖組分對(duì)青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基pH值的影響Fig.2 Effects of seed melon polysaccharides on media pH of Bifidobacterium adolescentis，Bifidobacterium longum，Bifidobacterium infantis and lactobacillus acidophilus

由圖2可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，SMP-1、SMP-2和SMP-3組的pH值均逐漸下降，且3個(gè)籽瓜多糖組分均顯著促進(jìn)了益生菌的增殖。對(duì)于青春雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌，培養(yǎng)48 h時(shí)，SMP-1、SMP-2和SMP-3組的pH值均顯著低于對(duì)照組（p＜0.05），且SMP-1的增殖作用優(yōu)于SMP-2和SMP-3組（p＜0.05）。而在接種嬰兒雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌培養(yǎng)48 h時(shí)，SMP-1、SMP-2和SMP-3組間pH值無顯著差異（p＞0.05）。結(jié)果表明，籽瓜多糖更好地被益生菌利用，促進(jìn)益生菌的增殖。綜合考慮，選擇SMP-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 籽瓜多糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)速率產(chǎn)生的影響

600 nm波長(zhǎng)下的OD值是反映益生菌生長(zhǎng)狀況的方法之一，OD值與益生菌生長(zhǎng)呈正比。籽瓜多糖組分SMP-1、SMP-2和SMP-3對(duì)青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用如圖3所示。

圖3 籽瓜多糖組分對(duì)青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)速率的影響Fig.3 Effects of seed melon polysaccharides on the growth rate of Bifidobacterium adolescentis，Bifidobacterium longum，Bifidobacterium infantis and lactobacillus acidophilus

在添加籽瓜多糖SMP-1、SMP-2和SMP-3的培養(yǎng)基中，青春雙歧桿菌培養(yǎng)48 h后，OD600nm維持穩(wěn)定（圖3A），這表明青春雙歧桿菌已處于相對(duì)平穩(wěn)的生長(zhǎng)狀態(tài)。8 h后，SMP-1對(duì)青春雙歧桿菌的促生長(zhǎng)作用比各組分差異都顯著（p＜0.05）。嬰兒雙歧桿菌培養(yǎng)32 h后SMP-2組OD600nm達(dá)到最大值，而嗜酸乳桿菌SMP-3組OD600nm最高（圖3B和圖3D），且培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，嬰兒雙歧桿菌SMP-2組的OD600nm和嗜酸乳桿菌SMP-3組均高于對(duì)照和SMP-1組（p＜0.05）。對(duì)于長(zhǎng)雙歧桿菌，SMP-1組的OD600nm在16 h后始終顯著高于 SMP-2和 SMP-3組（p＜0.05），說明 SMP-1對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌的促生長(zhǎng)作用要優(yōu)于SMP-2和SMP-3（圖3C）。

綜上所述，SMP-1、SMP-2和SMP-3對(duì)益生菌的促進(jìn)作用的影響存在差異，但3個(gè)組分均能促進(jìn)4個(gè)益生菌的生長(zhǎng)繁殖。結(jié)果表明，籽瓜多糖可能是一類潛在的益生元。

2.4 相對(duì)分子量分析

根據(jù)多糖組分對(duì)益生菌生長(zhǎng)影響的測(cè)試結(jié)果，選擇SMP-1進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)表征。SMP-1高效凝膠滲透色譜如圖4所示。

圖4 籽瓜多糖SMP-1高效凝膠滲透色譜分析Fig.4 High-performance gel permeation chromatography profiles of SMP-1 of seed melon polysaccharides

由圖4可知，SMP-1有3個(gè)吸收峰，有進(jìn)一步分離純化的空間，其分子量為97 403 Da。

2.5 單糖成分分析

SMP-1單糖成分分析見圖5。籽瓜多糖SMP-1的單糖組成和物質(zhì)的量百分比見表1。

圖5 單糖標(biāo)準(zhǔn)品和籽瓜多糖SMP-1的單糖組成Fig.5 Monosaccharide composition of standard and SMP-1

表1 籽瓜多糖SMP-1的單糖組成和物質(zhì)的量百分比Table 1 Monosaccharide composition and molar percentage of SMP-1 of seed melon polysaccharides

由圖5可知，單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰順序分別為鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。各單糖標(biāo)準(zhǔn)品分離效果明顯，峰形尖銳，可用于后續(xù)SMP-1單糖組成比對(duì)分析。比對(duì)結(jié)果如表1所示，在7個(gè)單糖中，SMP-1多糖僅含有阿拉伯糖和半乳糖，其物質(zhì)的量百分比分別為0.271%和0.729%。

2.6 紅外圖譜分析

籽瓜多糖SMP-1的紅外光譜見圖6。

圖6 籽瓜多糖SMP-1的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrum of SMP-1 of seed melon polysaccharides

由圖6可知，多糖類物質(zhì)的典型特征吸收帶在3 600 cm-1～3 200 cm-1處為-OH處的振動(dòng)吸收峰，該區(qū)域的吸收峰，實(shí)質(zhì)上也是糖類表現(xiàn)的特征峰，即3 369 cm-1，可作為糖類相應(yīng)的特征峰。于1 656 cm-1處有1個(gè)吸收峰，歸屬于C=O的伸縮振動(dòng)。1 415 cm-1歸屬于C-O的伸縮振動(dòng)引起的吸收峰。在1 079 cm-1處有吸收峰為C-O伸縮振動(dòng)引起的。在1 041 cm-1處吸收峰屬于O-H變角振動(dòng)，該紅外存在777 cm-1吸收峰，歸屬于對(duì)稱環(huán)伸縮振動(dòng)。896 cm-1存在吸收峰，歸屬于半乳吡喃糖環(huán)的β-端基差向異構(gòu)的C-H變角振動(dòng)；但β-端構(gòu)型推斷并不能完全確定，需要做核磁分析進(jìn)一步確定。

2.7 甲基化分析

單糖殘基的類型是由甲基化分析來確定。完全甲基化的籽瓜多糖SMP-1經(jīng)水解、還原和乙?；?，最后得到部分甲基化的糖醇乙酸酯，然后采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）分析檢測(cè)SMP-1的單糖種類、連接方式以及組成比例，籽瓜多糖SMP-1的甲基化分析見表2。

表2 籽瓜多糖SMP-1的甲基化分析Table 2 Methylation analysis of SMP-1 of seed melon polysaccharides

由表2可知，占比較多的是由→3）-Galp-（1→和→3，6）-Galp-（1→組成，糖苷鍵連接方式較為復(fù)雜。

2.8 核磁共振分析

采用核磁共振一維圖譜（1H NMR、13C NMR）和二維圖譜（COSY、HSQC和HMBC）對(duì)籽瓜多糖SMP-1的糖殘基組成，以及各糖殘基在多糖分子鏈中的鏈接方式進(jìn)行分析，結(jié)果見圖7和圖8。

圖8 籽瓜多糖SMP-1的二維NMR圖譜Fig.8 Two dimensional NMR spectra of SMP-1 of seed melon polysaccharides

由圖7A可知，化學(xué)位移介于3.0～5.5。化學(xué)位移為3.2～4.0 表示糖環(huán)質(zhì)子信號(hào)，基質(zhì)子峰 5.16、5.01、δ4.56、4.46、4.44的信號(hào)峰集中分布在 4.3～5.5。

由圖7B可知，核磁碳譜信號(hào)化學(xué)位移分布于60～120。由碳譜可知，異頭碳信號(hào)峰為110.62、109.25、105.73、104.79、104.51，異頭碳信號(hào)區(qū)域主要在 93～105。而非異頭碳信號(hào)峰為 85.22、83.48、82.69、82.43、82.27、81.47、79.04、77.95、77.84、77.53、76.50、76.33、75.87、75.10、74.67、74.33、74.11、74.00、73.20、72.12、71.61、71.23、70.74、70.00、69.85、62.64、62.37、62.10、61.37、非異頭碳信號(hào)都集中在60～85。根據(jù)單糖組成結(jié)果，該多糖由阿拉伯糖和半乳糖組成，說明該多糖主要為阿拉伯半乳聚糖。

由圖7C可知，在SMP-1的Dept135圖譜中，70.72、68.62、62.63、62.41、62.36、62.10 峰為倒峰，表明為 C6的化學(xué)位移。70.72向高場(chǎng)遷移，表明存在取代。

籽瓜多糖SMP-1的二維NMR圖譜見圖8。

由圖8A可知，H1-2的信號(hào)為4.47/3.57；H2-3的信號(hào)為3.57/3.68；H3-4的信號(hào)為3.68/4.05；H4-5的信號(hào)為4.05/3.87；H5-6a的信號(hào)為3.87/3.96，可以推斷出H1、H2、H3、H4、H5、H6a 分別為 4.47、3.57、3.68、4.05、3.87、3.96。對(duì)應(yīng)的 C1-C5 為 104.69、71.31、81.5、69.82、74.81、70.76；圖8B 顯示，異頭碳信號(hào)為 104.69，HSQC圖譜中對(duì)應(yīng)的異頭氫信號(hào)是4.47。因此，該信號(hào)應(yīng)歸屬于糖苷鍵→3，6）-Galp-（1→。

由圖8C可知，多糖的糖苷鍵信號(hào)進(jìn)行歸屬：糖苷鍵→4）-β-D-Galp-（1→的異頭碳和→3）-β-D-Galp-（1→的H3存在相關(guān)峰，可見具有→4）-β-D-Galp-（1→3）-β-D-Galp-（1→；糖苷鍵→3）-β-D-Galp-（1→的異頭碳和→3，6）-β-D-Galp-（1→的 H6b 存在相關(guān)峰，可見具有→3）-β-D-Galp-（1→3，6）-β-DGalp-（1→；→3，6）-β-D-Galp-（1→異頭氫與自身的→3，6）-β-D-Galp-（1→的 C6 有相關(guān)峰，表明存在→3，6）-β-D-Galp-（1→3，6）-β-D-Galp-（1→；糖苷鍵→3，6）-β-D-Galp-（1→的異頭碳 104.69 與→4）-β-D-Galp-（1→的 H4 4.08 有相關(guān)信號(hào)峰，為→3，6）-β-D-Galp-（1→4）-β-D-Galp-（1→的鏈接方式。

根據(jù)類似規(guī)律并結(jié)合HMBC圖譜和NOESY圖譜，對(duì)所有糖苷鍵信號(hào)進(jìn)行歸屬，結(jié)果見表3。

表3 糖苷鍵信號(hào)歸屬Table 3 Glycoside bond signal assignment

2.9 SMP-1基本結(jié)構(gòu)特征

通過單糖組成、紅外光譜、甲基化、核磁共振等結(jié)果表明，籽瓜多糖SMP-1的基本結(jié)構(gòu)特征是：SMP-1為1種中性多糖，由半乳糖和阿拉伯糖組成。推斷該多糖的主鏈連接方式為→6）-β-D-Galp-（1→3）-β-D-Galp-（1→的糖苷鍵，而端基是由 α-L-Araf-（1→通過O-3鍵連接在主鏈上。籽瓜多糖SMP-1的一級(jí)結(jié)構(gòu)見圖9。

圖9 籽瓜多糖SMP-1的一級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.9 Primary structure of SMP-1 of seed melon polysaccharides

3 討論與結(jié)論

人體腸道菌群存在著多種細(xì)菌，是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)[15-16]。大量研究表明，多糖能促進(jìn)益生菌體外生長(zhǎng)[17-18]。前期研究發(fā)現(xiàn)，廢棄籽瓜瓜瓤可以作為獲取多糖的重要來源之一[8]。在本試驗(yàn)中，經(jīng)分離純化后得到SMP-1、SMP-2和SMP-3 3個(gè)多糖組分，它們均能誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的增殖，且SMP-1的效果優(yōu)于SMP-2和SMP-3。上述結(jié)果表明，籽瓜多糖是一種潛在的益生元且對(duì)腸道益生菌具有促進(jìn)增殖的效果。聚合度會(huì)影響糖類對(duì)益生菌的增殖作用，聚合度越低其分子量越小，更容易被益生菌利用[19-20]。郝林華等[21]認(rèn)為多糖對(duì)益生菌的促生長(zhǎng)作用較明顯的為高純度、β-型糖苷鍵連接的低聚糖，從而證實(shí)益生元作用與糖的結(jié)構(gòu)、純度等因素有關(guān)。因此，基于籽瓜多糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)效應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果，選擇SMP-1進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)表征。

多糖自身的生物活性與其分子量、化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)均有很大的關(guān)聯(lián)[22]。在南瓜中，與雜多糖ATPS-PP-2相比，低分子量的ATPS-PP-1對(duì)胰島細(xì)胞具有更好的降血糖活性[23]。較豐富的糖醛酸能改變植物多糖結(jié)合物的理化性質(zhì)和溶解度，具有較高的抗氧化活性[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，SMP-1的分子量為97.40 kDa。其組分由阿拉伯糖和半乳糖構(gòu)成，所包含的單糖種類較少。與其他植物來源相比，SMP-1的單糖組成與它們存在較大差異，這可能是由品種間差異造成的[25-26]。植物多糖的結(jié)構(gòu)特征，如β-（1）-→3）-在主鏈中的連接對(duì)多糖的生物活動(dòng)至關(guān)重要[27]。由（1→3）和（1→4）-Glc p 糖苷連接的南瓜多糖具有更好的降血糖活性[23]。本試驗(yàn)借助紅外光譜掃描、甲基化以及核磁共振波譜分析等多種手段，對(duì)SMP-1相應(yīng)的一級(jí)結(jié)構(gòu)予以表征，可推斷其結(jié)構(gòu)式為主鏈連接方式，主要包含的糖苷鍵為→6）-β-D-Galp-（1→3）-β-D-Galp-（1→，端基是由 α-LAraf-（1→通過O-3鍵連接在主鏈上。

綜上所述，籽瓜多糖是一種潛在的益生元，可以明顯促進(jìn)青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)。SMP-1構(gòu)效關(guān)系分析表明，籽瓜多糖SMP-1的促生長(zhǎng)作用可能與其分子量、單糖組成和糖苷鍵結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)。籽瓜多糖SMP-1的主鏈連接方式為→6）-β-D-Galp-（1→3）-β-D-Galp-（1→的糖苷鍵，而端基α-L-Araf-（1→通過O-3鍵連接在主鏈上。本研究主要分析籽瓜多糖對(duì)于益生菌生長(zhǎng)的促進(jìn)效應(yīng)，為籽瓜多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。為了深入了解籽瓜多糖的作用機(jī)理，有必要進(jìn)一步分離純化籽瓜多糖，并對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行詳細(xì)研究。