不同提取方法下黃穿生制劑對雞大腸桿菌的體外抑菌作用

王志偉 ， 李超雷 ， 彭志領(lǐng) ， 王志剛

(1. 鄭州市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊 ， 河南 鄭州 450053 ； 2. 河南省睢縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所 ， 河南 睢縣 476900)

研究發(fā)現(xiàn)中藥在抗大腸桿菌內(nèi)毒素及消除大腸桿菌耐藥質(zhì)粒中發(fā)揮重要作用[1-2]。黃芪、穿心蓮、生姜3味中藥在治療雞大腸桿菌病時，入藥頻率較高[3-7]。生姜含有抑菌活性成分，其對大多數(shù)細菌有一定的抑制作用，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、肺炎克雷伯菌和白色念珠菌等[8]。穿心蓮具有抗炎、保肝利膽、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[9]。黃芪的藥理作用包括保護心腦血管、肺功能、腎組織、肝損傷、腸功能，提高免疫功能，調(diào)節(jié)血壓和抗氧化應(yīng)激等[10]。中藥不同于一般化學(xué)藥物，其化學(xué)成分十分復(fù)雜，中藥復(fù)方中多味藥材配伍發(fā)揮功效不是簡單的化學(xué)分子疊加，每味藥材對不同疾病發(fā)揮功效的成分不同。因此，中藥有效部位的提取方法在研究中尤為重要，發(fā)展有效且適宜的提取方法及研究方法是辨識中藥活性部位的關(guān)鍵。中藥有效部位是其發(fā)揮藥物療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，是中藥現(xiàn)代研究的關(guān)鍵[11]。本試驗應(yīng)用家禽感染性疾病入藥頻率高的黃芪、穿心蓮、生姜3味中藥進行組方(黃穿生制劑)[3]，采用3種不同的制藥方法，觀察其體外抑菌效果，為中藥制劑防治雞致病性大腸桿菌病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 原料與試劑：黃芪(Astragalusmembranaceus)、穿心蓮(Andrographispaniculata)和生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)3味中藥，均購自鄭州某大藥房。菌種：雞源性大腸桿菌O1型、O2型、O35型和O137型，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所分離保存和鑒定。培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、氯化鈉、水)、營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基，均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，置于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.2 主要儀器 LRH-150型恒溫生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，北京恒泰豐科試驗設(shè)備有限公司；KQ-300B型超聲波清洗器，廣州滬瑞明儀器有限公司；FA1004 N電子天平，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-1B型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SHZ-ⅢB型循環(huán)水真空泵，上海英化儀器設(shè)備有限公司；YH-350Z型全自動不銹鋼雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器，鎮(zhèn)江市科密儀器儀表有限公司；SYZ-C型雙重純水蒸餾器，紹興市上虞道科儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗藥劑的制備 煎煮法[12]制備試驗藥Ⅰ(組1)，取中藥材黃芪、穿心蓮、生姜分別粉碎，過60目篩。然后，稱取粉碎的黃芪30 g、穿心蓮50 g、生姜50 g，置于煎藥器中浸泡0.5 h后，煎煮1.5 h，過濾；煎3次，后2次各1 h。制備過程：煎煮→濃縮→收膏→干燥→成品，作為試驗藥Ⅰ。超聲波+煎煮法制備試驗藥Ⅱ(組2)，稱取粉碎的3種藥物，放入燒杯，加水適量，超聲波處理20 min后，將其倒入煎藥器中，先煎煮1.5 h，過濾；再煎3次，后2次各1 h。合并濾液，濃縮，收膏，干燥備用，作為試驗藥Ⅱ。索氏提取法[13]制備試驗藥Ⅲ(組3)，3種藥材稱量好后用75%乙醇作為浸出溶媒，超聲波預(yù)處理30 min后，置于索氏提取器中回流提取4～8 h。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，干燥備用，作為試驗藥Ⅲ。

測定試驗藥Ⅰ、藥Ⅱ、藥Ⅲ的得膏率：精密量取50 mL的藥液上清液，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于烘箱中105 ℃干燥3 h，置于干燥器中冷卻0.5 h，迅速稱量，即可得藥膏量，依據(jù)公式計算得膏率。得膏率/%=藥膏量/生藥量×100%。

1.3.2 藥敏片的制備 用打孔機制作直徑為6 mm左右的圓形濾紙，50張1份。然后，將制作好的濾紙分別裝入標記藥Ⅰ、藥Ⅱ、藥Ⅲ的小青霉素瓶中，用牛皮紙封瓶口進行高壓(121 ℃ 15 min)，烘干備用[14]。干燥保存的煎煮法、超聲波+煎煮法和索氏提取法制取的中藥膏劑，分別用蒸餾水配制成濃度為2 g/mL的試驗藥液。用微量移液槍分別吸取500 μL試驗藥液藥I、藥Ⅱ、藥Ⅲ于裝有50個紙片的小青霉素瓶中，60 ℃干燥2～4 h進行密封，置于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.3.3 試驗菌懸液的制備 活菌計數(shù)法是在一定濃度的定量藥物內(nèi)加入定量的試驗菌，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后，取樣進行活菌計數(shù)，而后使用滅菌生理鹽水稀釋到2×107個/mL，作為試驗用菌懸液[15]。

1.3.4 藥敏試驗 紙片擴散法：將200 μL菌懸液接種在普通瓊脂培養(yǎng)基上，逐次將藥Ⅰ、藥Ⅱ、藥Ⅲ的藥敏片貼在涂有細菌的培養(yǎng)基上，保持藥敏片之間的距離約2 cm，平皿壁和藥敏片之間的距離約1.5 cm。在3個接種細菌的平板上分別涂上各自標號的藥液，制作6個相應(yīng)抗原型的細菌平板。接種后的培養(yǎng)皿在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，而后測量抑菌圈直徑并判定敏感性。藥物敏感試驗判定標準為抑菌圈直徑：≥20 mm為極敏，15～19 mm為高敏，10～14 mm為中敏，≤10 mm為低敏，0 mm為不敏。

管碟法：試驗藥液進行2倍稀釋。分別將5 mL營養(yǎng)肉湯依次加入到10支試管中，量取試驗藥液5 mL放入第1支試管中，混勻，而后吸取5 mL混合液體放入第2支試管中，逐次稀釋到第9支試管，其中第8支試管中棄去5 mL混合液體。將1.3.3中配制的菌懸液加到10支試管中，每支試管均加200 μL菌液，放入37 ℃恒溫箱進行增菌培養(yǎng)18～24 h。從10支試管中分別吸取200 μL培養(yǎng)物均勻涂在普通瓊脂培養(yǎng)基上，而后在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，再計算其最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。管碟法判定標準：平皿上的菌落數(shù)在10～20個的最小稀釋度的藥物濃度即為MIC[15]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進行t檢驗分析，結(jié)果表示為平均值±標準差，P<0.05為具有顯著性差異，P<0.01為具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 試驗藥劑的制備 試驗中各取3份樣品采用3種方法進行制備，采用煎煮法獲得的藥膏量為5.815 2 g，超聲波+煎煮法獲得的藥膏量為8.236 8 g，索氏提取法獲得的藥膏量為16.121 2 g。

3種制備方法獲得的藥Ⅰ、藥Ⅱ、藥Ⅲ的得膏率結(jié)果見表1，3種制備方法得膏率由低到高依次是煎煮法、超聲波+煎煮法、索氏提取法。

表1 3種方法獲得的得膏率Table 1 Relative recovery rates of three extraction methods

2.2 藥敏試驗

2.2.1 紙片擴散法 3種方法提取的中藥制劑對O1型、O2型、O35型和O137型大腸桿菌的平均抑菌圈結(jié)果如表2所示，與煎煮法制備的藥劑相比，O1型、O2型、O35型和O137型4個型大腸桿菌對索氏提取法制取中藥制劑的敏感程度有極顯著性差異(P<0.01)，而對超聲波+煎煮法制取中藥制劑的敏感程度有顯著性差異(P<0.05)。表明對細菌生長繁殖抑制效果由弱到強依次是煎煮法制備的藥劑、超聲波+煎煮法制備的藥劑、索氏提取法制備的藥劑，即索氏提取法制備的藥劑抑菌效果最好。

表2 3種方法提取的黃穿生制劑對4種不同血清型大腸桿菌的抑菌圈直徑Table 2 Diameters of inhibition zone of three Huangchuansheng preparations on four different serotypes of E. coli (mm)

2.2.2 管碟法 3種方法提取的中藥制劑對O1型、O2型、O35型和O137型大腸桿菌的MIC 和MBC結(jié)果如表3所示，索氏提取法制備的中藥制劑的MIC和MBC值最小，而煎煮法制取的中藥制劑的MIC和MBC值最大。大腸桿菌對索氏提取法制得的中藥制劑表現(xiàn)為中敏，對超聲波+煎煮法和煎煮法制得的中藥制劑表現(xiàn)為低敏。

表3 3種方法提取的黃穿生制劑對4種不同血清型大腸桿菌的MIC和MBCTable 3 MIC and MBC of three Huangchuansheng preparations against four different serotypes of E. coli (g/mL)

3 討論

陳赟[16]研究煎煮法提取赤芍中芍藥苷的方法，此法工序繁瑣、煎煮時間長，但煎煮法是我國最早使用的傳統(tǒng)的浸出方法[17]。楊榮華[18]研究超聲波法提取銀杏葉中黃酮類化合物的工藝，發(fā)現(xiàn)超聲提取的提取率比溶劑法提高了約1.5倍。近年來，索氏提取法在中藥提取方面應(yīng)用較多，其具有得膏率高、有效成分損失少、周期短等優(yōu)點[19-20]，在中藥制劑生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景。本試驗結(jié)果與之前報道的中藥制劑提取方法的研究結(jié)果[21]一致，可見，一般中藥制劑提取可優(yōu)先選擇索氏提取法。

中藥含有多種天然的活性物質(zhì)成分，主要有生物堿、有機酸、活性多糖類、黃酮類化合物、苷類、揮發(fā)油、蒽醌類、活性多糖等[22]。中藥含有的活性物質(zhì)不僅對病原體有直接殺滅作用，還可間接通過調(diào)節(jié)整個動物機體系統(tǒng)的平衡狀態(tài)，使機體提高自身的免疫力起到抗菌作用[23-24]。本試驗使用家禽感染性疾病入藥頻率高的黃芪、穿心蓮、生姜3味中藥，采用不同的提取方法進行體外抑菌試驗，采用紙片擴散法和管碟法2種藥敏試驗方法，比較了3種不同的中藥提取方法(煎煮法、超聲波+煎煮法、索氏提取法)制備的黃穿生制劑對4種雞源大腸桿菌的抑制效果，結(jié)果顯示索氏提取法制備的藥劑抑菌效果最好，該試驗結(jié)果與之前報道的研究結(jié)果[21，25]一致。在本試驗條件下，黃穿生制劑并沒有表達出最好的效果，說明3味中藥的配伍比例還有待于改善。

本試驗對黃芪、穿心蓮、生姜3種中藥制劑采用3種提取方法(煎煮法、超聲波+煎煮法、索氏提取法)制備藥劑，得膏率存在一定的差異，其中索氏提取法得膏率最高，煎煮法得膏率最低；紙片擴散法和管碟法2種藥敏試驗結(jié)果顯示，3種提取方法制備的黃穿生制劑對4種雞源性大腸桿菌有一定的體外抑制作用，且索氏提取法制備的中藥藥劑抑菌效果較好。本試驗為進一步研發(fā)中藥制劑防治雞致病性大腸桿菌病提供參考。