碎米蛋白提取及高剪切輔助酶法改善其溶解性研究

祝水蘭 劉光憲 周巾英 馮健雄

摘要：【目的】研究碎米蛋白提取，并通過改性提高碎米蛋白溶解性的關(guān)鍵技術(shù)，為解決優(yōu)質(zhì)蛋白缺乏問題提供技術(shù)參考。【方法】以早秈碎米為原料，采用單因素試驗與正交試驗相結(jié)合的方法，分別以蛋白提取率和蛋白溶解度為考察指標(biāo)，確定超聲波輔助堿法提取碎米蛋白及高剪切輔助酶法改善其溶解性的最佳方案。【結(jié)果】提取碎米蛋白的最佳工藝：NaOH質(zhì)量濃度0.4%、固液比1：8（g/mL）、提取時間2 h，碎米蛋白提取率為70.79%，各因素對碎米蛋白提取率的影響排序為NaOH質(zhì)量濃度>提取時間>固液比；提高蛋白溶解性的最佳工藝：剪切轉(zhuǎn)速3500 r/min、剪切時間30 min、剪切溫度45 ℃、加酶量1.5%，碎米蛋白溶解度由0.53%提高至28.00%，各因素對碎米蛋白溶解性的影響排序為剪切轉(zhuǎn)速>剪切時間>剪切溫度>加酶量?！窘Y(jié)論】超聲波與堿法聯(lián)用可提高碎米蛋白提取率，高剪切輔助酶法可提高碎米蛋白溶解性。

關(guān)鍵詞： 碎米；蛋白；超聲波；高剪切；提取率；溶解度

中圖分類號： S511.21 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）07-1403-06

0 引言

【研究意義】大米中蛋白含量雖然不高，卻是一種優(yōu)質(zhì)蛋白（王章存等，2006）。大米蛋白的氨基酸構(gòu)成比較完整，是禾谷類糧食中最好的一種蛋白（易翠平和姚惠源，2003），屬于低抗原性蛋白，不會產(chǎn)生過敏反應(yīng)，且具有許多潛在的保健功能，如抗癌變、抗膽固醇和抗糖尿病等（王章存等，2004；郭艷和曾里，2010）。大米蛋白主要成分是谷蛋白，谷蛋白分子量大，分子內(nèi)和分子間存在大量巰基和二硫鍵，這些結(jié)構(gòu)特性使得大米蛋白在中性條件下難溶于水，而嚴重影響其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，因此改善大米蛋白的溶解性是解決其應(yīng)用問題的關(guān)鍵（肖蓮榮和任國譜，2012）?！厩叭搜芯窟M展】目前常見的大米蛋白分離提取方法有堿法提取、酶法提取、分步水解法、復(fù)合提取法和物理分離法等（李超楠等，2017b）。陳季旺等（2006）采用堿酶兩步法制備大米蛋白，得到蛋白提取率73.22%，純度88.75%。萬娟等（2009）采用堿法從秈碎米中制備提取大米蛋白，在氫氧化鈉（NaOH）質(zhì)量濃度0.09 mol/L、料液比1∶6、提取溫度25 ℃的條件下提取4 h，得到大米蛋白提取率77.3%，蛋白質(zhì)純度80.5%。王章存等（2012）研究高壓處理對大米蛋白溶解性的影響，結(jié)果表明，在pH 10.0的條件下500 MPa高壓處理可使大米蛋白的溶解度由16.60%提高到24.87%。朱建華等（2012）利用中性蛋白酶對稻谷加工副產(chǎn)物進行了碎米蛋白提取研究，蛋白提取率可達74.8%。楊樺（2017）利用超聲波輔助酶法技術(shù)提取小米蛋白，得到小米蛋白提取率為（74.26±1.20）%，但酶法提取成本較高?！颈狙芯壳腥朦c】目前，尚無利用超聲波與堿法聯(lián)用提取碎米蛋白和采用高剪切與酶法結(jié)合處理改善碎米蛋白溶解性的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以早秈稻米加工副產(chǎn)物碎米為原料，采用超聲波與堿法聯(lián)用技術(shù)提取蛋白，并通過高剪切與酶法結(jié)合改善碎米蛋白溶解性，以提高碎米的附加值，并為解決優(yōu)質(zhì)蛋白缺乏問題提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

早秈碎米為農(nóng)戶售，粉碎成粒度200 μm，水含量5.92%，蛋白質(zhì)含量8.85%，碎米蛋白初始溶解度0.53%，色澤氣味正常。NaOH、硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、甲基紅指示液、溴甲酚綠指示劑和乙醇均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，堿性蛋白酶（酶活力200000 U/g）購自江蘇銳陽生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：高速組織搗碎機JJ-2（2003-61）（常州億通分析儀器制造有限公司）、粉碎機XL-200A（上海潤實電器有限公司）、分析天平TP-214（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、超聲波細胞粉碎儀UP250（寧波新芝生物科技股份有限公司）、水浴恒溫振蕩器SHA-B型（常州潤華電器有限公司）、雷磁PHS-3C（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、高剪切乳化機SGR4011（上海尚貴流體設(shè)備有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 工藝流程

1. 2. 1. 1 碎米蛋白提取 碎米→碾粉→堿調(diào)乳液→高速組織搗碎→負壓吸脹→超聲波細胞粉碎儀處理→離心→蛋白液→酸沉→干燥→粉碎→碎米蛋白。

1. 2. 1. 2 高剪切與酶法結(jié)合改善碎米蛋白溶解性

碎米蛋白粉→固液比調(diào)配→高剪切處理→取樣→高速組織搗碎勻漿→負壓→超聲波處理→調(diào)pH至8.5→預(yù)熱→堿性蛋白酶酶解→90 ℃水浴滅酶10 min→冷卻→離心4000 r/min→取上清液備用。

1. 2. 2 碎米蛋白提取工藝優(yōu)化

1. 2. 2. 1 單因素試驗 以碎米蛋白提取率為指標(biāo)，分別考察NaOH質(zhì)量濃度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%）、提取時間（1、2、3、4和5 h）和固液比（每體積質(zhì)量計）[1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和1∶12（g/mL）]3個因素對碎米蛋白提取率的影響。進行3次重復(fù)試驗。

1. 2. 2. 2 正交試驗 碎米蛋白提取率受NaOH質(zhì)量濃度、提取時間和固液比的影響，根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，碎米蛋白提取進行3因素3水平正交試驗（表1），以碎米蛋白提取率為考察指標(biāo)，進行3次重復(fù)試驗。

1. 2. 3 高剪切與酶法結(jié)合改善碎米蛋白溶解性研究

1. 2. 3. 1 單因素試驗 取1.2.2堿法提取的蛋白，粉碎，稱50 g溶于4000 mL去離子水中，配成蛋白溶液，轉(zhuǎn)入高剪切乳化機中，在一定剪切轉(zhuǎn)速（1500、2000、2500、3000、3500和4000 r/min）、剪切溫度（35、40、45、50和55 ℃）、剪切時間（20、30、40、50和60 min）和加酶量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）條件下按1.2.1.2工藝流程試驗，對比分析這4個因素對碎米蛋白溶解性的影響。進行3次重復(fù)試驗。

1. 2. 3. 2 正交試驗 由于碎米蛋白溶解度受剪切轉(zhuǎn)速、剪切溫度、剪切時間及加酶量的影響，根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，高剪切與酶法結(jié)合改善碎米蛋白溶解性研究進行4因素3水平正交試驗（表2），以碎米蛋白溶解度為考察指標(biāo)，進行3次重復(fù)試驗。

1. 3 指標(biāo)測定

蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.5—2016凱氏定氮法進行測定；蛋白溶解度參照鄭芳燕等（2010）的方法進行測定，將碎米蛋白溶液置于30 ℃水浴振蕩器中，以120 r/min攪拌2 h后靜置數(shù)分鐘，取上清液于4000 r/min離心分離10 min，再取離心上清液測蛋白質(zhì)含量。蛋白提取率（%）=樣品中蛋白質(zhì)含量/原料中蛋白質(zhì)含量×100，蛋白溶解度（%）=上清液蛋白質(zhì)含量/樣品中蛋白質(zhì)含量×100。

1. 4 統(tǒng)計分析

采用Excel 2007對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 堿法提取蛋白質(zhì)試驗結(jié)果

2. 1. 1 單因素試驗結(jié)果

2. 1. 1. 1 不同NaOH質(zhì)量濃度對碎米蛋白提取率的影響 由圖1可知，隨著NaOH質(zhì)量濃度的不斷升高，碎米蛋白提取率先升高后下降，當(dāng)NaOH質(zhì)量濃度為0.4%時，蛋白提取率達最大值（67.88%）。大米蛋白在胚乳中與淀粉結(jié)合緊密，較難溶出，NaOH能有效提高蛋白溶解性，因為大米蛋白中含有80%左右的谷蛋白，而谷蛋白屬堿溶性（劉深勇，2015），當(dāng)NaOH質(zhì)量濃度低時，堿能使碎米淀粉和蛋白分離（郭梅等，2011）；當(dāng)堿濃度超過0.4%后，由于淀粉部分糊化，使溶液黏度增加，導(dǎo)致蛋白無法被提取出來，蛋白提取率下降。因此堿濃度選擇0.4%左右為宜。

2. 1. 1. 2 提取時間對碎米蛋白提取率的影響 由圖2可知，提取開始后，碎米蛋白提取率隨提取時間的延長而增加，此時溶出的蛋白較多，淀粉結(jié)構(gòu)松散。當(dāng)提取時間超過2 h后，隨著提取時間的延長，蛋白提取率下降，是由于淀粉的松散程度大，離心上清液中蛋白質(zhì)含量減少，導(dǎo)致蛋白提取率有所下降。因此，選擇提取時間2 h為宜。

2. 1. 1. 3 固液比對碎米蛋白提取率的影響 由圖3可知，隨著提取溶液體積的增加，蛋白提取率不斷上升，當(dāng)固液比為1：8時，蛋白提取率達最大值（69.18%），是由于隨著提取溶液體積的增加，碎米蛋白更易溶解于上清液中，使碎米蛋白更易分解。為了節(jié)約成本，選取固液比為1∶8。

2. 1. 2 L9（33）正交試驗結(jié)果 由表3可知，蛋白提取工藝中，影響碎米蛋白提取率的因素排序為A>B>C；從空列的R來看，可能存在比固液比對碎米蛋白提取率影響更大的因素。最佳工藝組合為A3B2C1，即NaOH質(zhì)量濃度0.4%、提取時間2 h、固液比1∶8，在此條件下得到碎米蛋白提取率為70.79%。

2. 2 高剪切與酶法結(jié)合改善碎米蛋白溶解性試驗結(jié)果

2. 2. 1 單因素試驗結(jié)果

2. 2. 1. 1 剪切轉(zhuǎn)速對碎米蛋白溶解性的影響 由圖4可知，隨著剪切轉(zhuǎn)速的增加，蛋白溶解度逐漸增加。高剪切作用可對蛋白質(zhì)顆粒產(chǎn)生強烈的剪切、拉伸和擠壓，使蛋白質(zhì)顆粒發(fā)生破裂，粒徑變小，表面積增大（張彩猛等，2010），有效提高碎米蛋白的溶解度。當(dāng)剪切轉(zhuǎn)速達3500 r/min時，蛋白溶解度趨緩，因此選擇剪切轉(zhuǎn)速為3500 r/min。

2. 2. 1. 2 剪切溫度對碎米蛋白溶解性的影響 由圖5可知，溫度可提高碎米蛋白的溶解度，隨著剪切溫度的升高，碎米蛋白溶解度逐漸升高。這主要是因為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)緊密，進行適當(dāng)?shù)募訜崽幚?，蛋白質(zhì)出現(xiàn)離解和開鏈現(xiàn)象，破壞了不溶性蛋白間的作用力，從而改進了蛋白質(zhì)的水合能力，提高其溶解性。當(dāng)剪切溫度達50 ℃時，溶解度趨緩，故選擇剪切溫度為50 ℃。

2. 2. 1. 3 剪切時間對碎米蛋白溶解性的影響 由圖6可知，碎米蛋白溶解度在開始剪切30 min內(nèi)，隨著剪切時間的延長而逐漸增大，在剪切30 min后，蛋白溶解度開始下降。其原因可能是當(dāng)?shù)鞍最w粒的粒徑小到一定程度時，受到剪切作用力變?nèi)?，表面可溶性蛋白溶解性逐漸降低。因此，選擇30 min為最佳剪切時間。

2. 2. 1. 4 加酶量對碎米蛋白溶解性的影響 由圖7可知，碎米蛋白剪切后加入堿性蛋白酶能提高碎米蛋白的溶解度，加酶量為0.5%～1.5%時，碎米蛋白溶解度隨著加酶量的增加而逐漸增大，當(dāng)加酶量超過1.5%后，溶解度有所下降。這是由于酶的水解作用使碎米蛋白分子的一些親水基團釋放出來，從而提高其溶解度；但隨著酶濃度的增加，蛋白分子易產(chǎn)生交聯(lián)聚合現(xiàn)象，從而使蛋白溶解度呈下降趨勢。因此，選擇1.5%為最佳加酶量。

2. 2. 2 L9（34）正交試驗結(jié)果 由表4可知，高剪切與酶法結(jié)合改善碎米蛋白溶解度工藝中，影響蛋白溶解度的主次因素依次為A>C>B>D，最佳工藝組合為A3B2C1D3，即剪切轉(zhuǎn)速3500 r/min、剪切溫度45 ℃、剪切時間30 min、加酶量1.5%。最優(yōu)組合在試驗設(shè)計組合中，碎米蛋白溶解度為28.00%。

3 討論

目前已有不少提取大米蛋白的研究，如奚海燕等（2007）使用堿酶兩步法從米粉中提取大米蛋白，堿法工藝中蛋白提取率為51.30%；朱建華等（2013）采用高功率超聲波技術(shù)提取可溶性蛋白，在超聲波功率495 W條件下蛋白提取率達90.47%；李超楠等（2017a）使用KQ-500DE型超聲清洗機輔助提取碎米蛋白，提取率為67.01%。本研究利用低功率超聲波細胞粉碎機（最大功率250 W）輔助堿法提取碎米蛋白，在NaoH質(zhì)量濃度0.4%、提取時間2 h、固液比1∶8的條件下蛋白提取率達70.79%，說明低功率超聲波更有利于提高蛋白提取率。超聲波細胞粉碎機是一種利用強超聲在液體中產(chǎn)生空化效應(yīng)，可使蛋白質(zhì)破碎、乳化、分離、勻化及加速化學(xué)反應(yīng)等，從而使蛋白質(zhì)顆粒進一步細化，與碎米淀粉的連接產(chǎn)生松動，提高其提取率。

黃建韶和張洪（2014）使用濃度為1200 U/g的Alcalase蛋白酶水解大米蛋白，大米蛋白的溶解度達71.25%，但蛋白酶用量多，價格高；聶小華等（2015）采用HCl對大米蛋白進行脫酰胺處理，脫酰胺處理4 h的大米蛋白溶解性約提高了7.86倍；萬紅霞等（2015）采用動態(tài)超高壓微射流進行均質(zhì)處理，大米蛋白溶液的溶解性顯著提高。本研究利用高剪切乳化設(shè)備與酶法結(jié)合對碎米蛋白進行高剪切處理，在剪切轉(zhuǎn)速3500 r/min、剪切時間30 min、剪切溫度45 ℃、加酶量1.5%的條件下，碎米蛋白溶解度由0.53%提高到28.00%。蛋白酶是具有生物催化功能的生物大分子，能夠?qū)⒌鞍追肿拥碾逆溗鈹嗔?，提高蛋白溶解性，但本研究使用的是堿性蛋白酶處理，蛋白質(zhì)易溶于堿性溶液中，蛋白質(zhì)被酶解，溶解性降低。高剪切乳化機具備了細化、分散和均質(zhì)的功能，主要利用高剪切均質(zhì)機定轉(zhuǎn)子間相對高速運動產(chǎn)生的高剪切作用，同時伴隨著較強的空穴作用對蛋白質(zhì)顆粒進行分散、細化、均質(zhì)，提高蛋白溶解性，對促進溶解性要求高的產(chǎn)品生產(chǎn)具有重要意義，但溶解性還有待進一步提高。為了拓展蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域，今后可對蛋白的乳化性、起泡性和成膜性等物理特性及使用其他酶來提高蛋白溶解性進行深入研究。

4 結(jié)論

結(jié)合單因素試驗和正交試驗得到超聲波與堿法聯(lián)用提取碎米蛋白的工藝條件：NaOH質(zhì)量濃度0.4%、固液比1∶8、提取時間2 h，碎米蛋白提取率達70.79%；得到高剪切輔助酶法提高碎米蛋白溶解性的工藝條件：剪切轉(zhuǎn)速3500 r/min、剪切時間30 min、剪切溫度45 ℃、加酶量1.5%，碎米蛋白溶解度由0.53%提高到28.00%。超聲波與堿法聯(lián)用可提高碎米蛋白提取率，高剪切輔助酶法可提高碎米蛋白溶解性。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）