具群體感應(yīng)抑制作用短小芽孢桿菌F3—1菌株的誘變育種

彭孟凡 范斌 張慶華 宋增福

摘要：【目的】獲得群體感應(yīng)（QS）信號(hào)分子降解能力更強(qiáng)的突變短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），增強(qiáng)其在水產(chǎn)細(xì)菌性病害防治中的效果，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)利用細(xì)菌QS淬滅機(jī)制防治細(xì)菌性疾病提供借鑒。【方法】以具有降解QS信號(hào)分子特性的短小芽孢桿菌F3-1為出發(fā)菌株、紫外線和亞硝酸鈉（NaNO2）為誘變劑進(jìn)行誘變選育；以紫色桿菌（Chromobacteria violaceum ATCC12472）為報(bào)告菌株篩選正向突變，經(jīng)連續(xù)傳代25代后測(cè)定其遺傳穩(wěn)定性；采用單因素試驗(yàn)測(cè)定培養(yǎng)時(shí)間、pH、鹽度和溫度對(duì)突變菌株降解QS信號(hào)分子能力的影響，同時(shí)通過(guò)擴(kuò)增QS抑制基因aiiA及SDS-PAGE分析驗(yàn)證突變菌株的蛋白表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】?jī)煞N誘變方法共獲得205株突變菌株，以紫色桿菌為報(bào)告菌株通過(guò)紫外誘變篩選出具有QS抑制作用的正向突變株4株，編號(hào)分別為FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-1。其中，突變菌株FF1-2的蛋白產(chǎn)量達(dá)47.48±2.87 μg/mL，約是出發(fā)菌株F3-1的3.12倍，對(duì)紫色桿菌的褪色圈直徑是出發(fā)菌株F3-1的2.96倍，抑制紫色素的能力較出發(fā)菌株F3-1提高64%，說(shuō)明該突變菌株具有很強(qiáng)的QS抑制能力；連續(xù)傳代25代后，突變菌株FF1-2的產(chǎn)蛋白能力及對(duì)紫色素的抑制作用無(wú)顯著變化（P>0.05）。突變菌株FF1-2在培養(yǎng)時(shí)間為40 h、溫度30 ℃、鹽度0.5%、pH 7.0時(shí)，紫色素褪色效果最佳。從出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2中均能擴(kuò)增獲得753 bp的aiiA基因，且通過(guò)SDS-PAGE分析驗(yàn)證二者在28 kD處均呈現(xiàn)出特異條帶?！窘Y(jié)論】采用誘變育種技術(shù)篩選得到的突變菌株FF1-2能顯著提高QS抑制能力，且該抑制能力能穩(wěn)定遺傳，即通過(guò)誘變育種技術(shù)提高短小芽孢桿菌的產(chǎn)酶量及酶活力具有可行性。

關(guān)鍵詞： 短小芽孢桿菌；群體感應(yīng)（QS）；誘變育種；aiiA基因；紫色桿菌

中圖分類號(hào)： S942.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）07-1423-09

0 引言

【研究意義】抗生素能大幅度降低水產(chǎn)細(xì)菌性疾病的死亡率，但過(guò)度使用易導(dǎo)致抗性病原菌形成及病原菌耐藥性、多重耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重（王瑞旋，2007；Verner-Jeffreys et al.，2009）。因此，探索新的細(xì)菌性病害防治手段勢(shì)在必行。群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）是指細(xì)菌自身釋放一些小分子化合物，當(dāng)這些化合物累積到某個(gè)閾值時(shí)能與特定的受體蛋白結(jié)合，開(kāi)啟相關(guān)基因的表達(dá)（Tang and Zhang，2014）。目前已知大多數(shù)革蘭氏陰性致病菌存在以N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）為信號(hào)分子的QS系統(tǒng)（Koul and Kalia，2017），許多毒力因子的表達(dá)均受其直接或間接調(diào)控（Surette et al.，1999）。淬滅QS信號(hào)分子的作用靶點(diǎn)與傳統(tǒng)抗生素完全不同，僅通過(guò)阻斷信號(hào)分子而抑制病原的致病能力，不影響細(xì)菌生長(zhǎng)，從而避免耐藥突變株的出現(xiàn)（Koul et al.，2016）。因此，通過(guò)抑制細(xì)菌QS系統(tǒng)降低病原菌致病力的策略，為水產(chǎn)細(xì)菌性病害防治提供了新思路?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，主要是通過(guò)QS淬滅酶降解信號(hào)分子，如aiiA基因編碼的AiiA蛋白是一類由芽孢桿菌產(chǎn)生的?；呓z氨酸內(nèi)酯酶，能專一性降解AHLs信號(hào)分子而破壞依賴QS的致病機(jī)制，降低病原菌的致病性。Dong等于2000年在蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）中首次發(fā)現(xiàn)具有群體感應(yīng)降解作用的AiiA酶，并證實(shí)其具有降解QS信號(hào)分子的作用。此后，在多種芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)AiiA酶（Dong et al.，2002；Pan et al.，2008；曾世涌等，2013；Vinoj et al.，2014），且研究證實(shí)通過(guò)生物工程技術(shù)手段表達(dá)AiiA酶在動(dòng)植物病原菌防控方面發(fā)揮了重要作用（楊梅等，2007；Chen et al.，2010）。盡管通過(guò)基因工程可獲得較高產(chǎn)量的AiiA酶，但也存在表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)不穩(wěn)定的問(wèn)題。Chen等（2010）用畢赤酵母成功表達(dá)獲得AiiA酶，但使用同樣分泌型表達(dá)載體，在婁瑞娟等（2010）的研究中并未完全表達(dá)出來(lái)，其原因可能是酵母表達(dá)系統(tǒng)本身的缺陷及重組mRNA中有非編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄阻斷而導(dǎo)致某些蛋白表達(dá)不理想。利用基因克隆技術(shù)能實(shí)現(xiàn)降解酶基因在大腸桿菌或畢赤酵母中表達(dá)，并提高降解酶的產(chǎn)量和活性，但得到的菌株缺乏穩(wěn)定性且功能單一，不具備芽孢桿菌的益生作用，加上生產(chǎn)成本偏高，而不利于大規(guī)模生產(chǎn)（黃志立等，2001）。誘變育種是非特異性改變菌株特性的一種簡(jiǎn)便方法，雖然不能像基因工程技術(shù)一樣對(duì)菌株進(jìn)行定向定點(diǎn)突變，但可通過(guò)反復(fù)誘變及后期特異性篩選獲得目的突變菌株，目前已在菌株性能改良中廣泛應(yīng)用。呂志偉等（2011）通過(guò)紫外誘變地衣芽孢桿菌LCB-8得到突變菌株DY-97，其酶活力提高了17%；余祖華等（2016）利用該方法對(duì)產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌進(jìn)行紫外線誘導(dǎo)，并成功獲得其突變菌株；吳勇等（2017）以紫外誘變枯草芽孢桿菌BS303，結(jié)果獲得常溫和低溫條件下對(duì)枯萎病均有很強(qiáng)拮抗能力且能顯著降低土壤病原菌數(shù)量的菌株?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用紫外誘變技術(shù)提高菌株的產(chǎn)酶量及酶活力已在地芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌中得到廣泛應(yīng)用，但針對(duì)短小芽孢桿菌（B. pumilus）的研究很少，尤其利用該技術(shù)將芽孢桿菌應(yīng)用于群體感應(yīng)抑制作用方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從誘變育種技術(shù)角度入手，通過(guò)對(duì)前期從鯽魚腸道分離獲得且具QS抑制作用的短小芽孢桿菌F3-1（宋增福等，2013）進(jìn)行誘變選育，以期獲得QS信號(hào)分子降解能力更強(qiáng)的突變菌株，增強(qiáng)其在水產(chǎn)細(xì)菌性病害防治中的效果，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)利用細(xì)菌QS淬滅機(jī)制防治細(xì)菌性疾病提供借鑒。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試菌株：短小芽孢桿菌F3-1由本課題組分離保存提供；紫色桿菌（Chromobacteria violaceum ATCC12472）購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。主要試劑：亞硝酸鈉（NaNO2），二甲基亞砜（DMSO），乙酸乙酯（C4H8O2），甲醇（CH3OH），硫酸銨[（NH4）2SO4]，0.1 mmol/L HCl和0.1 mmol/L NaOH，PCR Master Mix。供試培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2）、LB液體培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.4）。主要儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)（SW-CJ-IF，蘇州凈化設(shè)備有限公司），高壓滅菌器（YXQ-LS-18SI，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），生化培養(yǎng)箱（SPX-100B-Z，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），離心機(jī)（TDL80-2B，上海安亭科學(xué)儀器有限公司），分光光度計(jì)（722型，上海精密儀器儀表有限公司），凝膠成像儀[GEL DOC XR，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]，小垂直板電泳槽。

1. 2 菌株F3-1誘變育種

1. 2. 1 菌株F3-1生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將活化菌株F3-1以1%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃下?lián)u床（160 r/min）培養(yǎng)。每2 h測(cè)定一次OD600 nm，并繪制短小芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線。

1. 2. 2 誘變育種及突變菌株篩選 紫外誘變參照夏錢華等（2017）的方法：將1.7×108 CFU/mL的F3-1菌懸液涂布于LB培養(yǎng)基上，于15 W紫外燈下（距離30 cm）分別照射5、10、15、20和25 min后，28 ℃培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌水梯度稀釋后重新涂布于LB培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)。亞硝酸鈉（NaNO2）誘變參照Wu等（2013）的方法：接種1.7×108 CFU/mL的F3-1菌懸液于LB液體培養(yǎng)基中，分別加入終濃度為5、10、15、20和25 g/L的NaNO2溶液，28 ℃培養(yǎng)24 h后涂布于LB培養(yǎng)基上，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。

突變菌株篩選：以紫色桿菌ATCC12472為報(bào)告菌株，將誘變菌株轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24 h，10000 r/min離心10 min后過(guò)0.22 μm濾膜，收集濾液；吸取濾液滴到濾紙片上，吹干后反扣于涂布有紫色桿菌的LB培養(yǎng)基上，26 ℃倒置培養(yǎng)48 h，依據(jù)能否使紫色桿菌紫色素褪去確定陽(yáng)性突變菌株，并根據(jù)褪色圈確定突變效果（Chenia，2013）。

1. 2. 3 突變菌株粗提物對(duì)紫色桿菌生長(zhǎng)的影響 粗提物制備參照肖支葉等（2017）的方法：突變菌株于28 ℃下?lián)u床（120 r/min）培養(yǎng)6～10 h，超聲破碎后用乙酸乙酯萃取，充分振蕩后靜置過(guò)夜，8000 r/min離心20 min，取上層有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（40 ℃）濃縮至干，干燥物用甲醇溶解至100 g/L。稀釋紫色桿菌菌液至OD600 nm=0.05，每組試管中加入突變菌株粗提物至終濃度100 mg/L，26 ℃下?lián)u床（120 r/min）培養(yǎng)，以不加粗提物為對(duì)照組。每2 h測(cè)定一次OD600 nm，檢測(cè)突變菌株粗提物對(duì)紫色桿菌生長(zhǎng)的影響。

1. 2. 4 突變菌株粗提物對(duì)紫色桿菌紫色素產(chǎn)量的影響 稀釋紫色桿菌菌液至OD600 nm=0.05，每組分別加入終濃度100 mg/L的突變菌株粗提物，26 ℃下?lián)u床（120 r/min）培養(yǎng)16 h后測(cè)定紫色素含量。紫色素提取參照許嫚（2015）的方法：突變菌株粗提物與紫色桿菌的混合液經(jīng)12000 r/min離心10 min后，加入DMSO并充分渦旋振蕩，再次離心后收集上清液于585 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD。

1. 2. 5 突變菌株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定 將誘變后QS抑制效果最強(qiáng)的菌株接種于LB培養(yǎng)基連續(xù)傳代25代，利用濾紙片法（同1.2.2）每傳代5代測(cè)定其褪色直徑，同時(shí)測(cè)定蛋白產(chǎn)量及紫色素的OD585 nm，評(píng)價(jià)菌株的遺傳穩(wěn)定性。其中，胞外蛋白粗提參照余祖華等（2016）的方法：過(guò)夜培養(yǎng)的菌液在4 ℃下10000 r/min離心15 min，過(guò)0.22 μm濾膜，加入固體硫酸銨至80%飽和度，4 ℃靜置過(guò)夜后再次離心，以PBS溶解沉淀，即為蛋白粗提液；然后采用Bradford法測(cè)定菌株蛋白產(chǎn)量。

1. 3 不同環(huán)境下突變菌株對(duì)紫色素的抑制能力

1. 3. 1 培養(yǎng)時(shí)間 將出發(fā)菌株（F3-1）和突變菌株的粗提物分別加入已接種紫色桿菌的LB培養(yǎng)基中，26 ℃培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，參照1.2.5的方法提取紫色素并測(cè)定OD585 nm。

1. 3. 2 pH 用0.1 mmol/L HCl或0.1 mmol/L NaOH調(diào)節(jié)出發(fā)菌株和突變菌株粗提物的pH分別為3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，作用1 h后將pH調(diào)至7.0，測(cè)定OD585 nm，方法同1.2.5。

1. 3. 3 鹽度 用氯化鈉配制鹽度0.5%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%和10.0%的培養(yǎng)基，將出發(fā)菌株和突變菌株分別接種于上述培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD585 nm，方法同1.2.5。

1. 3. 4 溫度 按照1.2.5的方法制備粗提物后，分別在20 ℃處理24 h、30 ℃處理24 h、40 ℃處理12 h、50 ℃處理1 h和60 ℃處理30 min后加入已接種紫色桿菌的培養(yǎng)基，測(cè)定OD585 nm。

1. 4 QS抑制基因aiiA檢測(cè)

根據(jù)NCBI已公布的aiiA基因序列（EF219409），利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。引物序列為：F（5'-ATGGGATCCATGACAGTAAAGAAGCTTTAT-3'）和R（5'-GTCGAATTCCTCAACAAGATACTCCTAA

TG-3'）。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：2×Master Mix 25.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 22.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.7%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1. 5 突變菌株蛋白粗提液SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE分析出發(fā)菌株和突變菌株的粗蛋白提取液，方法同1.2.5，并進(jìn)行凝膠分析儀成像分析。

1. 6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行方差分析，并以Turkey進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 短小芽孢桿菌F3-1的生長(zhǎng)曲線

菌株F3-1的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的延遲期后，菌株F3-1從第8 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其后菌體生長(zhǎng)迅速，菌體濃度快速升高；穩(wěn)定期在培養(yǎng)24～40 h。根據(jù)菌株F3-1的生長(zhǎng)曲線選取培養(yǎng)20 h的菌體進(jìn)行誘變處理。

2. 2 突變菌株篩選結(jié)果

兩種誘變方法共獲得205株突變菌株，其中以紫色桿菌ATCC12472為報(bào)告菌株通過(guò)紫外誘變篩選出具有QS抑制作用的正向突變菌株4株，編號(hào)分別為FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-1。由表1可知，與出發(fā)菌株F3-1相比，4株突變菌株的QS抑制能力均明顯提高。其中，突變菌株FF1-2經(jīng)28 ℃培養(yǎng)24 h的蛋白產(chǎn)量達(dá)47.48±2.87 μg/mL，約是出發(fā)菌株F3-1（15.2 μg/mL）的3.12倍，二者差異顯著（P<0.05，下同），對(duì)紫色桿菌的褪色圈直徑是出發(fā)菌株的2.96倍（圖2），即突變菌株FF1-2的誘變效果最佳。

2. 3 突變菌株粗提物對(duì)紫色桿菌生長(zhǎng)的影響

突變菌株粗提物對(duì)紫色桿菌生長(zhǎng)的影響如圖3所示。將出發(fā)菌株F3-1及突變菌株FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-2的粗提物分別加入含紫色桿菌菌液的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)紫色桿菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)照組一致，無(wú)顯著影響（P>0.05，下同）。

2. 4 突變株粗提物對(duì)紫色桿菌產(chǎn)紫色素的影響

4株突變菌株粗提物對(duì)紫色桿菌產(chǎn)紫色素有明顯影響（圖4）。其中，突變菌株FF1-2的OD585 nm顯著低于出發(fā)菌株F3-1，抑制紫色素的能力最強(qiáng)（圖5）。紫色素抑制率（%）=（1-A1/A0）×100。式中，A0為出發(fā)菌株F3-1的OD585 nm，A1為突變菌株的OD585 nm。根據(jù)該公式計(jì)算得出，突變菌株FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-1對(duì)紫色桿菌紫色素的抑制率分別為64%、42%、33%和47%。

2. 5 突變株轉(zhuǎn)接穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)QS抑制作用最強(qiáng)的突變菌株FF1-2連續(xù)傳代25代，每隔5代測(cè)定其蛋白含量、對(duì)紫色桿菌的褪色直徑及對(duì)紫色素的抑制能力。結(jié)果顯示，突變菌株FF1-2在連續(xù)傳代25代后，對(duì)紫色桿菌的褪色能力無(wú)明顯變化（圖6）。由圖7可知，傳代25代后突變菌株FF1-2對(duì)紫色桿菌的褪色直徑仍穩(wěn)定在3.7 cm，蛋白產(chǎn)量穩(wěn)定在46.7±1.58 μg/mL，對(duì)紫色素的降解能力差異不顯著，說(shuō)明該突變菌株的突變特性遺傳穩(wěn)定。

2. 6 不同培養(yǎng)條件下突變菌株FF1-2對(duì)紫色素的抑制能力

2. 6. 1 培養(yǎng)時(shí)間 隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2對(duì)紫色素的抑制作用均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在培養(yǎng)24～48 h的抑制作用最佳。出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2均在培養(yǎng)至40 h時(shí)對(duì)紫色素的抑制作用最強(qiáng)，且突變菌株FF1-2對(duì)紫色素的抑制能力約是出發(fā)菌株F3-1的3.00倍（圖8）。

2. 6. 2 pH 在pH 3.0～11.0的范圍內(nèi)，出發(fā)菌株F3-1抑制紫色素的能力受pH變化影響較突變菌株FF1-2的小，二者對(duì)紫色素的抑制能力均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且在pH 7.0時(shí)的抑制能力最強(qiáng)，突變菌株FF1-2對(duì)紫色素的抑制能力約是出發(fā)菌株F3-1的2.50倍（圖9）。

2. 6. 3 鹽度 鹽度對(duì)出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2抑制紫色素能力的影響見(jiàn)圖10。當(dāng)鹽度由0.5%升至4.0%時(shí)，出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2對(duì)紫色素的抑制能力降低，當(dāng)鹽度超過(guò)6.0%后曲線趨于平穩(wěn)。因此，可確定鹽度為0.5%時(shí)的抑制能力最強(qiáng)，鹽度升高則不利于出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2對(duì)紫色素的抑制作用。

2. 6. 4 溫度 經(jīng)出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2作用后的紫色桿菌，其紫色素含量在20～30 ℃呈下降趨勢(shì)，至30 ℃時(shí)OD585 nm達(dá)最低值，之后呈上升趨勢(shì)。說(shuō)明30 ℃為最適合降解紫色素的溫度，且突變菌株FF1-2在30 ℃下對(duì)紫色素的抑制能力約是出發(fā)菌株F3-1的3.00倍（圖11）。

2. 7 QS抑制基因aiiA的克隆結(jié)果

根據(jù)NCBI已公布的aiiA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物以1.7%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2均在750 bp附近出現(xiàn)明顯條帶（圖12），測(cè)序結(jié)果表明其基因片段大小與Dong等（2000）的研究報(bào)道一致，即兩株菌株的基因序列中均含有753 bp的目的基因片段。

2. 8 誘變前后菌株胞外蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果

短小芽孢桿菌F3-1誘變前后胞外蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果見(jiàn)圖13。出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2在28 kD處均呈現(xiàn)出特異條帶，其分子量與Easwaran等（2015）的研究報(bào)道一致，且突變菌株FF1-2的蛋白表達(dá)量明顯高于出發(fā)菌株F3-1。

3 討論

誘變育種是微生物的常規(guī)育種技術(shù)，是以化學(xué)或物理手段誘發(fā)基因突變，通過(guò)篩選突變體，定向?qū)ふ艺蛲蛔兊囊豁?xiàng)技術(shù)。該方法突變率高，在短時(shí)間內(nèi)可獲得大量的優(yōu)良變異類型，且誘變手段多樣，操作簡(jiǎn)便，是實(shí)驗(yàn)室研究及工業(yè)生產(chǎn)中最常用的優(yōu)良菌株選育方法（范俊英等，2012；艾冰花等，2015；白豆等，2016）。同時(shí)，芽孢桿菌是目前水產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛的益生菌，具有易生產(chǎn)、便運(yùn)輸、耐儲(chǔ)藏等特點(diǎn)，在調(diào)節(jié)水質(zhì)、增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力、減少病害發(fā)生等方面效果顯著，是常用的益生微生物菌株（Hong et al.，2005）。本研究以前期篩選出的一株具有QS信號(hào)分子降解能力的短小芽孢桿菌F3-1（宋增福等，2013）為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外誘變獲得4株突變菌株（FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-1），其中，突變菌株FF1-2的蛋白產(chǎn)量達(dá)47.48±2.87 μg/mL，約是出發(fā)菌株F3-1的3.12倍，對(duì)紫色桿菌的褪色圈直徑是出發(fā)菌株F3-1的2.96倍，抑制紫色素的能力較出發(fā)菌株F3-1提高64%，說(shuō)明紫外誘變獲得的突變菌株FF1-2具有很強(qiáng)的QS抑制能力；連續(xù)傳代25代后，突變菌株FF1-2的產(chǎn)蛋白能力及對(duì)紫色素的抑制作用無(wú)明顯變化，說(shuō)明該突變菌株的突變特性遺傳穩(wěn)定，為解決利用分子生物學(xué)技術(shù)中因質(zhì)粒穩(wěn)定性差等而導(dǎo)致基因工程菌不穩(wěn)定的問(wèn)題提供了參考。此外，從出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2中均能擴(kuò)增獲得753 bp的aiiA基因，且通過(guò)SDS-PAGE分析驗(yàn)證二者在28 kD處均呈現(xiàn)出特異條帶，但突變菌株FF1-2的蛋白表達(dá)量明顯高于出發(fā)菌株F3-1。根據(jù)Easwaran等（2015）、Vinoj等（2015）的研究結(jié)果（QS信號(hào)分子降解酶AiiA的分子量為28 kD），可初步推測(cè)兩株菌株的QS抑制作用蛋白可能為AiiA同源酶。

短小芽孢桿菌與其他微生物一樣，其產(chǎn)酶活性與培養(yǎng)溫度、時(shí)間、pH及鹽度等條件密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，突變菌株FF1-2的最佳抑制紫色素時(shí)間為40 h，對(duì)紫色素的抑制能力約是出發(fā)菌株F3-1的3.00倍，在培養(yǎng)24～48 h內(nèi)抑制能力較強(qiáng)，培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)40 h后抑制能力逐漸下降。這可能是培養(yǎng)24～48 h的菌株已處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌株生長(zhǎng)達(dá)到一定濃度，產(chǎn)酶量不斷積累，QS抑制能力強(qiáng)，但培養(yǎng)48 h進(jìn)入衰退期后菌株產(chǎn)蛋白能力有所下降，對(duì)紫色素的抑制作用也隨之變?nèi)?；突變菌株FF1-2在pH 7.0～9.0時(shí)對(duì)紫色素的抑制能力最強(qiáng)，其抑制能力約是出發(fā)菌株F3-1的2.50倍；最適溫度為30 ℃，超過(guò)50 ℃后菌株誘變前后對(duì)紫色素的抑制能力基本一致。此外，出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2對(duì)紫色素抑制的最適鹽度均在0.5%左右，超過(guò)6.0%的鹽度對(duì)菌株抑制紫色素的影響不明顯，對(duì)鹽度的適應(yīng)能力高于張美超等（2011）在畢赤酵母菌中克隆表達(dá)的AiiA-AIO6酶工程菌?？傊蛔兙闒F1-2對(duì)紫色素抑制能力的理化因素與AHLs活性的最適條件相統(tǒng)一，可進(jìn)一步推測(cè)SDS-PAGE分析中28 kD處的蛋白條帶即為AiiA同源蛋白。

本研究首次通過(guò)誘變育種技術(shù)篩選出能穩(wěn)定遺傳且對(duì)QS信號(hào)分子高效敏感的短小芽孢桿菌突變菌株FF1-2，與基因克隆方法相比，誘變育種手段多樣，操作簡(jiǎn)便，能豐富和拓寬菌種的變異類型，尤其是自然界少有的性狀變異，增加可利用的基因資源。以此為基礎(chǔ)，利用分子克隆手段查找變異位點(diǎn)，確定誘變育種菌株的QS分子機(jī)制，可為突變菌株FF1-2的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

采用誘變育種技術(shù)篩選得到的突變菌株FF1-2能顯著提高QS抑制能力，且該抑制能力能穩(wěn)定遺傳，即通過(guò)誘變育種技術(shù)提高短小芽孢桿菌的產(chǎn)酶量及酶活力具有可行性。

參考文獻(xiàn)：

艾冰花，李秉鈞，馮俊榮. 2015. 一株產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌紫外誘變育種的初步研究[J]. 漁業(yè)現(xiàn)代化，42（4）：39-43. [Ai B H，Li B J，F(xiàn)eng J R. 2015. Preliminary study on the ultraviolet mutagenesis of a protease producing strain Baci-llus Amyloliquefaciens[J]. Fishery Modernization，42（4）：39-43.]

白豆，龍玲，朱乃碩. 2016. 一株產(chǎn)1-脫氧野尻霉素（DNJ）枯草芽孢桿菌黑色變種的誘變育種研究[J]. 復(fù)旦學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），55（1）：104-111. [Bai D，Long L，Zhu N S. 2016. Mutation breeding of a isolated Bacillus subtilis var. niger for producing the 1-Deoxynojirimycin[J]. Journal of Fudan University（Natural Science），55（1）：104-111.]

范俊英，方慧英，諸葛斌，諸葛健. 2012. 3-羥基丙酸高產(chǎn)菌株的篩選及誘變選育[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，39（9）：1355-1362. [Fan J Y，F(xiàn)ang H Y，Zhuge B，Zhuge J. 2012. Isolation，identification and mutation breeding of 3-hydroxypropionic acid high production strain[J]. Microbiology China，39（9）：1355-1362.]

黃志立，羅立新，楊汝德，梁世中. 2001. 納豆激酶基因重組質(zhì)粒在大腸桿菌與畢赤酵母中的穩(wěn)定性[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，17（4）：254-256. [Huang Z L，Luo L X，Yang R D，Liang S Z. 2001. Stability of nattokinase gene in E. coli and yeast Pichia patoria[J]. Academic Journal of Guangdong College of Pharmacy，17（4）：254-256.]

婁瑞娟，張霞，羅利龍，徐操，宋水山. 2010. aiiA基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其在畢赤酵母中的表達(dá)[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，37（5）：658-663. [Lou R J，Zhang X，Luo L L，Xu C，Song S S. 2010. Construction of an aiiA-expression vector and its expression in Pichia pastoris[J]. Microbiology China，37（5）：658-663.]

呂志偉，王瑾，張文會(huì). 2011. 地衣芽孢桿菌LCB-8的紫外誘變及優(yōu)良菌株的選育[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，39（32）：19995-19996. [Lü Z W，Wang J，Zhang W H. 2011. Ultraviolet mutagenesis of Bacillus licheniformis LCB- 8 and scree-ning of high-yielding strain[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，39（32）：19995-19996.]

宋增福，范斌，郭婧，李娟英，潘連德，陳彪，張慶華. 2013. 具有群體感應(yīng)抑制效果芽孢桿菌的篩選與鑒定[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，37（6）：1059-1065. [Song Z F，F(xiàn)an B，Guo J，Li J Y，Pan L D，Chen B，Zhang Q H. 2013. Screening and identification of Bacillus to inhibit quorum sensing[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，37（6）：1059-1065.]

王瑞旋，王江勇，徐力文，馮娟. 2007. 軍曹魚養(yǎng)殖水體及其腸道弧菌的耐藥性研究[J]. 南方水產(chǎn)，3（5）：1-6. [Wang R X，Wang J Y，Xu L W，F(xiàn)eng J. 2007. Antibiotic resistance of vibrio strains isolated from cobia（Rachycentron canadum） farming water and their digestion guts[J]. South China Fisheries Science，3（5）：1-6.]

吳勇，黃巧云，陳雯莉. 2017. 低溫生防菌枯草芽胞桿菌BS303的選育及其效果驗(yàn)證[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，36（3）：19-24. [Wu Y，Huang Q Y，Chen W L. 2017. Bree-ding and characterization of a low temperature biological control strain BS303[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，36（3）：19-24.]

夏錢華，尤朝陽(yáng)，張攀，張路廣，許學(xué)峰，湯云春. 2017. 微波和紫外誘變選育高效石油烴降解菌株[J]. 水處理技術(shù)，43（4）：36-41. [Xia Q H，You C Y，Zhang P，Zhang L G，Xu X F，Tang Y C. 2017. Microwave UV compound mutation breeding of efficient petroleum hydrocarbon degrading strains[J]. Technology of Water Treatment，43（4）：36-41.]

肖支葉，胡唐閣然，王四海，趙能，陳中華，原曉龍，鄭科，王毅. 2017. 蒜頭果根粗提取物的抑菌活性研究[J]. 西部林業(yè)科學(xué)，46（2）：68-73. [Xiao Z Y，Hutang G R，Wang S H，Zhao N，Chen Z H，Yuan X L，Zheng K，Wang Y. 2017. Study on the antimicrobial activity from the crude extracts of roots of Malania oleifera Chun et Lee[J]. Journal of West China Forestry Science，46（2）：68-73.]

許嫚. 2015. 詹森桿菌紫色桿菌素優(yōu)化鑒定及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的作用[D]. 天津：天津大學(xué). [Xu M. 2015 Optimization and identification of violacein by Janthinobacterium lividum and its effect on the colon cancer cell HT-29[D]. Tianjin：Tianjin University.]

楊梅，姚帆，黃勤清，黃天培，周志宏，關(guān)夏玉，黃志鵬，關(guān)雄. 2007. 不同來(lái)源的蘇云金芽孢桿菌aiiA基因表達(dá)及其抗病性分析[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，13（3）：373-381. [Yang M，Yao F，Huang Q Q，Huang T P，Zhou Z H，Guan X Y，Huang Z P，Guan X. 2007. Expression and antimicrobiotic activity of aiiA gene from different strains of Bacillus thuringiensis[J]. Chinese Journal of Applied & Environmental Biology，13（3）：373-381.]

余祖華，丁軻，侯奎，李元曉，李旺，劉一塵，曹平華，賈艷艷，程相朝. 2016. 產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌的誘變選育及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，43（4）：1006-1011. [Yu Z H，Ding K，Hou K，Li Y X，Li W，Liu Y C，Cao P H，Jia Y Y，Cheng X Z. 2016. Mutation breeding and optimization of enzyme-producing condition of Bacillus lichenniformis producing cellulase[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，43（4）：1006-1011.]

張美超，曹雅男，姚斌，白東清，周志剛. 2011. 淬滅酶AiiO-AIO6酶學(xué)性質(zhì)及對(duì)嗜水氣單胞菌毒力因子的表達(dá)調(diào)控[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，35（11）：1720-1728. [Zhang M C，Cao Y N，Yao B，Bai D Q，Zhou Z G. 2011. Characteristics of quenching enzyme AiiO-AIO6 and its effect on Aeromo-nas hydrophila virulence factors expression[J]. Journal of Fisheries of China，35（11）：1720-1728.]

曾世涌，溫真，何海滔，楊彩云，毛惠民，楊梅. 2013. 蘇云金芽孢桿菌aiiA基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)[J]. 福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），29（3）：104-109. [Zeng S Y，Wen Z，He H T，Yang C Y，Mao H M，Yang M. 2013. Expre-ssion of aiiA gene from Bacillus thuringiensis in Bacillus subtilis[J]. Journal of Fujian Normal University（Natural Science Edition），29（3）：104-109.]

Chen R，Zhou Z，Cao Y，Bai Y，Yao B. 2010. High yield expression of an AHL-lactonase from Bacillus sp. B546 in Pichia pastoris and its application to reduce Aeromonas hydrophila mortality in aquaculture[J]. Microbial Cell Factories，9： 39. doi： 10.1186/1475-2859-9-39.

Chenia H Y. 2013. Anti-quorum sensing potential of crude Kigelia africana fruit extracts[J]. Sensors，13（2）：2802-2817.

Dong Y H，Gusti A R，Zhang Q，Xu J L，Zhang L H. 2002. Identification of quorum-quenching N-acyl homoserine lactonases from Bacillus species[J]. Applied and Environmental Microbiology，68（4）：1754-1759.

Dong Y H，Xu J L，Li X Z，Zhang L H. 2000. AiiA，an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，97（7）：3526-3531.

Easwaran N，Karthikeyan S，Sridharan B，Gothandam K M. 2015. Identification and analysis of the salt tolerant pro-perty of AHL lactonase（AiiATSAWB） of Bacillus species[J]. Journal of Basic Microbiology，55（5）：579-590.

Hong H A，Le H D，Cutting S M. 2005. The use of bacterial spore formers as probiotics[J]. FEMS Microbiology Reviews，29（4）：813-835.

Koul S，Kalia V C. 2017. Multiplicity of quorum quenching enzymes：A potential mechanism to limit quorum sensing bacterial population[J]. Indian Journal of Microbiology，57（1）：100-108.

Koul S，Prakash J，Mishra A，Kalia V C. 2016. Potential emergence of multi-quorum sensing inhibitor resistant（MQSIR） bacteria[J]. Indian Journal of Microbiology，56（1）：1-18.

Pan J，Huang T，Yao F，Huang Z，Powell C A，Qiu S，Guan X. 2008. Expression and characterization of aiiA gene from Bacillus subtilis BS-1[J]. Microbiological Research，163（6）：711-716.

Surette M G，Miller M B，Bassler B L. 1999. Quorum sensing in Escherichia coli，Salmonella typhimurium，and Vibrio harveyi：A new family of genes responsible for autoindu-cer production[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，96（4）：1639-1644.

Tang K，Zhang X H. 2014. Quorum quenching agents：Resources for antivirulence therapy[J]. Marine Drugs，12（6）：3245-3282.

Verner-Jeffreys D W，Welch T J，Schwarz T，Pond M J，Woodward M J，Haig S J，Rimmer G S，Roberts E，Morrison V，Baker-Austin C. 2009. High prevalence of multidrug-tolerant bacteria and associated antimicrobial resistance genes isolated from ornamental fish and their carriage water[J]. PLoS One，4（12）：e8388.

Vinoj G，Pati R，Sonawane A，Vaseeharan B. 2015. In vitro cytotoxic effects of gold nanoparticles coated with functional acyl homoserine lactone lactonase protein from Bacillus licheniformis and their antibiofilm activity against Proteus species[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，59（2）：763-771.

Vinoj G，Vaseeharan B，Thomas S，Spiers A J，Shanthi S. 2014. Quorum-quenching activity of the AHL-lactonase from Bacillus licheniformis DAHB1 inhibits Vibrio biofilm formation in vitro and reduces shrimp intestinal colonisation and mortality[J]. Marine Biotechnology，16（6）：707-715.

Wu Y，Huang Y，Jin L I，Long Z. 2013. Screening of prolific Micromonospora carbonacea in antibiotics production by sodium nitrite mutagenesis[J]. Agricultural Science & Technology，14（10）：1409-1412.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）