不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物多樣性的動態(tài)分析

佟延南 李芳遠 李忠琴 趙光軍 李高俊 王德強

摘要：【目的】動態(tài)分析不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物的多樣性，為科學(xué)利用益生菌對羅非魚腸道和養(yǎng)殖環(huán)境中微生態(tài)結(jié)構(gòu)進行定向改良提供理論依據(jù)?！痉椒ā糠謩e于羅非魚養(yǎng)殖周期的前期（C1，4月）、中期（C2，6月）和后期（C3，8月）采集羅非魚腸道樣品，以試劑盒提取腸道總細菌DNA，經(jīng)PCR擴增后對16S rDNA的V3～V4區(qū)進行高通量測序，并對腸道微生物進行物種組成差異分析?！窘Y(jié)果】各樣品測序中Tag數(shù)量平均為60694條，測序長度平均為440 bp，OTU Shannon稀釋曲線趨于平緩并達到平臺期；平均OTU數(shù)量排序為C2期（9376.125）>C3期（8591.375）>C1期（6567.667），chao1、ACE、Shannon和npShannon指數(shù)也表現(xiàn)出相同規(guī)律，但Simpson指數(shù)的排序為C2期（0.0405716）C3期>C1期。在各養(yǎng)殖階段微生物種群數(shù)量占2.00%以上有11個門和14個屬，優(yōu)勢菌群有所差異，隨養(yǎng)殖周期的推移，乳球菌屬所占比例逐漸下降，芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和分支桿菌屬呈先增后減的變化趨勢，梭菌屬和鄰單胞菌屬在養(yǎng)殖前期所占比例最高。此外，不同地區(qū)相同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物豐度差異標記類群存在一定差異，但也存在相似之處，如養(yǎng)殖前期以棲水菌屬最具代表性，中期主要以芽孢桿菌科豐度最高。【結(jié)論】不同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物組成差異明顯，且不同地區(qū)相同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物豐度差異標記類群也存在一定差異，可能與魚種來源、養(yǎng)殖環(huán)境及飼料有關(guān)。因此，生產(chǎn)中應(yīng)結(jié)合實際情況，科學(xué)利用益生菌對羅非魚腸道和養(yǎng)殖環(huán)境中微生態(tài)結(jié)構(gòu)進行定向改良，切忌盲目使用益生菌。

關(guān)鍵詞： 羅非魚；腸道微生物；群落結(jié)構(gòu)；多樣性；高通量測序

中圖分類號： S965.125 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）07-1415-08

0 引言

【研究意義】魚類腸道微生物存在于腸道壁、腸道黏膜及其內(nèi)容物中（Cheesman and Guillemin，2007；Dethlefsen et al.，2007），是魚類腸道的重要組成部分（宋增福和吳天星，2007；呂欣榮和肖克宇，2008），在維持機體代謝、發(fā)育及進化等方面發(fā)揮重要作用（趙明曉和賀永亮，2008；Bosch and McFall-Ngai，2011；Goodman and Gordon，2010）。魚類腸道微生物處于特殊的腸道環(huán)境和水體環(huán)境中，極易受食物和環(huán)境等因素變化的影響，魚體自身的生長也會影響其腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)（Spanggaard et al.，2000；Savas et al.，2005）。因此，研究分析魚類腸道微生物的多樣性，對篩選益生菌或調(diào)控其養(yǎng)殖環(huán)境等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，研究魚類腸道微生物群落的傳統(tǒng)方法是將微生物純化后再進行培養(yǎng)（覃映雪等，2007；胡秀彩等，2010），該方法可對腸道微生物的形態(tài)、性質(zhì)及其群落結(jié)構(gòu)等進行常規(guī)分析，但在菌落形態(tài)和顏色變化等方面易存在主觀性判斷（Maidie et al.，2003）。此外，有學(xué)者運用變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)繪制出草魚腸道菌群的指紋圖譜（郁二蒙等，2012），雖然該技術(shù)可較全面系統(tǒng)分析腸道菌群的生物多樣性，但在時效上仍不及高通量測序技術(shù)（秦楠等，2011）。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基于PCR的分子生物學(xué)方法越來越多被應(yīng)用于腸道微生物研究（周孟姣和劉臻，2003；趙翔和安志東，2003；凌云等，2010），極大提高了研究效率及分析的準確性，為腸道微生物研究奠定了良好基礎(chǔ)（李鳳和劉世貴，2003；任南琪等，2007）。其中，高通量測序技術(shù)是目前基因組學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的測序技術(shù)，具有通量更高、運行時間更短、測序片段更長、成本更低等優(yōu)點（孫嘉蔓等，2014；葉雷等，2016），能有效避免Sanger法的繁瑣克隆過程。王紹祥等（2014）通過高通量測序技術(shù)研究了魚類養(yǎng)殖環(huán)境的微生物群落特征；許燕等（2018）采用Illumina HiSeq PE250高通量測序技術(shù)研究了斑石鯛腸道的細菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)?！颈狙芯壳腥朦c】目前，采用高通量測序技術(shù)分析養(yǎng)殖羅非魚腸道微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】基于細菌16S rDNA高通量測序技術(shù)對海南省不同養(yǎng)殖地區(qū)整個養(yǎng)殖周期的羅非魚腸道微生物多樣性進行全面系統(tǒng)研究，為科學(xué)利用益生菌對羅非魚腸道和養(yǎng)殖環(huán)境中微生態(tài)結(jié)構(gòu)進行定向改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

分別于羅非魚養(yǎng)殖周期的前期（C1，4月）、中期（C2，6月）和后期（C3，8月）對海南三江（SJ）、文昌（WC）和屯昌（TC）的羅非魚養(yǎng)殖場進行定點樣品采集，每個地點采集三口池塘作為生物學(xué)重復(fù)，樣品編號及其具體信息見表1。

1. 2 DNA提取及16S rDNA高通量測序

采用Sigma公司生產(chǎn)的Stool DNA Kit試劑盒提取羅非魚腸道內(nèi)容物總細菌DNA，并以1%瓊脂糖凝膠電泳和PCR進行檢測。提取的DNA樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司進行16S rDNA高通量測序，測序區(qū)域為V3～V4區(qū)，測序平臺為Illumina Miseq 2×250。

1. 3 測序結(jié)果分析

樣品PCR擴增產(chǎn)物測序后拼接成Tag，并根據(jù)Tag進行物種分類、OTU分析、多樣性分析和多樣品的比較分析等。利用Mothur對測序序列進行去冗余處理，使用基于Naive Bayesian的分類器RDP Classifier工具對Tag進行物種注釋。計算97%相似度下的OTU數(shù)量，并根據(jù)眾數(shù)原則對OTU進行物種注釋。采用PICRUSt進行OTU pathway注釋，以Mothur進行樣品α多樣性分析；采用R軟件進行熱圖分析、PCA分析、β多樣性分析和樣品聚類分析；并以LEfSe分析組間菌群差異。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物的α多樣性差異分析結(jié)果

樣品測序結(jié)果經(jīng)去冗余處理后，各樣品中Tag數(shù)量在24267～87672條，平均為60694條，測序長度301～489 bp，平均為440 bp；OTU Shannon稀釋曲線趨于平緩并達到平臺期（圖1），說明測序量趨于飽和，高通量測序結(jié)果可較全面反映樣品中微生物組成。利用Mothur計算0.03距離下的OTU數(shù)量，再基于OTU計算樣品的α多樣性，結(jié)果（表2）表明，平均OTU數(shù)量排序為C2期（9376.125）>C3期（8591.375）>C1期（6567.667）；此外，C2期的Shannon和npShannon指數(shù)均高于C3期和C1期，但Simpson指數(shù)最小，說明C2期羅非魚腸道中的微生物物種豐度最高，即羅非魚腸道微生物的多樣性排序為C2期>C3期>C1期。

2. 2 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物物種組成差異分析結(jié)果

各養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物種群數(shù)量占2.00%以上的有11個門，厚壁菌門（Firmicutes）為C1期和C2期的優(yōu)勢菌群，藍細菌門（Cyanobacteria）為C3期的優(yōu)勢菌群（表3），其中厚壁菌門隨養(yǎng)殖周期的推移而逐漸減少，表現(xiàn)為C1期（37.13%）>C2期（33.11%）>C3期（17.33%）；變形菌門（Proteobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、TM7和TM6隨養(yǎng)殖周期的推移呈先增后降的變化趨勢；放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和梭桿菌門（Fusobacteria）則隨養(yǎng)殖周期的推移呈不斷增加趨勢（圖2）。

各養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物種群數(shù)量占2.00%以上的屬有14個，分別是分枝桿菌屬（Mycobacterium）、暖繩菌屬（Caldilinea）、聚球藻屬（Synechococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、乳球菌屬（Lactococcus）、梭菌屬（Clostridium）、Cetobacterium、甲基彎曲菌屬（Methylosinus）、鄰單胞菌屬（Plesiomonas）、Methylocaldum、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）（表4）。C1期的優(yōu)勢菌是乳球菌屬（14.96%），其次為梭菌屬（4.96%）和聚球藻屬（5.11%）；C2期的優(yōu)勢菌是乳球菌屬（12.68%），其次為假單胞菌屬（4.40%）和芽孢桿菌屬（3.73%）；C3期的優(yōu)勢菌也是聚球藻屬（4.49%），其次為乳球菌屬（4.15%）和芽孢桿菌屬（3.27%）。由圖3可看出，隨養(yǎng)殖周期的推移，乳球菌屬所占比例逐漸下降，芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和分支桿菌屬則呈先增后減的變化趨勢。

從屬水平上的物種表達譜熱圖（圖4）可看出，養(yǎng)殖羅非魚腸道微生物主要聚為兩大分支，多數(shù)C1期和C3期聚為一支，多數(shù)C2期聚為一支，說明不同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物組成差異明顯。從圖4還可看出，鏈球菌屬（Streptococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、擬桿菌屬（Bacteroides）、棲水菌屬（Enhydrobacter）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）、乳球菌屬、詹森菌屬（Janthinobacteriu）、環(huán)絲菌屬、嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬（Flavobacterium）、葡糖醋桿菌屬（Gluconobacter）、耶爾森菌屬（Yersi-nia）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、沙雷氏菌屬（Srratia）等細菌在C2期中的豐度明顯高于C1期和C3期，其中多個屬為條件致病菌，說明C2期致病微生物的含量較高。

2. 3 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物的菌群豐度差異分析結(jié)果

通過LEfSe分析組間菌群差異，可找出各組間特異的主要菌群。從圖5可看出，海南三江養(yǎng)殖羅非魚腸道在C1期的標志（與其他兩個階段豐度差異顯著）微生物為暖繩菌目的暖繩菌科，C2期的標志微生物主要有鏈球菌科、明串珠菌科、腸球菌科、肉桿菌科、氣球菌科、鞘脂桿菌科和擬桿菌科，C3期的標志微生物是芽孢桿菌科和巴斯德氏菌科。海南屯昌養(yǎng)殖羅非魚腸道在C1期的標志微生物為肉桿菌科和棲水菌屬，C2期的標志微生物主要有芽孢桿菌科、動性球菌科和巴斯德氏菌科，C3期的標志微生物主要為節(jié)桿菌屬和微球菌科。海南文昌養(yǎng)殖羅非魚腸道在C1期的標志微生物為棲水菌屬，C2期的標志微生物主要為芽孢桿菌科和Pseudologum，C3期的標志微生物主要是伯克氏菌屬和普氏菌屬?？梢?，不同地區(qū)相同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物豐度差異標記類群存在一定差異，可能與魚種來源、養(yǎng)殖環(huán)境及飼料有關(guān)，但也存在相似之處，如養(yǎng)殖前期以棲水菌屬最具代表性，中期主要以芽孢桿菌科豐度最高。

3 討論

目前，有關(guān)羅非魚腸道微生物的研究多集中在不同營養(yǎng)元素、藥物或益生菌等添加對其多樣性的影響（徐勇等，2007；劉小玲等，2013），而針對不同環(huán)境或不同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物多樣性研究較少。羅非魚養(yǎng)殖過程中存在的最突出問題是病害頻繁發(fā)生后導(dǎo)致抗生素濫用，因此如何運用生態(tài)、健康的方式進行病害防治已成為當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖的研究熱點，其中益生菌在防治羅非魚病害方面表現(xiàn)出成本低、無藥物殘留及生態(tài)友好等明顯優(yōu)勢（趙光軍，2014；劉海天等，2016）。本研究全面系統(tǒng)分析了不同養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)各養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物的變化情況，發(fā)現(xiàn)羅非魚腸道微生物的物種豐度排序為養(yǎng)殖中期>養(yǎng)殖后期>養(yǎng)殖前期，其中α多樣性分析結(jié)果顯示，厚壁菌門和藍菌門占據(jù)優(yōu)勢地位，與淡水魚類腸道菌群的研究結(jié)果（Wu et al.，2010，2012）基本一致，說明厚壁菌門和藍菌門是魚類腸道的固有細菌門類，但其在不同魚類腸道中所發(fā)揮的作用有待進一步證實。

魚類腸道微生物的數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境、餌料和發(fā)育等因素密切相關(guān)，具體表現(xiàn)為養(yǎng)殖水體中的微生物、鹽度、水溫，魚類攝食的餌料、藥物及其生理狀態(tài)和發(fā)育階段對魚類消化道菌群結(jié)構(gòu)均有影響（陳孝煊等，2005）。本研究結(jié)果也顯示，不同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物組成差異明顯，且不同地區(qū)相同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物豐度差異標記類群也存在一定差異，可能與魚種來源、養(yǎng)殖環(huán)境及飼料有關(guān)，但也存在相似之處，如養(yǎng)殖前期以棲水菌屬最具代表性，中期主要以芽孢桿菌科豐度最高。該結(jié)論可為羅非魚腸道益生菌的篩選提供科學(xué)依據(jù)，并指導(dǎo)羅非魚養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中微生物制劑的科學(xué)使用，減少藥殘對生態(tài)環(huán)境的污染，進而改善羅非魚的生長性能及其品質(zhì)等?？梢?，羅非魚腸道微生物資源豐富，具有極大的開發(fā)前景。

在研究方法上，汪立平等（2009）曾以不同方法提取羅非魚幼魚腸道微生物基因組DNA，再通過DGGE指紋圖譜初步分析微生物多樣性，但DGGE技術(shù)在靈敏度方面不及高通量測序技術(shù)，只能檢測出含量在0.50%以上的菌種，且對實驗者的操作熟練度要求較高。本研究基于細菌16S rDNA高通量測序技術(shù)對海南省不同養(yǎng)殖地區(qū)整個養(yǎng)殖周期的羅非魚腸道微生物多樣性進行分析，并證實采用高通量測序技術(shù)能檢測到含量在0.03%以下的菌種，其靈敏度遠高于DGGE技術(shù)，故建議今后開展微生物多樣性分析時應(yīng)首選高通量測序技術(shù)。

4 結(jié)論

不同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物組成差異明顯，且不同地區(qū)相同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物豐度差異標記類群也存在一定差異，可能與魚種來源、養(yǎng)殖環(huán)境及飼料有關(guān)。因此，生產(chǎn)中應(yīng)結(jié)合實際情況，科學(xué)利用益生菌對羅非魚腸道和養(yǎng)殖環(huán)境中微生態(tài)結(jié)構(gòu)進行定向改良，切忌盲目使用益生菌。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）