細(xì)胞型朊蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

杜耀，陳海峰，李衛(wèi)平，孔智淵，朱露露，王益

1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科，江西 南昌 330006；2蘇州大學(xué)附屬太倉(cāng)醫(yī)院(太倉(cāng)市第一人民醫(yī)院)消化內(nèi)科，江蘇太倉(cāng) 215400；3蘇州大學(xué)附屬太倉(cāng)醫(yī)院(太倉(cāng)市第一人民醫(yī)院)胃腸外科，江蘇 太倉(cāng) 215400；4蘇州大學(xué)附屬太倉(cāng)醫(yī)院(太倉(cāng)市第一人民醫(yī)院)病理科，江蘇 太倉(cāng) 215400

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，也是癌癥新發(fā)第三大病因、死亡第二大病因[1]，目前多數(shù)患者確診時(shí)已屬中晚期，該病早期診斷的缺失給外科行根治性手術(shù)帶來(lái)了極大的困難；盡管中晚期患者術(shù)后可輔以放化療，但總體療效不理想[2]，5年生存率僅約40%[3]。因此，尋找一種敏感度和特異度均較高的腫瘤標(biāo)志物對(duì)CRC的早期診斷和預(yù)后判斷具有重要的臨床價(jià)值。朊蛋白(prion protein，PrP)是引起瘋牛病的致病體，包括細(xì)胞型(cellular prion protein，PrPC)和致病型(scrapie associated prion protein，PrPSc)兩種空間構(gòu)象。有研究發(fā)現(xiàn)，PrPC在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，且在腫瘤的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色，與腫瘤的多種惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PrPC在胃腸癌組織中呈高表達(dá)，且其陽(yáng)性表達(dá)與直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及分化程度密切相關(guān)[5]。本研究探討了PrPC在CRC組織中的表達(dá)情況，并分析其與CRC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2016年1月－2017年1月蘇州大學(xué)附屬太倉(cāng)醫(yī)院(太倉(cāng)市第一人民醫(yī)院)胃腸外科經(jīng)手術(shù)切除的CRC標(biāo)本50例及癌旁正常組織標(biāo)本(距腫瘤組織2 cm以上) 30例。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料完整；術(shù)前未行放化療；術(shù)后經(jīng)病理檢查確診并進(jìn)行門(mén)診或電話隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前或術(shù)中發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；行姑息性手術(shù)切除；合并其他部位惡性腫瘤。本研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬太倉(cāng)醫(yī)院(太倉(cāng)市第一人民醫(yī)院)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：KY-2020-15)。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人PrPC多克隆抗體(ab6664)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；DAB顯色試劑盒(K5007)、EnVision抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自丹麥Dako公司。半自動(dòng)脫水機(jī)(TP1020)、全自動(dòng)石蠟包埋機(jī)(EG1150)、全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(RM2235)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；尼康顯微攝影圖像處理軟件(H500S電子顯微鏡)購(gòu)自日本Nikon公司。

1.3 免疫組化SP法檢測(cè)PrPC的表達(dá) 所有標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、切片(厚度4 μm)后，行免疫組化染色，按照免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。以已知陽(yáng)性CRC組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判定：顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核呈棕色或黃色判定為陽(yáng)性著色。隨機(jī)選取10個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，并根據(jù)每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例和染色程度進(jìn)行評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例＜10%記0分，10%～25%記1分，25%～50%記2分，50%～75%記3分，≥75%記4分。將CRC組織與陰性對(duì)照進(jìn)行著色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色為陰性(0分)，細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核呈淡棕色為弱陽(yáng)性(1分)，棕色為陽(yáng)性(2分)，深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性(3分)。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例與染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積將組織染色結(jié)果進(jìn)行分級(jí)：0～1為陰性(–)，2～4為弱陽(yáng)性(+)，5～8為陽(yáng)性(++)，9～12為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。陽(yáng)性率(%)=(陽(yáng)性例數(shù)+強(qiáng)陽(yáng)性例數(shù))/總例數(shù)×100%。所有免疫組化染色結(jié)果均由兩位病理醫(yī)師在不知任何臨床和病理資料的情況下以上述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估，如意見(jiàn)不一致則由第三位病理醫(yī)師進(jìn)行判定。

1.4 根據(jù)該判定標(biāo)準(zhǔn)，PrPC陽(yáng)性表達(dá)共34例(包括陽(yáng)性26例，強(qiáng)陽(yáng)性8例)，設(shè)為PrPC陽(yáng)性表達(dá)組；PrPC陰性表達(dá)共16例(包括弱陽(yáng)性11例，陰性5例)，設(shè)為PrPC陰性表達(dá)組。PrPC表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系 采用Spearman檢驗(yàn)分析CRC組織中PrPC陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性。隨訪截至2021年1月，應(yīng)用Kaplan-Meier法分析PrPC表達(dá)與CRC患者預(yù)后的關(guān)系，應(yīng)用多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析CRC預(yù)后的影響因素。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)比較CRC組織與癌旁正常組織PrPC陽(yáng)性表達(dá)率的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CRC組織中PrPC的表達(dá)情況 PrPC在CRC組織及癌旁正常組織中存在不同程度的陽(yáng)性表達(dá)，PrPC陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞核(圖1A)。PrPC在癌旁正常組織中陽(yáng)性表達(dá)率為20.0%(6/30)，在CRC組織中為68.0%(34/50)[結(jié)腸癌組織：67.9%(19/28)，直腸癌組織：68.2%(15/22)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.28，P＜0.01，圖1B)。

圖1 PrPC在CRC組織中的表達(dá)情況(SP ×200)Fig.1 Expression of PrPC in colorectal cancer tissues (SP ×200)

2.2 CRC組織中PrPC陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析顯示，CRC組織中PrPC陽(yáng)性表達(dá)與TNM分期、腫瘤浸潤(rùn)深度、腫瘤分化程度、脈管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P＜0.05)，與年齡、性別、腫瘤位置及腫瘤最大徑無(wú)相關(guān)性(P>0.05，表1)。2.3 PrPC表達(dá)與CRC預(yù)后的關(guān)系 隨訪截至2021年1月，除1例失訪外，余49例獲得完整隨訪，隨訪時(shí)間為6～68個(gè)月，隨訪期間32例死亡，中位隨訪時(shí)間為48個(gè)月。Kaplan-Meier法分析顯示，PrPC陰性表達(dá)組患者的生存時(shí)間為(62.0±7.0)個(gè)月，5年總體生存率為50.3%；PrPC陽(yáng)性表達(dá)組患者的生存時(shí)間為(45.0±4.1)個(gè)月，5年總體生存率為7.0%。兩組生存情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015，圖2)。

表1 CRC組織中PrPC陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]Tab.1 Relationship between positive PrPC expression and clinicopathological features in colorectal cancer tissues [n(%)]

(續(xù) 表)

圖2 PrPC陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)CRC患者Kaplan-Meier生存曲線Fig.2 Kaplan-Meier survival curves for CRC patients with positive and negative expression of PrPC

2.4 CRC的預(yù)后影響因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，TNM分期、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及PrPC陽(yáng)性表達(dá)與CRC的預(yù)后有關(guān)(P＜0.05)，年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤最大徑、腫瘤浸潤(rùn)深度及腫瘤分化程度與CRC的預(yù)后無(wú)關(guān)(P>0.05，表2)。

將單因素分析中P＜0.1的變量[TNM分期(Ⅰ－Ⅱ期賦值為0，Ⅲ－Ⅳ期賦值為1)、腫瘤浸潤(rùn)深度(T1－T2期賦值為0，T3－T4期賦值為1)、腫瘤分化程度(中/高分化賦值為0，低分化賦值為1)、脈管侵犯(有脈管侵犯賦值為0，無(wú)脈管侵犯賦值為1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移賦值為0，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移賦值為1)及PrPC表達(dá)(陽(yáng)性表達(dá)賦值為0，陰性表達(dá)賦值為1)]納入Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，TNM分期和PrPC陽(yáng)性表達(dá)是CRC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P＜0.05，表2)。

表2 CRC預(yù)后影響因素的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis of the prognosis in colorectal cancer

3 討 論

Pr P C 是一種含有2 5 3 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，由PRNP基因編碼，其N端含有5個(gè)八肽重復(fù)區(qū)，可結(jié)合Cu2+、Zn2+和Mn2+等金屬離子[6]。PrPC也是一種正常細(xì)胞廣泛表達(dá)的糖基化磷脂酰肌醇(glycophosphatidylinositol，GPI)錨定糖蛋白，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)高度保守，在神經(jīng)系統(tǒng)中分布最為廣泛，其次為胃腸道。既往研究發(fā)現(xiàn)，PrPC參與口腔癌[7]、CRC[8]、胃癌[9]、肺癌[10]及乳腺癌[11]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且其表達(dá)與多種腫瘤細(xì)胞的耐藥、增殖、凋亡、遷移及侵襲等過(guò)程有關(guān)[12]。王敏等[7]研究發(fā)現(xiàn)，PrPC低表達(dá)可抑制口腔癌細(xì)胞的增殖、黏附、遷移及侵襲；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PrPC低表達(dá)可抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。Gil等[13]對(duì)乳腺癌細(xì)胞中的PrPC進(jìn)行過(guò)表達(dá)及沉默，發(fā)現(xiàn)PrPC可通過(guò)激活ERK和NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移，且與乳腺癌的進(jìn)展及預(yù)后不良相關(guān)。本團(tuán)隊(duì)前期針對(duì)胃腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PrPC的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響，但可增加細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性[14]；抑制PrPC的表達(dá)可促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞(SGC7901)和結(jié)腸癌細(xì)胞(HT29)凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)促凋亡蛋白Bax和caspase-3以及下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)有關(guān)[15]。王偉建等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PrPC表達(dá)下調(diào)后，CRC細(xì)胞(Lovo和SW480)的增殖和侵襲能力均明顯降低，表明PrPC表達(dá)與細(xì)胞增殖及侵襲密切相關(guān)，PrPC高表達(dá)可促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖及侵襲。既往有研究發(fā)現(xiàn)，PrPC介導(dǎo)的胃癌耐藥與PI3K/Akt途徑激活密切相關(guān)，抑制PI3K/Akt途徑的活性可逆轉(zhuǎn)PrPC介導(dǎo)的胃癌耐藥[17]。Du等[18]發(fā)現(xiàn)，PrPC參與了CRC干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其具體機(jī)制與PrPC通過(guò)ERK2信號(hào)通路介導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，使用多柔比星處理結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞后，PrPC高表達(dá)可上調(diào)細(xì)胞中凋亡抑制蛋白XIAP的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，表明PrPC可通過(guò)抵抗多柔比星誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而促進(jìn)結(jié)腸癌的進(jìn)展[19]。上述研究提示，PrPC可能對(duì)癌癥的發(fā)生、進(jìn)展及細(xì)胞耐藥有重要影響。

既往研究證實(shí)，PrPC在胃癌、胰腺癌及乳腺癌等組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)[20-22]，且其表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織[23]。本研究結(jié)果顯示，PrPC在CRC組織及癌旁正常組織中均存在不同程度的陽(yáng)性表達(dá)，且其在CRC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，提示PrPC陽(yáng)性表達(dá)可能與CRC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步探討CRC組織中PrPC陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，PrPC陽(yáng)性表達(dá)與TNM分期、腫瘤浸潤(rùn)深度、腫瘤分化程度、脈管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其中CRC分期晚、腫瘤浸潤(rùn)深度深、中/高分化、有脈管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者PrPC陽(yáng)性表達(dá)率較高，表明隨著CRC的進(jìn)展PrPC表達(dá)逐漸增高，與孫楊安等[23]、梁聰?shù)萚24]及鄭彥濤等[25]的研究結(jié)果一致。同時(shí)PrPC與胃癌[26]、胰腺癌[27]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[28]及喉癌[29]的相關(guān)研究也得出了類似結(jié)論。最近王可楹等[30]發(fā)現(xiàn)，PrPC的表達(dá)與口腔癌分化程度及年齡相關(guān)，而與性別、腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，與上述研究結(jié)果存在較大差異。分析原因可能與納入研究的腫瘤部位和類型不同有關(guān)。因此，臨床有望通過(guò)測(cè)定PrPC的表達(dá)水平來(lái)判斷和評(píng)估CRC的侵襲程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。Zhou等[31]對(duì)238例胃癌患者進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)PrPC高表達(dá)與胃癌預(yù)后不良相關(guān)；Du等[18]也發(fā)現(xiàn)，PrPC表達(dá)水平與CRC患者的生存率呈負(fù)相關(guān)；而Tang等[32]對(duì)480例胃癌患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中PrPC的表達(dá)明顯下調(diào)，且PrPC表達(dá)下調(diào)與胃癌患者生存率低相關(guān)，這一結(jié)果與上述研究相反，分析原因可能是由于使用不同的標(biāo)本資源和抗體有關(guān)。此外，目前絕大多數(shù)研究是基于免疫組化分析的結(jié)果，該方法本身可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且免疫組化存在一定的人為主觀性。當(dāng)前針對(duì)PrPC表達(dá)與CRC預(yù)后關(guān)系的研究國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)。本研究對(duì)50例CRC患者進(jìn)行隨訪，除1例失訪外，余49例獲得完整隨訪，統(tǒng)計(jì)分析顯示，PrPC陰性表達(dá)患者的生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于PrPC陽(yáng)性表達(dá)患者，與Zhou等[31]和Du等[18]的研究結(jié)果相似。進(jìn)一步應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，TNM分期及PrPC陽(yáng)性表達(dá)是CRC預(yù)后的獨(dú)立影響因素，提示PrPC有望成為評(píng)估腫瘤TNM分期、分化程度及有無(wú)脈管侵犯的一種新的生物學(xué)指標(biāo)，可幫助臨床醫(yī)師預(yù)測(cè)CRC的預(yù)后。鑒于PrPC在CRC組織和癌旁正常組織中的差異表達(dá)，后續(xù)可進(jìn)一步針對(duì)此分子開(kāi)發(fā)靶向藥物。目前已有靶向PrPC治療阿爾茲海默癥的相關(guān)研究[33]，但與PrPC相關(guān)的腫瘤靶向治療研究少見(jiàn)，這為后續(xù)研究提供了新的方向。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，PrPC表達(dá)水平與CRC患者的預(yù)后密切相關(guān)，但其具體作用機(jī)制尚不清楚，未來(lái)仍需深入研究。PrPC陽(yáng)性表達(dá)是影響CRC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但鑒于當(dāng)前的研究結(jié)果存在較大差異，加之本研究樣本量較小且為單中心研究，該結(jié)果仍需后續(xù)多中心大樣本臨床研究加以驗(yàn)證。