外泌體攜載MMPs在椎間盤退變中的作用研究進(jìn)展

藺茂強(qiáng)，胡一村，張曉勃，安海英，郭濤文，高熙丹，張芮浩，陳祥義，于得臣，周海宇*

1蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅 蘭州 730030；2甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3西安紅會(huì)醫(yī)院骨科，陜西 西安 710000；4武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430000

下腰痛(low back pain，LBP)是目前全球致殘率最高的慢性疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)約有5.4億人正被腰痛疾病所困擾[1]。許多因素可造成LBP，其中椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)被認(rèn)為是最主要的原因之一[2-4]。目前針對(duì)IVDD的治療包括非手術(shù)治療和手術(shù)干預(yù)，但均無法阻止疾病進(jìn)展及恢復(fù)椎間盤重建[5]，而基于外泌體的生物療法在椎間盤再生方面具有良好的應(yīng)用前景。近期研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)含量和組成的改變與IVDD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。值得注意的是，ECM成分中的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在不同退變程度椎間盤ECM中的表達(dá)存在明顯差異[7]。雖然造成上述差異的具體機(jī)制尚未闡明，但隨著IVDD程度的加重，一系列MMPs的表達(dá)及活性增加，直接或間接參與了IVDD進(jìn)程[8-9]。外泌體作為細(xì)胞間通訊和物質(zhì)交換的小分子囊泡，通過在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與ECM之間輸送MMPs參與了IVDD的發(fā)生發(fā)展過程[10]。

近年來，外泌體因具有親代細(xì)胞生物學(xué)特性、低免疫原性和易存貯等優(yōu)點(diǎn)[11]，在IVDD研究中取得了豐碩的成果，從而有望從生物分子水平治療IVDD。越來越多的證據(jù)表明，外泌體在細(xì)胞間通過傳遞MMPs等物質(zhì)影響或改變椎間盤的ECM代謝，從而影響正常椎間盤細(xì)胞的生物學(xué)功能，進(jìn)而參與機(jī)體的生理和病理過程[12]。本文總結(jié)目前已證實(shí)的外泌體攜載的MMPs在IVDD中的作用，旨在為外泌體及MMPs應(yīng)用于IVDD的基礎(chǔ)及臨床研究提供理論基礎(chǔ)。

1 IVDD的病理機(jī)制

IVDD是多種機(jī)制共同參與導(dǎo)致的脊柱外科疾病，其具體病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)，IVDD的發(fā)生與椎間盤細(xì)胞丟失、ECM成分改變密切相關(guān)[13-14]；而且在IVDD的發(fā)生過程中，有多種環(huán)境因素(如年齡增長、異常應(yīng)力增加等)及遺傳因素等共同參與[15]。椎間盤是人體內(nèi)完全封閉的無血管組織，由軟骨終板、外圍的纖維環(huán)和中央的髓核組成，缺少血液供應(yīng)[16-17]，因此，ECM是椎間盤細(xì)胞賴以生存的細(xì)胞外微環(huán)境。

研究發(fā)現(xiàn)，ECM主要由蛋白多糖、水、膠原、少量彈性蛋白等成分組成，髓核細(xì)胞在這種微環(huán)境下可產(chǎn)生一種高度水合的基質(zhì)，當(dāng)脊柱承受壓力時(shí)髓核細(xì)胞發(fā)揮作用使椎間盤各部分受力均勻，以避免異常外力造成椎間盤結(jié)構(gòu)的改變[18-19]。最新研究證實(shí)，MMPs作為一類蛋白水解酶，可通過降解椎間盤的ECM成分而加速IVDD進(jìn)展[9]，而外泌體在此過程中發(fā)揮一定的橋梁作用[20]。由此可見，以外泌體和MMPs作為分子治療靶標(biāo)，調(diào)節(jié)其表達(dá)水平，有望延緩ECM成分改變導(dǎo)致的IVDD進(jìn)展。

2 外泌體參與椎間盤退變及修復(fù)

2.1 外泌體及其作用 外泌體最初是由Pan于1983年在綿羊的網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，直徑為30～100 nm，在電子顯微鏡下表現(xiàn)為“杯狀”或“碟狀”，具有與細(xì)胞膜相似的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，這種雙層膜殼結(jié)構(gòu)可防止其內(nèi)容物在細(xì)胞間傳遞過程中被酶降解[21-22]。外泌體是由多囊泡小體途徑衍生而來的胞外小囊泡，產(chǎn)生于多囊泡內(nèi)涵體(multivesicular endosomes，MVEs)或多囊泡體(multivesicular bodies，MVBs)，并在這些小室與質(zhì)膜融合時(shí)分泌出來[23]。外泌體到達(dá)受體細(xì)胞并與受體細(xì)胞膜融合后，將所攜載的生物活性物質(zhì)釋放到受體細(xì)胞或ECM中，從而發(fā)揮細(xì)胞間信號(hào)傳遞和物質(zhì)交換的作用[24]。外泌體的信使作用是其攜載相關(guān)生物活性分子在IVDD中發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，其有可能成為IVDD生物分子水平治療的新靶點(diǎn)[5]。

2.2 外泌體參與椎間盤退變及修復(fù)的潛在機(jī)制外泌體具有雙層膜殼結(jié)構(gòu)，可維持其攜載的內(nèi)容物在長距離運(yùn)輸及與受體細(xì)胞相互作用過程中的穩(wěn)定性，且與干細(xì)胞相比，更易在退變的椎間盤所產(chǎn)生的低細(xì)胞結(jié)構(gòu)、低葡萄糖、高滲透壓、低pH值和低氧的惡劣環(huán)境中生存[25]，這些特性使其成為IVDD干細(xì)胞移植治療的潛在替代方案。

IVDD發(fā)生的主要原因是中央的髓核細(xì)胞凋亡增加、過度的氧化壓力、炎性因子的大量入侵，以及髓核中的ECM代謝紊亂等，其中ECM代謝紊亂被認(rèn)為是引起IVDD最主要的機(jī)制[26]。研究證實(shí)，外泌體可通過miRNA等調(diào)控因子促進(jìn)髓核中ECM的合成而延緩IVDD[27]，且可借助于攜載的生物活性物質(zhì)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[28]，抑制髓核細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖和再生，修復(fù)組織損傷，參與椎間盤的退變及修復(fù)過程[25,29]。

外泌體作為含有親代細(xì)胞成分的納米囊泡[30]，在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮著重要的介質(zhì)作用，其功能與親代細(xì)胞和攜載的內(nèi)容物密切相關(guān)[25,31]。Sun等[32]觀察纖維環(huán)細(xì)胞衍生的外泌體(annulus fibrosus cell derived exosome，AF-exo)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)產(chǎn)生的效應(yīng)，探討外泌體在IVDD血管化調(diào)節(jié)中的作用，結(jié)果顯示，退化的AF-exo可上調(diào)TNF-α、IL-6等炎性因子的表達(dá)，增強(qiáng)HUVECs的遷移能力，促進(jìn)HUVECs的血管化，對(duì)椎間盤產(chǎn)生不利影響；而非退化的AF-exo表現(xiàn)出相反的效應(yīng)，可維持椎間盤的無血管化，對(duì)椎間盤起著保護(hù)作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，人尿源性干細(xì)胞衍生的外泌體可通過轉(zhuǎn)移母體蛋白-3(matrilin-3，MATN3)促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖和ECM的合成，延緩IVDD[33]。Lu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體可增強(qiáng)髓核細(xì)胞中ECM的合成，實(shí)現(xiàn)退化椎間盤的自我修復(fù)。由此可見，外泌體在IVDD中的作用與其來源密切相關(guān)，不同來源的外泌體對(duì)椎間盤的作用不同，既可通過促血管化作用對(duì)椎間盤產(chǎn)生不利影響，也可通過促進(jìn)ECM的合成和髓核細(xì)胞的增殖以及抑制髓核細(xì)胞的凋亡等對(duì)椎間盤起到保護(hù)作用。

3 外泌體攜載MMPs參與IVDD

3.1 MMPs MMPs屬于鋅依賴性蛋白水解酶家族，是降解ECM中各種蛋白組分(包括糖蛋白、蛋白多糖尤其是膠原)的關(guān)鍵物質(zhì)。在機(jī)體正常的生理狀態(tài)下，這些酶的活性受自身激活機(jī)制和內(nèi)源性金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)的調(diào)節(jié)。然而在病理狀態(tài)下，MMPs與TIMPs之間的平衡被打破，MMPs被多種因子(如血管內(nèi)皮生長因子)激活，從而降解ECM，加速IVDD的進(jìn)程[34-35]。盡管目前MMPs參與IVDD的具體機(jī)制仍不清楚，但最近研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在這一過程中發(fā)揮了轉(zhuǎn)運(yùn)作用[20]。

3.2 外泌體攜載的MMPs 外泌體可攜載相應(yīng)的生物活性物質(zhì)(包括蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì))對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生一系列的影響，如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附和遷移、細(xì)胞增殖和基因表達(dá)等[30,36-38]。研究證實(shí)，MMPs作為一類蛋白水解酶可被外泌體攜載，通過外泌體的傳遞在特定的受體細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)作用[39]，如表1[38,40-48]所示。例如，Olejarz等[40]發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體中富含MMPs，尤其是MMP-2、MMP-9、MMP-13，其通過外泌體的運(yùn)輸?shù)竭_(dá)腫瘤微環(huán)境，參與腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。Xu等[38]在胃癌患者血漿純化的外泌體中發(fā)現(xiàn)了MMP-11，并證實(shí)其可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移。此外，MMP-1[41]、MMP-3[42]、MMP-13[43]、MMP-14[41,44]、MMP-19[41]也被證實(shí)存在于不同來源的外泌體中。由此可見，MMPs存在于外泌體中，雖然目前其發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍不清楚，但對(duì)其作用機(jī)制的研究可能是深入了解外泌體治療IVDD的新途徑。

表1 外泌體攜載的MMPs及其生理效應(yīng)Tab.1 MMPs carried by exosomes and their physiological effects

3.3 外泌體攜載MMPs調(diào)節(jié)ECM代謝 目前，對(duì)于外泌體攜載MMPs的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域，與IVDD相關(guān)的研究鮮少報(bào)道。MMPs作為一類蛋白酶，主要通過調(diào)節(jié)ECM的代謝參與IVDD。在正常健康椎間盤中，MMPs的分解代謝作用與組織的合成代謝活動(dòng)處于一種平衡狀態(tài)；而在病理狀態(tài)下，MMPs的活性和表達(dá)出現(xiàn)失衡，分解代謝增強(qiáng)，從而導(dǎo)致ECM成分發(fā)生改變，最終加速椎間盤的病理改變[49]。下文總結(jié)了近年來外泌體攜載的參與IVDD的MMPs。

3.3.1 MMP-1、MMP-3 MMP-1、MMP-3均可在退變的椎間盤中表達(dá)，且其表達(dá)水平與椎間盤的退變程度存在明顯正相關(guān)關(guān)系[50]。Pohl等[45]將內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體與纖維環(huán)細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，MMP-1、MMP-3的表達(dá)明顯上調(diào)，并通過Western blotting檢測(cè)證實(shí)，過量表達(dá)的MMP-1、MMP-3一部分來自內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體，另一部分來自纖維環(huán)細(xì)胞，而MMP-1、MMP-3過量表達(dá)導(dǎo)致纖維環(huán)細(xì)胞的基質(zhì)分解代謝增強(qiáng)，破壞了椎間盤的基質(zhì)穩(wěn)態(tài)。此外，來自內(nèi)皮細(xì)胞的外泌體可抑制纖維環(huán)細(xì)胞中蛋白聚糖基因的表達(dá)，促進(jìn)新生血管的形成，加速椎間盤血管化。

Dean等[46]通過RT-PCR、酪蛋白酶譜分析和Western blotting檢測(cè)證實(shí)，MMP-3存在于軟骨細(xì)胞分泌的外泌體中，且其活性受維生素代謝物的調(diào)節(jié)?；谏鲜鲅芯浚珺oyan等[51]發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2D3直接作用于外泌體表面的膜受體蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3，激活磷脂酶A2，產(chǎn)生溶血磷脂破壞外泌體膜的穩(wěn)定性，釋放活性MMP-3，而后者可特異性水解軟骨細(xì)胞的ECM成分。由此可見，臨床上可通過制備靶向藥物等手段降低MMP-1、MMP-3的表達(dá)，抑制椎間盤的ECM降解，進(jìn)而延緩IVDD的進(jìn)展。

3.3.2 MMP-2、MMP-9、MMP-14 MMP-2、MMP-9是MMPs家族的重要成員，對(duì)椎間盤的穩(wěn)態(tài)極為重要，均被稱為明膠酶，主要靶向ECM中的變性膠原蛋白[52]。有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平與椎間盤退變程度呈正相關(guān)[53]。Taraboletti等[47]通過明膠酶譜分析、Western blotting和免疫金電鏡實(shí)驗(yàn)分析證實(shí)，MMP-2、MMP-9存在于HUVECs產(chǎn)生的外泌體中，并證實(shí)外泌體攜載的MMP-2、MMP-9可增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，加速內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成，而內(nèi)皮細(xì)胞的這些改變可促進(jìn)椎間盤血管化，加速IVDD進(jìn)程[32]。此外，為了進(jìn)一步了解MMP-9是否存在于外泌體內(nèi)部，Silva等[48]利用成像流式細(xì)胞術(shù)和明膠酶譜分析在樹突狀細(xì)胞分泌的外泌體內(nèi)部發(fā)現(xiàn)了具有活性形式的MMP-9，并證實(shí)其不僅通過重塑和降解ECM成分促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，還可通過切割骨橋蛋白形成活性片段促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。

Hakulinen等[44]利用免疫電鏡檢測(cè)到MMP-14在外泌體表面過量表達(dá)，而MMP-14可降解ECM中的膠原(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型)、纖維連接蛋白、玻璃體連接蛋白和層黏連蛋白等，還能發(fā)揮脫落酶的作用，如裂解syndecan-1、細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1(intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、CD44并將他們從細(xì)胞表面釋放出來，從而改變椎間盤細(xì)胞的正常生物學(xué)活性[54]。由此可見，外泌體攜載的MMP-2、MMP-9、MMP-14可通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和ECM的分解代謝，加速IVDD的進(jìn)展。因此，MMP-2、MMP-9、MMP-14可作為生物學(xué)指標(biāo)預(yù)測(cè)IVDD的嚴(yán)重程度，且可通過降低其表達(dá)為IVDD的臨床治療和預(yù)防提供新方案。

除了上述5種MMPs可通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)形式參與IVDD過程外，MMP-8[55]、MMP-10[56]和MMP-12[57]已被證實(shí)直接或間接參與IVDD的發(fā)生發(fā)展，但其發(fā)揮作用是否通過外泌體的轉(zhuǎn)運(yùn)有待進(jìn)一步證實(shí)。隨著對(duì)MMPs和外泌體研究的不斷深入，其在IVDD過程中的作用機(jī)制將逐漸被闡明，這為從生物分子水平治療和預(yù)防IVDD提供了新思路。

4 外泌體攜載的MMPs在IVDD中的應(yīng)用局限性

盡管外泌體攜載MMPs在IVDD中的研究不斷獲得認(rèn)可，但目前尚存在以下問題亟需解決。首先，MMPs在IVDD過程中的作用機(jī)制尚不清楚。其次，由于目前提取外泌體技術(shù)的局限，很難以低成本高效獲得高純度外泌體，僅局限于高級(jí)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)室，并且外泌體的含量與細(xì)胞類型和狀態(tài)有關(guān)。由于外泌體是一個(gè)包含有生物活性物質(zhì)的胞外囊泡，其內(nèi)包含的各種小分子物質(zhì)對(duì)于疾病發(fā)生發(fā)展的作用各不相同，有益和有害的遺傳物質(zhì)并存，目前的技術(shù)尚不足以提取完整有效的功效性分子。最后，雖然外泌體攜載的MMPs已逐步應(yīng)用于腫瘤的檢測(cè)和預(yù)防等方面，但在椎間盤領(lǐng)域的研究主要集中于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，尚缺乏一定的理論基礎(chǔ)，并且其臨床應(yīng)用操作仍缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。因此，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)外泌體攜載的MMPs在IVDD中的作用機(jī)制研究，對(duì)于從分子水平治療IVDD具有重要的意義。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，外泌體作為由親代細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡，主要通過其攜載的內(nèi)容物影響受體細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)。外泌體可通過轉(zhuǎn)移MATN3促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖和ECM的合成，延緩IVDD，也可通過攜載MMPs加速ECM成分的降解、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及椎間盤的血管化，進(jìn)而加速IVDD，但目前外泌體延緩或加速IVDD的具體作用機(jī)制仍未闡明。此外，與IVDD的傳統(tǒng)治療相比，基于外泌體的分子治療具有阻止疾病進(jìn)展、重建椎間盤的優(yōu)勢(shì)和潛力，但目前研究仍處于起步階段，距離應(yīng)用于IVDD的臨床治療仍存在諸多挑戰(zhàn)。進(jìn)一步深化外泌體參與IVDD作用機(jī)制的研究，對(duì)于外泌體在IVDD治療中的應(yīng)用及椎間盤的再生有著深遠(yuǎn)的意義。