RPDPC對宮頸癌HeLa細胞增殖與凋亡的影響及其機制

陳鳳，曾小華，張斌強，李斌，王彥嬌，陳琴華，柯麗娜*

1錦州醫(yī)科大學(xué)國藥東風(fēng)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，湖北 十堰 442008；2湖北醫(yī)藥學(xué)院國藥東風(fēng)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 十堰 442008；3武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點實驗室(湖北醫(yī)藥學(xué)院)，湖北 十堰 442008

宮頸癌為婦科常見癌癥，是女性癌癥死亡的第四位疾病[1]。全球?qū)m頸癌新發(fā)病例數(shù)已從2012年的52.8萬例增加到2020年的59.8萬例，死亡數(shù)從2012年的26.6萬例增加到2020年的33.8萬例，且發(fā)展中國家發(fā)病率是發(fā)達國家的3～10倍[2]。手術(shù)及化療是宮頸癌目前主要的治療手段，化療首選以順鉑為主的鉑類藥物；然而，已有的化療藥物只能使晚期宮頸癌患者的5年生存率略有提高，治療效果和預(yù)后很不理想[3-4]。因此，迫切需要探尋抗宮頸癌安全有效且不易產(chǎn)生耐藥性的藥物[5]。Hiroyasu研究團隊從沖繩被囊類動物Rhopalaea sp.的提取物中分離出4種包含咪唑啉酮結(jié)構(gòu)的雙(吲哚)生物堿即Rhopaladins A－D，對人類腫瘤細胞株有顯著的細胞毒作用[6]。我們前期合成了海洋生物堿Rhopaladins的類似物RPDPC(化學(xué)名：E-N-叔丁基-1-異丙基-4-對氟芐叉基-2-對溴苯甲?；?5-吡咯烷酮-2-酰胺)，本研究旨在探討RPDPC對宮頸癌HeLa細胞增殖與凋亡的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑及儀器 宮頸癌HeLa細胞、正常肝細胞LO2購自中國武漢普諾賽公司；胎牛血清購自中國CellMax公司；MEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)購自美國Targetmol公司；Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒購自中國聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自日本TOYOBO公司；microRNA反轉(zhuǎn)錄盒、miScript SYBR Green PCR Kit購自德國QiaGen公司；PCR引物由中國上海生工生物有限公司合成；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)購自中國Antgene公司；流式細胞儀購自美國BD公司；熒光定量PCR儀購自德國耶拿公司；抗PTEN抗體、抗p-PI3K抗體、抗PI3K抗體、抗p-Akt抗體、抗Akt抗體購自美國Abcam；二抗購自美國Boster公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組 在含有10%胎牛血清的MEM細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，1～2 d換液1次，在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，待細胞長滿瓶底80%～90%時按1:3傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。RPDPC溶于二甲基亞砜(DMSO)中，配成不同濃度的母液后保存在–20 ℃冰箱中。陰性對照組加入等量的DMSO，實驗組為不同濃度RPDPC的DMSO溶液。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞存活率 將HeLa細胞以4×103個/孔的密度種在96孔板中，次日待細胞貼壁后去除原培養(yǎng)基，加入含RPDPC(3.125 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L、100.0 μmol/L)的培養(yǎng)基200 μl，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h；以DMSO為陰性對照組，順鉑(PT)為陽性對照組；以正常肝細胞進行細胞毒性實驗。每組設(shè)置3個復(fù)孔，CCK-8與MEM培養(yǎng)基按1:10的比列混合后每孔加入110 μl，放入37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中避光孵育1.5 h，在酶標(biāo)儀上測定450 nm波長處的吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=[A實驗組–A空白]/[ADMSO–A空白]×100%。

1.2.3 Hoechst 33258染色觀察HeLa細胞形態(tài) 將HeLa細胞以2×106個/孔的密度接種在6孔板中，次日細胞貼壁后加入試劑，孵育48 h后加入500 μl固定液，固定10 min，PBS沖洗2次，每次3 min。500 μl Hoechst 33258染色5 min后，用PBS清洗細胞2次，每次3 min。熒光顯微鏡下觀察各組細胞。

1.2.4 Annexin V/PI雙染法檢測HeLa細胞凋亡率將Hela細胞接種在6孔板中，密度為2×106個/孔；次日細胞貼壁后去除上清培養(yǎng)液，加入不同濃度的RPDPC培養(yǎng)液，每孔2 ml，藥物作用48 h后用不含EDTA的胰酶收集細胞懸液，1000g/min離心5 min，沉淀細胞用孵育緩沖液洗1次，用結(jié)合緩沖液重懸細胞后加入Annexin V-FITC 5 μl和PI 10 μl，采用流式細胞儀進行細胞凋亡率檢測。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測HeLa細胞癌基因E6、E7和PTEN、PI3K、Akt的mRNA及miR-21表達水平 將HeLa細胞以2×106個/孔的密度接種在6孔板中；次日細胞貼壁后去除上清培養(yǎng)液，加入不同濃度的RPDPC培養(yǎng)液，每孔2 ml，藥物作用48 h后加入TRIzol試劑裂解細胞，抽提總RNA，測定總RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書操作，反轉(zhuǎn)錄得到雙鏈cDNA。利用SYBR Green PCR Master Mix和miScript SYBR Green PCR Kit擴增并檢測mRNA。以GAPDH為內(nèi)參，利用SYBR Green PCR Master Mix測定E6、E7、PTEN、PI3K和Akt的mRNA表達水平。E6、E7的PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)。PTEN、PI3K和Akt的PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)。以U6RNA作為miR-21的內(nèi)參對照，miScript SYBR Green PCR Kit檢測miR-21的表達水平，PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。采用2–ΔΔCt法計算基因的相對表達量。所用引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

1.2.6 Western blotting檢測PTEN/PI3K/Akt信號通路蛋白表達水平 將HeLa細胞以2×106個/孔的密度接種在6孔板中；次日細胞貼壁后去除上清培養(yǎng)液，加入不同濃度的RPDPC培養(yǎng)液，每孔2 ml，藥物作用48 h后用PBS洗一次，用含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上裂解40 min，B C A法測定蛋白濃度，保存在–80 ℃冰箱。以GAPDH作為內(nèi)參，制備10%的分離膠和5%的濃縮膠進行凝膠電泳分離，蛋白樣品上樣10 μg。濃縮膠：80V 30 min；分離膠：120V 90 min。在150 mA條件下轉(zhuǎn)膜60 min；37 ℃封閉1 h，加入一抗稀釋液GAPDH(1:5000)、PTEN(1:1000)、p-PI3K(1:1000)、PI3K(1:1000)、p-Akt(1:500)、Akt(1:500)，4 ℃過夜，加入二抗稀釋液(1:5000)孵育1 h，曝光儀曝光，記錄成像結(jié)果。使用Image J軟件分析蛋白灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以±s表示，采用單因素方差分析進行組間比較，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對HeLa細胞和肝細胞存活率的影響 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對照組(DMSO)比較，RPDPC處理后HeLa細胞存活率下降，且隨時間和濃度的增加，細胞存活率持續(xù)下降，具有明顯的時間和濃度依賴性(P＜0.05，圖1A)。采用GraphPad Prism軟件計算，HeLa細胞24 h、48 h、72 h的RPDPC半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為44.1 μmol/L、28.9 μmol/L、26.1 μmol/L；Hela細胞48 h的順鉑IC50值為32.2 μmol/L(圖1B)。據(jù)此，后續(xù)實驗研究選取12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L RPDPC分別處理HeLa細胞48 h。藥物毒性實驗結(jié)果顯示，RPDPC對正常肝細胞LO2的IC50為200.0 μmol/L(圖1C)。

圖1 RPDPC對HeLa細胞和肝細胞存活率的影響(n=6)Fig.1 Effects of cell viabilities of HeLa cells and hepatocytes treated by RPDPC (n=6)

2.2 HeLa細胞的形態(tài)觀察 Hoechst 33258染色顯示，對照組細胞生長良好，細胞數(shù)多且形態(tài)呈正常的梭形(圖2A)；與對照組比較，RPDPC處理48 h后，隨RPDPC濃度的遞增(12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L)，各組細胞數(shù)持續(xù)減少，細胞間隙增寬，死亡細胞、細胞碎片增多，細胞皺縮、形態(tài)失常變化更加明顯(圖2B－D)。

圖2 RPDPC處理48 h后HeLa細胞的Hoechst 33258 染色結(jié)果(n=6, ×100)Fig.2 Morphological observation of HeLa cells treated by RPDPC in each group (n=6, ×100)

2.3 各組HeL a細胞凋亡率比較 A nnex inⅤ-FITC/PI雙染處理各組細胞并用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，對照組、RPDPC處理組(12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L)的HeLa細胞凋亡率(%)分別為13.2±1.7、21.8±4.5、33.8±3.4、46.7±6.7；與對照組比較，各組HeLa細胞凋亡率均明顯增高(P＜0.05)；不同濃度RPDPC處理組HeLa細胞凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

圖3 RPDPC處理后各組HeLa細胞凋亡率比較(n=6)Fig.3 Comparison of the apoptosis rates of HeLa cells in each group treated by RPDPC (n=6)

2.4 HeLa細胞miR-21和E6、E7、PTEN、PI3K、AktmRNA表達水平的變化 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，經(jīng)12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L RPDPC處理48 h后，HeLa細胞中E6、E7、PI3K、Akt mRNA及miR-21的相對表達量均降低，PTENmRNA相對表達量升高，均呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

圖4 RPDPC處理后各組HeLa細胞中E6、E7、PTEN、PI3K、Akt mRNA及miR-21相對表達水平比較(n=6)Fig.4 Comparison of the expression levels of miR-21 and mRNA of E6, E7, PTEN, PI3K, Akt in HeLa cells of each group treated by RPDPC (n=6)

2.5 He L a 細胞中凋亡相關(guān)通路蛋白的表達Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L RPDPC處理48 h后，各組HeLa細胞中PTEN蛋白表達水平均明顯增高(P＜0.05)，且不同濃度組間差異明顯(P＜0.05)；PI3K、p-PI3K、p-Akt和Akt蛋白表達水平均明顯降低(P＜0.05)，且不同濃度組間差異明顯(P＜0.05，圖5)。

圖5 RPDPC處理后各組HeLa細胞中PTEN、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt相對蛋白表達水平比較(n=6)Fig.5 Comparison of the expression levels of PTEN, p-PI3K, PI3K, p-Akt and Akt in HeLa cells of each group treated by RPDPC(n=6)

3 討 論

海洋面積與地球表面的70%，海洋生物特別是海洋無脊椎動物(如海綿、海鞘等)是藥用分子的豐富來源，其中部分化合物具有獨特的結(jié)構(gòu)，對癌細胞具有細胞毒性。到2020年底，近10種臨床批準(zhǔn)的抗癌藥物是以海洋生物中分離出的小分子化合物為基礎(chǔ)開發(fā)而來，還有近1000種相關(guān)的新結(jié)構(gòu)化合物處于不同臨床試驗階段[7-8]。因此，海洋生物用于新藥開發(fā)具有較大潛力，引起了多個學(xué)科的關(guān)注；其中部分雜環(huán)化合物具有特殊而廣泛的作用，部分含吡咯烷酮結(jié)構(gòu)的雜環(huán)衍生物在醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景，已有研究顯示部分相關(guān)化合物具有顯著的抗病毒、抗艾滋病、抗肌肉堿或抗癲癇作用[9]。1998年一類雙(吲哚)生物堿從沖繩海洋被囊動物Rhopalaea sp.中被提取，即Rhopaladin A－D四種海洋生物堿，具有staurosporine型骨架或來自被囊動物的哌嗪環(huán)，是第一批被報道有咪唑啉酮結(jié)構(gòu)的雙(吲哚)生物堿，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等多種生物活性作用[6]。其中，Rhopaladin B可抑制細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK4)和酪氨酸激酶 C-erbB2的表達，而C-erbB2的表達與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；Rhopaladins C對黃鏈球菌和棒狀桿菌均有抗菌活性。Rhopaladins的生物學(xué)特性使它們有望成為新型抗腫瘤藥物，但要大量獲取這些生物堿及其類似物，較為可行的途徑是化學(xué)合成。我們前期合成了Rhopaladins的類似物RPDPC，化學(xué)名為E-N-叔丁基-2-對氯苯甲酰基-1-異丙基-4-對氟芐叉基-5-吡咯烷酮-2-酰胺；合成方法為多組分一鍋合成法，構(gòu)建具有與Rhopaladins結(jié)構(gòu)類似的母核及取代芳基(分子式及選擇策略見圖6)[10-11]。本研究觀察了RPDPC對宮頸癌HeLa細胞的作用，初步探討其可能的作用機制。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對照組(DMSO)比較，12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L RPDPC干預(yù)后宮頸癌HeLa細胞的活力受到抑制，且隨時間延長和RPDPC濃度增高，抑制作用更加明顯；AnnexinⅤ-FITC/PI雙染觀察RPDPC對HeLa細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示與對照組比較，實驗組HeLa細胞凋亡率明顯升高，且濃度越高促凋亡作用越明顯，提示RPDPC可能抑制宮頸癌細胞的增殖，誘導(dǎo)癌細胞凋亡。

圖6 選擇RPDP A－C 作為目標(biāo)分子的合成策略Fig.6 The synthesis strategy for RPDP A–C as targets

持續(xù)感染高危人乳頭瘤病毒(HPV)是誘發(fā)宮頸癌的主要原因；90.8%的宮頸癌患者感染了高危型HPV，而宮頸鱗癌和腺癌與HPV16、HPV18長期感染密切相關(guān)[12]。故本研究選用HPV18陽性的Hela細胞為研究對象。E6和E7是HPV18編碼的兩種主要病毒癌基因，它們的表達水平?jīng)Q定了HPV的致癌力。有研究顯示，在HPV陽性的宮頸癌患者活檢組織和HPV陽性細胞中E6和E7是最豐富的病毒轉(zhuǎn)錄本，提示E6和E7在HPV病毒復(fù)制和致癌進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13-16]。E6和E7序列的開放閱讀框直接參與調(diào)節(jié)宮頸癌細胞的生長，在其增殖中起重要作用，并與宮頸癌細胞的凋亡密切相關(guān)[17]。本研究qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，不同濃度RPDPC處理的HeLa細胞E6和E7mRNA表達水平均明顯降低，且RPDPC濃度越高mRNA表達水平降低越顯著，提示RPDPC對宮頸癌細胞的作用可能與E6、E7的低表達密切相關(guān)。

MicroRNAs(miRNAs)是一類短小的非編碼RNA，是基因表達的關(guān)鍵調(diào)控因子。miRNAs的異常表達可影響多種腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化及代謝等。miRNAs通過部分序列同源性與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)結(jié)合，調(diào)節(jié)mRNA的表達，從而在多種真核生物的基因表達調(diào)控和發(fā)育動力學(xué)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。miRNAs可參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，如miR-21是已知在多種類型的人類癌癥中上調(diào)的主要腫瘤因子，是宮頸癌細胞系和腫瘤樣本中表達較豐富的一種miRNA；過度表達的E6、E7可上調(diào)miR-21的表達。已有研究顯示抑癌基因PTEN是宮頸癌miR-21的基因靶點；PTEN在腫瘤發(fā)展過程中是一種抑制因子，可以負向調(diào)節(jié)PI3K/Akt軸，而PI3K/Akt信號通路與癌細胞的增殖、凋亡有關(guān)[19-20]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，RPDPC處理的各組HeLa細胞miR-21表達水平明顯下調(diào)，PTENmRNA和PTEN蛋白表達水平明顯上調(diào)，PI3KmRNA和p-PI3K、PI3K蛋白的表達水平明顯下調(diào)，AktmRNA和p-Akt、Akt蛋白表達水平明顯下調(diào)，提示miR-21/PTEN/PI3K/Akt信號軸可能參與了RPDPC對宮頸癌細胞的抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，RPDPC在體外可抑制宮頸癌HeLa細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡；相關(guān)作用機制可能是RPDPC通過miR-21/PTEN/PI3K/Akt信號通路抑制HPV的癌基因E6、E7表達；提示RPDPC對于宮頸癌有潛在的抗腫瘤作用，有望用于宮頸癌治療的研究。但不足之處在于，本研究僅開展了體外細胞實驗，僅觀察了RPDPC調(diào)節(jié)E6、E7的表達及對21/PTEN/PI3K/Akt信號通路的影響，是否存在其他相關(guān)基因與信號通路的參與，尚待進一步驗證，RPDPC的抗腫瘤作用也有待后續(xù)動物實驗進一步驗證。