載銅綠假單胞菌OprF和PcrV基因聯(lián)合DNA疫苗的水凝膠緩釋系統(tǒng)的構(gòu)建及免疫效力評(píng)價(jià)

趙軒，江曉烽，秦江雷，王勇，石敏，雍琴，余嫻*

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究室，重慶 400010；2河北省炎癥自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)在自然界中分布廣泛，可感染多種宿主[1]，尤其是可引起人類呼吸道、燒傷傷口等感染，嚴(yán)重者可危及患者生命[2]。PA由于其高耐藥性和基因多樣性[3]，臨床防治具有一定的挑戰(zhàn)性。早在2017年，WHO就將耐碳青霉烯類PA列入細(xì)菌病原體的關(guān)鍵類別[4]。鑒于有效抗菌藥物的缺乏，亟需研發(fā)一種行之有效的PA疫苗來解決這一困境。相較于滅活疫苗、減毒活疫苗等傳統(tǒng)疫苗，DNA疫苗具有易生產(chǎn)、成本低、穩(wěn)定性高和不存在毒力逆轉(zhuǎn)風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)勢(shì)[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PA外膜蛋白F(outer membrane protein F，OprF)免疫原性強(qiáng)，在不同菌株中高度保守，參與了PA生物膜的形成，與PA耐藥及定植相關(guān)，是PA疫苗研發(fā)的熱門候選抗原之一[6-7]。此外，位于PA Ⅲ型分泌系統(tǒng)尖端的V抗原(Pseudomonas V antigen，PcrV)是該系統(tǒng)的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，起著“開關(guān)”的作用，是決定毒素分泌啟動(dòng)的關(guān)鍵，其編碼基因在不同PA菌株中高度保守[8]，具有良好的免疫原性，是一種很有前景的疫苗候選抗原[9-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，聚天冬氨酸酰肼/聚乙二醇二醛[poly(aspar tic acid) derivatives with hydrazide functional groups/poly(ethylene glycol) dialdehyde，PAEH/PEG DA]水凝膠易于制備，且具有良好的穩(wěn)定性、安全性及緩釋作用等優(yōu)點(diǎn)[12]，可進(jìn)一步用于體內(nèi)DNA疫苗的遞送。本研究在前期研制載PA OprF DNA疫苗溫敏水凝膠系統(tǒng)[13]的基礎(chǔ)上，研制了OprF和PcrV基因聯(lián)合DNA疫苗，希望該疫苗可同時(shí)產(chǎn)生OprF及PcrV抗體以減弱不同血清型PA的致病性和耐藥性，同時(shí)全面誘導(dǎo)細(xì)胞、體液免疫，從而達(dá)到免疫保護(hù)的作用。此外，創(chuàng)新性地聯(lián)合PAEH/PEG DA水凝膠，以實(shí)現(xiàn)抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)對(duì)聯(lián)合DNA疫苗的長(zhǎng)時(shí)間攝取，進(jìn)一步增強(qiáng)聯(lián)合DNA疫苗的免疫效力，最終達(dá)到預(yù)防PA感染的目的。

1 材料與方法

1.1 材料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 L-天冬氨酸購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，聚乙二醇由光復(fù)精細(xì)化工研究所提供，pVAX1-OprF和pVAX1-PcrV重組質(zhì)粒、OprF和PcrV抗原蛋白購(gòu)自上海生工生物有限公司并保存于–80 ℃，小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞DC 2.4由本實(shí)驗(yàn)室保存，EntransterTM-in vivo體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑(En)購(gòu)自北京英格恩生物有限公司，胎牛血清購(gòu)自上海VivaCell逍鵬生物科技有限公司，RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒購(gòu)自重慶賽米克生物有限公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、單組份TMB顯色液、ELISA終止液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，小鼠γ干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。3-18臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自湖南可成儀器設(shè)備有限公司，Varioskan LUX酶標(biāo)儀、NanoDropTMone超微量紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，iCEN-24R低溫高速離心機(jī)購(gòu)自杭州奧盛儀器有限公司。27只6～8周齡SPF級(jí)健康雌性BALB/c小鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由進(jìn)食、飲水。本研究獲重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[第2019(137)號(hào)]。

1.2 PAEH和PEG DA的制備 根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]的方法制備PAEH和PEG DA。通過L-天冬氨酸的熱縮聚反應(yīng)合成聚天冬氨酸，然后將其溶于二甲基亞砜溶液，并在冰水浴條件下加入水合肼，室溫下反應(yīng)24 h，在丙酮溶液中獲得PAEH。通過“簡(jiǎn)單四步法”制備PEG DA。

1.3 PAEH/PEG DA水凝膠的制備 首先，室溫條件下分別稱取一定量的Na2HPO4和NaH2PO4固體粉末，溶于適量ddH2O中配制pH 5.4的緩沖體系。然后分別稱取一定量的PAEH和PEG DA固體粉末，溶于上述緩沖體系中，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為10%的PAEH溶液和PEG DA溶液。最后將上述兩種溶液等體積混合，無需額外刺激即可成膠。后續(xù)所用水凝膠無特殊說明均為此濃度。

1.4 室溫下PAEH/PEG DA水凝膠凝膠時(shí)間的測(cè)定

利用倒置試管法檢測(cè)水凝膠的凝膠時(shí)間。將配制好的水凝膠溶液及含pVAX1-PcrV的水凝膠樣品(pVAX1-PcrV質(zhì)量濃度為0.1 μg/μl)置于EP管內(nèi)，放置在25 ℃恒溫水浴鍋中，密切觀察凝膠溶液狀態(tài)，當(dāng)?shù)怪肊P管30 s后溶液均不流動(dòng)則視為水凝膠已完全凝膠化，記錄此時(shí)的時(shí)間即為水凝膠的凝膠時(shí)間。在相同實(shí)驗(yàn)條件下分別測(cè)量3次取均值。

1.5 PAEH/PEG DA水凝膠細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 采用CCK-8法檢測(cè)DNA疫苗pVAX1-PcrV水凝膠緩釋系統(tǒng)的細(xì)胞毒性。將DC 2.4細(xì)胞以5×104/孔的密度接種于96孔板，在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按處理因素分為以下4組：對(duì)照組(10 μl PBS)、水凝膠組(Gel，5倍水凝膠稀釋液5 μl+PBS 5 μl)、En/pVAX1-PcrV組(P，En/pVAX1-PcrV 5 μl+PBS 5 μl)、水凝膠+En/pVAX1-PcrV組(GP，5倍水凝膠稀釋液5 μl+En/pVAX1-PcrV 5 μl)，其中En/pVAX1-PcrV復(fù)合物配制方法參照En說明書(DNA:En=1:2，V:V)。各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24、48 h后棄去原培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8試劑10 μl及無血清培養(yǎng)基90 μl，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，置于酶標(biāo)儀中測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 PAEH/PEG DA水凝膠體外降解及釋放實(shí)驗(yàn)制備水凝膠及含pVAX1-PcrV的水凝膠(200 μl水凝膠中含pVAX1-PcrV 60 μg)，混勻后室溫下平衡1 h，然后向水凝膠及含pVAX1-PcrV的水凝膠中加入37 ℃預(yù)熱的PBS溶液500 μl，37 ℃下60 r/min恒溫振搖，取出全部上清液，將凝膠表面和管壁上殘余的液體用吸水紙擦凈后稱重，并在稱量完畢后補(bǔ)足37 ℃預(yù)熱的PBS溶液500 μl，利用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)上清液中pVAX1-PcrV重組質(zhì)粒的濃度。

1.7 PAEH/PEG DA水凝膠體內(nèi)降解性能及組織安全性檢測(cè) 將9只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組(n=3)，取水凝膠溶液200 μl注射于BALB/c小鼠背部皮下，分別于注射后30 min、2 d、7 d脫頸處死小鼠，對(duì)注射部位的凝膠進(jìn)行拍照，觀察凝膠體內(nèi)降解情況，同時(shí)收集凝膠周圍皮膚組織，4%多聚甲醛固定后行HE染色，觀察該水凝膠在小鼠體內(nèi)的組織安全性。

1.8 動(dòng)物免疫方案 將18只BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組(n=3)：對(duì)照組(PBS)、水凝膠組(Gel)、En/pVAX1-OprF組(O)、En/pVAX1-PcrV組(P)、En/(pVAX1-OprF+pVAX1-PcrV)組(OP)、水凝膠+En/(pVAX1-OprF+pVAX1-PcrV)組(GOP)。體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑En與質(zhì)粒DNA的配制參照說明書進(jìn)行。各組小鼠背部皮下注射相應(yīng)免疫制劑200 μl/只，其中O組、P組每只小鼠含相應(yīng)質(zhì)粒DNA 20 μg，OP組、GOP組每只小鼠含兩種質(zhì)粒DNA各10 μg。首次免疫后，每隔10 d加強(qiáng)免疫1次，共免疫3次，于末次免疫2周后脫頸處死小鼠。

1.9 血清特異性IgG抗體檢測(cè) 各組小鼠在末次免疫2周后行眼球摘除法采血并分離血清，參考文獻(xiàn)[14]中的方法，利用間接ELISA法檢測(cè)血清中特異性IgG抗體水平，其中，特異性抗OprF IgG抗體檢測(cè)分為PBS組、Gel組、O組、OP組和GOP組，而特異性抗PcrV IgG抗體檢測(cè)分為PBS組、Gel組、P組、OP組和GOP組。兩種特異性IgG抗體檢測(cè)分別以O(shè)prF和PcrV蛋白(濃度均為5 μg/ml)作為包被抗原包被酶標(biāo)板，以100倍稀釋的小鼠血清為一抗，250倍稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體為二抗，采用間接ELISA法測(cè)定血清特異性抗OprF IgG抗體和抗PcrV IgG抗體水平。

1.10 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用CCK-8法檢測(cè)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖情況。末次免疫2周后脫頸處死小鼠，無菌分離各組小鼠脾臟，參考文獻(xiàn)[15]中的方法制備脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml，每孔加細(xì)胞懸液100 μl于96孔板中，設(shè)置兩個(gè)組，分別加入OprF蛋白和PcrV蛋白(濃度均為10 μg/ml)進(jìn)行特異性刺激，隨后將其放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h，然后加入10 μl CCK-8試劑，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組OD值，并計(jì)算脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(stimulation index，SI)。

1.11 IFN-γ水平檢測(cè) 按照1.10的方法制備脾淋巴細(xì)胞懸液，并于96孔板中培養(yǎng)，設(shè)置兩個(gè)組，分別用OprF和PcrV蛋白(濃度均為10 μg/ml)刺激各組淋巴細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h后收集上清液，參照小鼠IFN-γ檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)各組脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ水平。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PAEH/PEG DA水凝膠的凝膠時(shí)間 PAEH上的肼基可與PEG DA上的醛基1:1反應(yīng)形成動(dòng)態(tài)酰腙鍵，PAEH/PEG DA水凝膠的制備機(jī)制及其凝膠化過程見圖1。倒置試管法測(cè)定室溫下PAEH/PEG DA水凝膠的凝膠時(shí)間，結(jié)果顯示，在25 ℃條件下，空白PAEH/PEG DA水凝膠凝膠時(shí)間為(29.39±0.26) min，載pVAX1-PcrV的PAEH/PEG DA水凝膠凝膠時(shí)間為(29.45±0.25) min，二者無明顯差異，均可在30 min內(nèi)形成穩(wěn)定的凝膠態(tài)。

圖1 PAEH/PEG DA水凝膠的制備機(jī)制(A)及凝膠示意圖(B)Fig.1 Preparation mechanism (A) and gelation schematic (B) of PAEH/PEG DA hydrogel

2.2 PAEH/PEG DA水凝膠的細(xì)胞毒性 檢測(cè)凝膠化濃度以下的PAEH/PEG DA水凝膠緩釋系統(tǒng)對(duì)DC 2.4細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示，與PBS組比較，Gel組、P組及GP組24及48 h的細(xì)胞存活率均在90%以上，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)，提示PAEH/PEG DA水凝膠具有良好的細(xì)胞安全性，且負(fù)載En/pVAX1-PcrV復(fù)合物后仍無明顯細(xì)胞毒性，可進(jìn)一步用于體內(nèi)研究。

圖2 不同處理因素對(duì)DC 2.4細(xì)胞處理24 h (A)和48 h (B)的體外細(xì)胞毒性分析(±s, n=3)Fig.2 In vitro cytotoxicity of different treatments to DC 2.4 cells for 24 h (A) and 48 h (B) (±s, n=3)

2.3 PAEH/PEG DA水凝膠的體外降解及釋放 水凝膠體外降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，初始水凝膠質(zhì)量有所增加，6 h到達(dá)峰值(116%)，隨后凝膠質(zhì)量不斷下降，在108 h時(shí)，水凝膠質(zhì)量約為原有質(zhì)量的20%，提示水凝膠具有良好的體外降解性能(圖3A)。利用無膜溶出法評(píng)價(jià)該水凝膠的體外釋放特性，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)水凝膠釋放介質(zhì)中pVAX1-PcrV的含量以計(jì)算水凝膠釋放介質(zhì)中pVAX1-PcrV的累積釋放率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體外釋放36 h后，該水凝膠累積釋放出pVAX1-PcrV總量的85%左右(圖3B)。

圖3 PAEH/PEG DA水凝膠的體外降解曲線(A)和體外釋放曲線(B) (±s, n=3)Fig.3 In vitro degradation curve (A) and in vitro release curve (B) of PAEH/PEG DA hydrogel (±s, n=3)

2.4 PAEH/PEG DA水凝膠的體內(nèi)降解性能及組織安全性 水凝膠體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將液態(tài)的水凝膠注射到皮下后，即可在原位形成凝膠，隨著時(shí)間的推移，水凝膠在體內(nèi)逐漸降解，注射7 d后觀察到水凝膠幾乎完全降解(圖4A)，表明該水凝膠具有良好的生物可降解性。HE染色結(jié)果顯示，皮膚組織保持完整的表皮和真皮結(jié)構(gòu)，膠原束排列緊密有序(圖4B)。

圖4 PAEH/PEG DA水凝膠體內(nèi)降解(A)及注射部位皮膚組織HE染色(B)Fig.4 In vivo degradation of PAEH/PEG DA hydrogel (A), and representative skin tissue of hydrogel injection site (B, HE staining)

2.5 血清抗體檢測(cè)結(jié)果 間接ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，與PBS組比較，Gel組小鼠血清特異性抗OprF IgG抗體水平無明顯變化(P>0.05)，而O組、OP組及GOP組小鼠血清特異性抗OprF IgG抗體水平明顯升高(P＜0.01)，且OP組和GOP組明顯高于O組(P＜0.05，P＜0.01)，GOP組明顯高于OP組(P＜0.05)(圖5A)。與PBS組比較，Gel組和P組小鼠血清特異性抗PcrV IgG抗體水平無明顯變化(P>0.05)，而OP組和GOP組小鼠血清特異性抗PcrV IgG抗體水平明顯升高(P＜0.01)，且OP組和GOP組明顯高于Gel組和P組(P＜0.05)，GOP組明顯高于OP組(P＜0.01)(圖5B)。

圖5 免疫小鼠血清特異性IgG抗體水平(±s, n=3)Fig.5 Serum specific IgG antibody levels of immunized mice (±s, n=3)

2.6 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，在OprF特異性抗原刺激下，與PBS組比較，Gel組脾淋巴細(xì)胞SI無明顯變化(P>0.05)，而O組、OP組及GOP組脾淋巴細(xì)胞SI明顯升高(P＜0.01)，且OP組及GOP組明顯高于O組(P＜0.05)，GOP組明顯高于OP組(P＜0.05)(圖6A)。在PcrV特異性抗原刺激下，與PBS組相比，Gel組脾淋巴細(xì)胞SI無明顯變化(P>0.05)，而P組、OP組和GOP組脾淋巴細(xì)胞SI明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，且OP組及GOP組明顯高于P組(P＜0.05，P＜0.01)，GOP組明顯高于OP組(P＜0.05)(圖6B)。

圖6 抗原刺激后各組小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)比較(±s, n=3)Fig.6 Comparison of the stimulation index (SI) of splenic lymphocytes from mice immunized (±s, n=3)

2.7 不同抗原刺激下脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ水平 ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，在OprF特異性抗原刺激下，與PBS組相比，Gel組脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ水平無明顯變化(P>0.05)，而O組、OP組及GOP組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ水平明顯升高(P＜0.01)，且OP組及GOP組明顯高于O組(P＜0.01)，GOP組明顯高于OP組(P＜0.05)(圖7A)。在PcrV特異性抗原刺激下，與PBS組比較，Gel組脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ水平無明顯變化(P>0.05)，而P組、OP組及GOP組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ水平明顯增高(P＜0.01)，且OP組及GOP組明顯高于P組(P＜0.05，P＜0.01)，GOP組明顯高于OP組(P＜0.01)(圖7B)。

圖7 ELISA法檢測(cè)抗原刺激后各組小鼠脾淋巴細(xì)胞上清液中IFN-γ的濃度(±s, n=3)Fig.7 Concentration of IFN-γ in the supernatant of antigen-stimulated splenic lymphocytes of immunized mice in each group(Determined by ELISA, ±s, n=3)

3 討 論

PA是導(dǎo)致院內(nèi)感染的常見病原體之一，而當(dāng)前新抗菌藥物的研發(fā)嚴(yán)重不足，難以應(yīng)對(duì)日益嚴(yán)重的PA耐藥的威脅，因此亟需開發(fā)一種PA疫苗來防治PA感染。近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，直接利用抗原表位基因構(gòu)建DNA疫苗已成為主流的研究方向之一[16]。DNA疫苗雖然具有安全性高、易于制備多價(jià)疫苗等優(yōu)勢(shì)，但在體內(nèi)易受pH值及酶等因素的影響而被降解和滅活，限制了其臨床應(yīng)用[13]。因此，探索新的DNA疫苗遞送系統(tǒng)對(duì)提高DNA疫苗的免疫效力，有效防治PA感染具有重要意義。

本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了載PAOprF和PcrV基因聯(lián)合DNA疫苗的PAEH/PEG DA水凝膠緩釋系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有易于制備、便于免疫注射和增強(qiáng)DNA疫苗免疫效力等優(yōu)點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，在室溫條件下，載PA DNA疫苗的PAEH/PEG DA水凝膠緩釋系統(tǒng)可在30 min內(nèi)形成穩(wěn)定的凝膠，提示該緩釋系統(tǒng)具有良好的可注射性，有望在注射部位形成穩(wěn)定的凝膠疫苗儲(chǔ)庫(kù)。相較于傳統(tǒng)溫敏水凝膠不易與DNA疫苗制劑混合、在常溫條件下注射性差等缺點(diǎn)，PAEH/PEG DA水凝膠具有易于制備、與DNA疫苗制劑混合均勻、便于注射等優(yōu)點(diǎn)，避免了混合不均勻?qū)е碌臒o效釋放，確保了水凝膠的緩釋作用。因組織安全性是生物材料在體內(nèi)應(yīng)用的前提，本研究評(píng)價(jià)了含或不含En/DNA疫苗復(fù)合物水凝膠溶液的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示PAEH/PEG DA水凝膠具有良好的細(xì)胞及組織安全性，可進(jìn)一步用于DNA疫苗的體內(nèi)遞送。體內(nèi)外降解實(shí)驗(yàn)表明，該凝膠約7 d即可完全降解，具有良好的生物可降解性；體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，該凝膠可持續(xù)緩慢地釋放所負(fù)載的DNA疫苗，有望延長(zhǎng)DNA疫苗在體內(nèi)的存留時(shí)間，從而持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)，提高DNA疫苗的有效性。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，OprF和PcrV基因高度保守、免疫原性好、與PA致病及耐藥高度相關(guān)，相應(yīng)抗體及疫苗對(duì)小鼠感染模型均有免疫保護(hù)作用[9-10,17]。體液免疫和細(xì)胞免疫是機(jī)體抵抗細(xì)菌感染的主要因素，IgG抗體水平直接反映機(jī)體的體液免疫水平[18]，脾淋巴細(xì)胞作為機(jī)體的重要免疫細(xì)胞，其增殖及細(xì)胞因子IFN-γ分泌水平是細(xì)胞免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)[19]。本研究證實(shí)PAEH/PEG DA水凝膠材料本身不具有特異性免疫原性，與PBS一樣，在小鼠體內(nèi)不會(huì)誘發(fā)免疫反應(yīng)。單基因OprFDNA疫苗可引起小鼠體內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)，與課題組前期研究結(jié)果一致[13]。單基因PcrVDNA疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖明顯，IFN-γ水平升高，而IgG抗體水平無明顯變化，表明PcrVDNA疫苗可引起小鼠體內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，但其誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)的能力不足，與Jiang等[14]的研究一致，可能與PcrVDNA疫苗免疫原性不足有關(guān)。本研究聯(lián)合OprF和PcrV作為候選抗原，與單基因OprF或PcrVDNA疫苗相比，聯(lián)合DNA疫苗可產(chǎn)生更多的抗OprF和抗PcrV抗體，表明其具有更強(qiáng)的體液免疫誘導(dǎo)能力。通過對(duì)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子IFN-γ分泌水平的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合DNA疫苗對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于單基因OprF或PcrVDNA疫苗，且聯(lián)合DNA疫苗在OprF或PcrV抗原刺激下均能誘導(dǎo)有效的IFN-γ分泌，其效果優(yōu)于單基因OprF或PcrVDNA疫苗。以上結(jié)果表明，相較于單基因OprF或PcrVDNA疫苗，OprF和PcrV基因聯(lián)合DNA疫苗具有更強(qiáng)的免疫原性，能誘導(dǎo)更強(qiáng)的細(xì)胞及體液免疫。

本研究還發(fā)現(xiàn)，易制備、具有緩釋性能的PAEH/PEG DA水凝膠系統(tǒng)可進(jìn)一步增強(qiáng)聯(lián)合DNA疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)，考慮可能的原因?yàn)樗z包載聯(lián)合DNA疫苗在注射部位形成凝膠疫苗儲(chǔ)庫(kù)，避免了部分DNA疫苗的直接降解，同時(shí)能夠持續(xù)緩慢地釋放DNA疫苗，使注射部位周圍的DNA疫苗濃度保持在一個(gè)較高的水平，以延長(zhǎng)APC對(duì)DNA疫苗的攝取時(shí)間，從而持續(xù)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，引發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)[13,20]。

綜上所述，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化了載DNA疫苗的水凝膠緩釋系統(tǒng)，制備了PAOprF和PcrV基因聯(lián)合DNA疫苗，獲得載PAOprF和PcrV基因聯(lián)合DNA疫苗的PAEH/PEG DA水凝膠緩釋系統(tǒng)，并在體液免疫和細(xì)胞免疫層面證實(shí)了該緩釋系統(tǒng)的優(yōu)良免疫效力。但本研究尚缺少免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)研究可構(gòu)建PA感染小鼠模型并驗(yàn)證該系統(tǒng)的免疫保護(hù)作用，為研發(fā)有效、安全、經(jīng)濟(jì)的PA疫苗提供新的策略，為預(yù)防PA引起難治性感染奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。