腹腔穿刺引流對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠胰腺細(xì)胞焦亡的影響及其意義

吳俊，盧一琛，黃竹，蔣文，且華吉，劉江濤，孫紅玉,3*，湯禮軍*

1西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610063；2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍普通外科中心/四川省胰腺損傷與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610083；3西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610083

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一種病情嚴(yán)重、病死率高達(dá)30%的臨床急腹癥[1]，其特征是廣泛的胰腺組織壞死、后續(xù)感染、全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)及并發(fā)多器官功能障礙綜合征[1-2]。SAP病死率高的關(guān)鍵原因是目前尚無有效的措施能控制其進(jìn)展。在SAP早期，腹腔內(nèi)常會(huì)出現(xiàn)胰腺炎相關(guān)腹水(pancreatitis associated ascite fluid，PAAF)，其內(nèi)含有大量胰酶、游離脂肪酸、內(nèi)毒素等有害物質(zhì)[3-4]。已經(jīng)證實(shí)早期實(shí)施腹腔穿刺引流(abdominal paracentesis drainage，APD)引流腹水能夠降低SAP患者全身炎癥反應(yīng)、多器官功能障礙綜合征的發(fā)生率及病死率[4-6]。然而，APD治療SAP的機(jī)制尚不明確[7]，對(duì)其進(jìn)行深入探討可為臨床行APD治療SAP提供理論依據(jù)，并為尋找相應(yīng)的治療靶點(diǎn)及研究相關(guān)藥物輔助治療提供思路。

細(xì)胞焦亡是由含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-1、4及5介導(dǎo)的一種程序性細(xì)胞死亡方式[8-9]，其中caspase-1介導(dǎo)的焦亡是其經(jīng)典激活途徑，特征是促炎因子釋放及溶解性死亡[10-11]。一方面，切割的caspase-1分解白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β及IL-18前體為有活性的形式；另一方面，切割的caspase-1切割gasdermin家族蛋白D(gasdermin D，GSDMD)，切割的GSDMD N末端蛋白可識(shí)別質(zhì)膜上的磷酸肌醇及心磷脂，形成膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，此為焦亡的特征性改變；具有活性的IL-1β、IL-18等內(nèi)容物從膜孔被釋放，可募集更多的炎性細(xì)胞，從而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。本研究探討APD治療對(duì)SAP胰腺組織細(xì)胞焦亡的影響及其意義，以期進(jìn)一步認(rèn)識(shí)APD治療SAP的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 48只SPF級(jí)SD大鼠(220～250 g)購自成都恩斯維爾生物科技有限公司。?；悄懰徕c購自美國(guó)Sigma公司；大鼠脂肪酶、淀粉酶生化檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；IL-1β、IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)試劑盒購自上海拙彩生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)試劑盒One Step SYBR PrimeScript RT-PCR KitⅡ購自日本TaKaRa公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；pro-caspase-1及凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)抗體購自美國(guó)Abcam公司，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor 3，NLRP3)抗體購自美國(guó)Thermo Fisher公司，cleaved-caspase-1抗體、GSDMD抗體、GAPDH抗體及山羊抗兔二抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，cleaved-GSDMD抗體購自武漢ABclonal公司；RNA提取試劑及全蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；動(dòng)物用麻醉藥異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備 48只大鼠首先在獨(dú)立通氣籠中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，術(shù)前禁食12 h，不禁飲。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為SAP組、APD組及假手術(shù)組，每組16只。SAP組使用5%?；悄懰徕c構(gòu)建SAP模型。具體操作如下：采用異氟烷麻醉動(dòng)物后，在劍突下1 cm處沿腹白線開腹，然后在十二指腸上尋找胰膽管開口，穿刺針穿刺進(jìn)入胰膽管，夾閉胰膽管兩端并固定穿刺針，使用微量輸液泵均勻輸注?；悄懰徕c溶液，劑量為0.1 ml/100 g，速度為12 ml/h。輸注結(jié)束后壓力維持5 min，取下穿刺針及動(dòng)脈夾，關(guān)腹。APD組按SAP組的操作成功構(gòu)建SAP模型后，在動(dòng)物右下腹放置引流管，引流管外接真空負(fù)壓吸引球，關(guān)腹。假手術(shù)組采用與SAP組相同的方式開腹并找到胰腺，翻動(dòng)胰腺數(shù)次后關(guān)腹。術(shù)后禁食不禁飲。所有大鼠于建模后12 h處死，收集其血清及胰腺組織。實(shí)驗(yàn)過程符合國(guó)家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理及使用規(guī)定。

1.2.2 胰腺組織病理學(xué)檢查 采用4%多聚甲醛溶液固定胰腺組織，經(jīng)脫水、石蠟包埋后，制備厚4 μm的切片并進(jìn)行HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察其病理形態(tài)學(xué)改變，由兩位病理醫(yī)師參照Schmidt等[12]報(bào)道的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立地對(duì)胰腺損傷程度從水腫、壞死、出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等方面進(jìn)行評(píng)分。

1.2.3 血清脂肪酶、淀粉酶活性檢測(cè) 于造模后12 h經(jīng)腹主動(dòng)脈采集大鼠血液樣本，靜置30 min后，以3500 r/min離心20 min，收集上清液，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清脂肪酶及淀粉酶的活性，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)血清炎性因子水平 采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-18的水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)胰腺組織相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平 采用Trizol法提取胰腺組織總RNA，使用NanoDrop-2000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及光密度(OD)值，OD260/OD280值在1.8～2.0符合標(biāo)準(zhǔn)。采用一步法PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增，具體條件如下：42 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照基因，引物均由上海生工生物工程有限公司合成，具體序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab. 1 Primer sequences of RT-PCR

1.2.6 Western blotting檢測(cè)胰腺組織caspase-1、cleaved-caspase-1、ASC、NLRP3、GSDMD及cleaved-GSDMD蛋白的表達(dá)水平 使用全蛋白提取試劑盒，按照說明書提取胰腺組織總蛋白，使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白樣品的濃度，然后加入蛋白質(zhì)載樣緩沖液煮沸后分裝，置于–80 ℃保存。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)體系分離目標(biāo)蛋白，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，使用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗在4 ℃搖床上孵育12 h，一抗的稀釋比例如下：caspase-1(1:1000)、cleaved-caspase-1(1:2000)、A SC(1:1000)、NLRP3(1:1000)、GSDMD(1:5000)、cleaved-GSDMD(1:1000)、GAPDH(1:5000)。一抗孵育結(jié)束后，使用TBST洗滌3次，室溫下加入二抗(1:10 000)孵育1 h，洗滌3次后在Azure c300化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。

1.2.7 透射電鏡觀察胰腺組織 使用3%戊二醛預(yù)固定約0.1 mm3的胰腺組織，使用1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級(jí)脫水后采用Ep812樹脂包埋，進(jìn)行超薄切片后使用醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色，使用JEM-1400Flash透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0及SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，方差齊時(shí)，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))，進(jìn)一步組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 APD對(duì)SAP大鼠胰腺組織病理損傷的影響 造模12 h后，HE染色結(jié)果顯示SAP組胰腺組織出現(xiàn)了大片壞死、間質(zhì)水腫、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及胰腺小葉結(jié)構(gòu)紊亂等改變，組織病理學(xué)總評(píng)分及4個(gè)方面(水腫、壞死、出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn))的具體評(píng)分均明顯增高，而假手術(shù)組胰腺組織結(jié)構(gòu)基本正常；APD組胰腺組織結(jié)構(gòu)損傷與SAP組比較明顯減輕：壞死面積明顯減少，胰腺小葉結(jié)構(gòu)基本清晰，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，病理學(xué)評(píng)分也較SAP組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理損傷情況比較Fig. 1 Comparison on the pathological injury of pancreatic tissue of each group of rats

2.2 APD對(duì)SAP大鼠脂肪酶、淀粉酶及炎性指標(biāo)的影響 SAP組脂肪酶及淀粉酶活性較假手術(shù)組明顯升高，APD組較SAP組明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與假手術(shù)組比較，SAP組血清IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18水平明顯升高，但APD組較SAP組均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

圖2 各組大鼠血清脂肪酶、淀粉酶活性及炎性因子水平比較Fig. 2 Comparison on the serum lipase and amylase activity, and inflammatory cytokines levels in each group of rats

2.3 APD對(duì)SAP大鼠胰腺組織焦亡通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，SAP組的caspase-1、NLRP3、ASC及GSDMD的mRNA表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與SAP組比較，APD組的caspase-1、NLRP3、ASC及GSDMD的mRNA表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

圖3 各組大鼠胰腺組織焦亡通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Fig. 3 Comparison on the relative expressions of pyroptosis path-related mRNAs of pancreatic tissues in each group of rats

2.4 APD對(duì)SAP大鼠胰腺組織IL-1β及IL-18的mRNA水平的影響 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，SAP組IL-1β及IL-18的mRNA表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，APD組IL-1β及IL-18的mRNA表達(dá)水平明顯低于SAP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

圖4 各組大鼠胰腺組織IL-1β及IL-18 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Fig.4 Comparison on the expression levels of IL-1β and IL-18 mRNAs of pancreatic tissues in each group of rats

2.5 APD對(duì)SAP大鼠胰腺組織焦亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，SAP組的焦亡通路相關(guān)蛋白caspase-1、cleaved-caspase-1、NLRP3、ASC、GSDMD及cleaved-GSDMD表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；APD組上述焦亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平低于SAP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖5)。

圖5 各組大鼠胰腺組織焦亡通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Fig. 5 Comparison on the expression levels of pyroptosis path-related proteins of pancreatic tissues in each group of rats

2.6 APD對(duì)SAP大鼠胰腺腺泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞膜完整性的影響 透射電鏡觀察顯示，與假手術(shù)組比較，SAP組出現(xiàn)了明顯的線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核染色質(zhì)凝聚，在細(xì)胞膜上出現(xiàn)了明顯的膜孔形成(即焦亡的特征性改變)。與SAP組比較，APD組線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯減輕，核染色質(zhì)凝聚明顯減少(圖6)。

圖6 APD對(duì)各組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞膜完整性的影響Fig. 6 Effects of APD on the structure of subcellular organelles and the integrity of cell membranes of pancreatic acinar cells in each group of rats

3 討 論

SAP是一種發(fā)病率高、進(jìn)展迅速且病死率高的消化系統(tǒng)疾病，與機(jī)體免疫反應(yīng)密切相關(guān)并能誘發(fā)器官衰竭，以至早期死亡[2,12-13]。在急性胰腺炎發(fā)病早期，主要是由損傷的細(xì)胞引發(fā)局部炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步釋放促炎因子，募集更多的炎性細(xì)胞，并可能誘發(fā)SIRS[14]，持續(xù)的SIRS易導(dǎo)致全身器官功能紊亂及器官衰竭[15-16]。已經(jīng)證實(shí)PAAF中含有大量有毒物質(zhì)，如炎性介質(zhì)、消化酶及內(nèi)毒素等，它們能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生大量促炎因子，加重全身炎癥反應(yīng)并可導(dǎo)致器官衰竭[17-19]。本研究結(jié)果表明，行APD治療即排除腹水的有毒物質(zhì)后，可以明顯降低血清中TNF-α、IL-1β及IL-6等炎性因子水平，有效控制全身炎癥反應(yīng)，減輕胰腺病理損傷。因此，探明APD的治療機(jī)制有助于為臨床行APD治療SAP提供證據(jù)，也有利于尋找相應(yīng)治療靶點(diǎn)，為研究相關(guān)藥物輔助治療SAP提供思路。

細(xì)胞焦亡是一種促炎形式的溶解性細(xì)胞死亡方式，經(jīng)典的焦亡途徑包括caspase-1激活、膜孔形成及細(xì)胞內(nèi)容物釋放[9,20-22]。Caspase 1的激活需要NLRP3炎性復(fù)合物的參與，它由NLRP3、ASC及pro-caspase-1組成。NLRP3被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)損傷的感受器，能夠?qū)Σ≡嚓P(guān)分子模式及損傷相關(guān)分子模式做出反應(yīng)[23]?；罨腘LRP3把信號(hào)傳遞給下游的ASC，后者可作為橋梁募集pro-caspase-1，形成炎性復(fù)合體并切割pro-caspase-1為有活性的caspase-1?；钚詂aspase-1切割GSDMD，切割的GSDMD識(shí)別并結(jié)合到細(xì)胞膜形成膜孔，誘導(dǎo)焦亡形成[11,20-21]。有研究表明，細(xì)胞焦亡參與多種疾病的進(jìn)展及組織損傷[20-21]。例如，在糖尿病大鼠模型中，NLRP3激活誘導(dǎo)的焦亡會(huì)加重心肌缺血再灌注損傷[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，SAP大鼠胰腺組織的NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved-caspase-1、GSDMD及cleaved-GSDMD表達(dá)均明顯升高，表明NLRP3激活caspase-1誘導(dǎo)的焦亡在SAP形成中起重要作用。在透射電鏡下可觀察到SAP大鼠胰腺組織細(xì)胞膜孔的形成，進(jìn)一步證實(shí)了焦亡的形成。此外，細(xì)胞焦亡及凋亡在形態(tài)學(xué)上有一些共同特征，如核染色質(zhì)凝聚[25]。經(jīng)APD治療后，caspase-1誘導(dǎo)的焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)明顯降低，且胰腺組織損傷明顯減輕，超微結(jié)構(gòu)紊亂也明顯好轉(zhuǎn)，核染色質(zhì)凝聚明顯減少，提示APD治療可通過降低caspase-1誘導(dǎo)的焦亡減輕SAP的胰腺損傷。

Caspase-1被激活后，會(huì)募集并裂解IL-1β及IL-18前體為有活性的IL-1β及IL-18[9]。焦亡形成的膜孔會(huì)導(dǎo)致IL-1β及IL-18從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外，進(jìn)而誘導(dǎo)并加重全身反應(yīng)。已有研究證實(shí)IL-1β是無菌性炎癥及損傷反應(yīng)的重要因子[26]。在急性胰腺炎中，IL-1β被認(rèn)為是導(dǎo)致早期炎癥擴(kuò)散的主要細(xì)胞因子[27]。不僅如此，Xu等[28]在體外使用IL-1β處理胰腺腺泡細(xì)胞AR42J，發(fā)現(xiàn)其可通過介導(dǎo)自噬紊亂使AR42J細(xì)胞內(nèi)的酶原提前激活，提示IL-1β還會(huì)損傷正常腺泡細(xì)胞。IL-18以其能激活γ干擾素(interferon-γ，INF-γ)而被知曉[29]。早在2007年的一項(xiàng)研究就表明，caspase-1激活的IL-18參與了急性胰腺炎的進(jìn)展[30]。最近的一項(xiàng)研究表明，SIRS及代償性抗炎反應(yīng)綜合征在急性胰腺炎中同時(shí)發(fā)生，其中IL-18通過誘導(dǎo)2型輔助T細(xì)胞(T-helper 2，Th2)介導(dǎo)的反應(yīng)發(fā)揮促炎作用，IL-18缺陷小鼠能夠減少T細(xì)胞激活而不增加Th2介導(dǎo)的反應(yīng)[31]。在本研究中，SAP組大鼠血清炎性因子IL-1β、IL-18、IL-6及TNF-α水平明顯升高，經(jīng)過APD處理后，上述炎性因子水平明顯下降；胰腺組織的IL-1β及IL-18的mRNA表達(dá)水平也明顯降低，提示APD治療能夠減輕全身及局部的炎癥反應(yīng)。

實(shí)際上，焦亡一旦發(fā)生即可導(dǎo)致大量細(xì)胞內(nèi)容物釋放，細(xì)胞內(nèi)容物包含大量有害物質(zhì)如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、游離脂肪酸、高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)等[32-33]。ATP、游離脂肪酸可以通過P2X7受體激活NLRP3炎性復(fù)合體，加重胰腺損傷及炎癥反應(yīng)[34-35]。HMGB1是一種重要的炎性介質(zhì)，可通過Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)-4及TLR-9誘導(dǎo)并增強(qiáng)急性胰腺炎的無菌性炎癥反應(yīng)[36-37]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SAP大鼠腹水及血清中的HMGB1含量均明顯升高，中和腹水HMGB1可明顯減輕胰腺損傷及全身炎癥反應(yīng)[38]。

綜上所述，NLRP3炎性小體激活的caspase-1介導(dǎo)的焦亡在SAP大鼠胰腺中被激活，并參與SAP的病情進(jìn)展；早期實(shí)施APD可通過抑制NLRP3炎性小體激活的caspase-1介導(dǎo)的焦亡，減輕局部及全身炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕SAP的胰腺損傷，為臨床早期實(shí)施APD以及開發(fā)抑制焦亡治療SAP的藥物提供了依據(jù)。