長(zhǎng)鏈非編碼RNA COL11A1-208對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響

蔣英英，陳曦，石雨，應(yīng)濟(jì)丞，王笑笑，丁剛*

1濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053；2濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，山東 濰坊 261035

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC，簡(jiǎn)稱(chēng)口腔鱗癌)是頭頸部表皮的常見(jiàn)惡性腫瘤之一[1]，因其局部復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后差，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量[2-3]。對(duì)口腔鱗癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移機(jī)制的探究，有利于推動(dòng)其預(yù)防和治療的進(jìn)步，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸，但缺乏蛋白質(zhì)編碼潛能的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可參與DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、細(xì)胞發(fā)育和分化等，是細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子[4-5]。以往研究顯示，口腔鱗癌細(xì)胞和組織內(nèi)高表達(dá)的lncRNA可促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，可能成為預(yù)測(cè)口腔鱗癌預(yù)后的候選分子標(biāo)記物或靶向治療的潛在靶標(biāo)[6-8]。本研究前期利用基因芯片與生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)6例口腔鱗癌與癌旁正常組織lncRNA表達(dá)譜的篩選結(jié)果顯示，COL11A1-208(ENST00000470170)在口腔鱗癌組織內(nèi)高表達(dá)，且與口腔鱗癌的不良預(yù)后相關(guān)[9]；然而，COL11A1-208在口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)及作用尚不清楚。本研究旨在通過(guò)觀察COL11A1-208在口腔鱗癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、定位，及其表達(dá)改變對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，分析COL11A1-208在口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25% EDTA胰蛋白酶溶液、青霉素-鏈霉素(100×)雙抗溶液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；重組人表皮生長(zhǎng)因子(rEGF)、角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(KSF)、聚氰基丙烯酸正丁脂(BCA)試劑盒、RNA核質(zhì)分離試劑盒(PARISTMKit)、脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑(LipofectamineTM3000)均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；TRIzol試劑、PrimerScript-RT試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)試劑盒(TB Green Premix Ex Taq reagent kit)購(gòu)自日本TaKaRa公司；Cell Count Kit 8(CCK-8)試劑購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；脫脂奶粉、Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；ECL超敏發(fā)光液、Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；PBS緩沖液、TBST緩沖液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；無(wú)血清細(xì)胞凍存液購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司；聚凝胺(polybrene)基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；熒光原位雜交(FISH)試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；嘌呤霉素(puromycin)、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、DNase Ⅰ、4%多聚甲醛固定液、0.5%結(jié)晶紫均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；Ⅺ型膠原α1鏈(collagen type Ⅺ alpha 1 chain，COL11A1)重組蛋白、上皮鈣黏素(E-cadherin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、Ki-67抗體以及HRP-IgG H＆L山羊抗兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；波形蛋白(vimentin)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。6孔板、24孔板、96孔板、培養(yǎng)皿及離心管等耗材均購(gòu)自美國(guó)康寧公司。qPCR 儀(ABI 7500 FAST)購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；激光共聚焦顯微鏡、倒置顯微鏡、正置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司；臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax i3)購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；電泳儀及凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。本研究采用的引物、COL11A1-208Smart Silencer、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用反義寡核苷酸(ASO)及其陰性對(duì)照(negative control，NC)、COL11A1-208的Cy3 FISH探針均由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；COL11A1-208及其N(xiāo)C質(zhì)粒的構(gòu)建及慢病毒包裝均由漢尹生物科技(上海)有限公司完成。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1 細(xì)胞來(lái)源 采用的人口腔鱗癌細(xì)胞系(CAL27、HN4、HN6、HN30、SCC-4、SCC-9、SCC-25)均來(lái)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔腫瘤生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，正常對(duì)照細(xì)胞為人口腔黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)獲得[4-5]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)的方法參考以往研究[6-7]。HN4、HN6、HN30和CAL27細(xì)胞系在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，SCC-4、SCC-9和SCC-25細(xì)胞系在DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基均加入10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素?？谇火つど掀ぜ?xì)胞原代培養(yǎng)在含0.2 ng/ml rEGF的角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行，培養(yǎng)箱條件為37 ℃、濕度95%、5% CO2。密切觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)每隔2～3 d換液；細(xì)胞生長(zhǎng)至約90%融合時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或凍存后備用。

1.2.3 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qPCR實(shí)驗(yàn) 采用TRIzol試劑分離培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA。用PrimerScript-RT試劑盒進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。使用qPCR試劑盒配制20 μl反應(yīng)體系。使用ABI StepOne qPCR儀進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)以GAPDH和(或)U6作為內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)量采用2–ΔΔCt法計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR所用引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR

1.2.4 RNA核質(zhì)分離及FISH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)COL11A1-208的亞細(xì)胞定位 使用RNA核質(zhì)分離試劑盒分離細(xì)胞核、質(zhì)RNA，細(xì)胞核、質(zhì)RNA和總RNA經(jīng)過(guò)純化和DNase Ⅰ處理后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用COL11A1-208引物進(jìn)行qPCR檢測(cè)，根據(jù)以下公式：所占比例(%)=2(總RNA的Ct值－組分RNA的Ct值)×100%，判斷COL11A1-208在細(xì)胞核、質(zhì)RNA內(nèi)的分布比例。U6作為細(xì)胞核的內(nèi)源性對(duì)照，GAPDH作為細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)源性對(duì)照，兩者的分布比例用于判斷RNA核質(zhì)分離的效果。另外，使用RiboTMFISH試劑盒及Cy3熒光標(biāo)記的COL11A1-208FISH探針進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)，采用激光共聚焦顯微鏡觀察COL11A1-208在細(xì)胞中的定位情況。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及COL11A1-208敲減效率驗(yàn)證將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待轉(zhuǎn)染CAL27、HN4細(xì)胞按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，搖勻后置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜；按照脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別向CAL27、HN4細(xì)胞轉(zhuǎn)染COL11A1-208 Smart Silencer(SS-COL11A1-208)或陰性對(duì)照片段Smart Silencer(SS-NC)。轉(zhuǎn)染48 h后用qPCR法進(jìn)行基因敲減效率檢測(cè)，達(dá)到預(yù)定的基因敲減效果后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。COL11A1-208沉默及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用ASO的靶序列見(jiàn)表2。

表2 COL11A1-208沉默及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用ASO的靶序列Tab.2 Target sequences of COL11A1-208 Smart Silencer and ASO for animal experiments

1.2.6COL11A1-208過(guò)表達(dá)慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建及效率驗(yàn)證COL11A1-208慢病毒載體構(gòu)建信息如下：基因名稱(chēng)COL11A1-208(ENST00000470170)；載體元件順序CMV-MCS-PGK-Puro；克隆位點(diǎn)XhoⅠ/EcoR Ⅰ。慢病毒轉(zhuǎn)染具體方法參照以往研究[4-5]。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HN4、HN6細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，搖勻后置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜；使用polybrene基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑(終濃度10 μg/ml)進(jìn)行COL11A1-208過(guò)表達(dá)慢病毒細(xì)胞感染。經(jīng)嘌呤霉素(終濃度10 μg/ml)篩選2或3次，3 μg/ml嘌呤霉素維持培養(yǎng)2周，建立COL11A1-208過(guò)表達(dá)慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株(LV-COL11A1-208)。陰性對(duì)照載體慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株(LV-NC)流程同上。提取LV-COL11A1-208組和LV-NC組細(xì)胞RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用qPCR檢測(cè)COL11A1-208穩(wěn)轉(zhuǎn)株的過(guò)表達(dá)效率。

1.2.7 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將COL11A1-208敲減或過(guò)表達(dá)細(xì)胞接種到96孔板，密度為每孔約1×103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每日檢測(cè)細(xì)胞活性。將10 μl CCK-8試劑加入100 μl培養(yǎng)基，細(xì)胞37 ℃持續(xù)孵育2 h后，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)。連續(xù)檢測(cè)5 d，使用Graphpad Prism 7.0軟件，以細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.8 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力將COL11A1-208敲減或過(guò)表達(dá)細(xì)胞接種到6孔板，每孔1×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)10～14 d形成細(xì)胞集落。將細(xì)胞集落用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定液固定15 min，0.5%結(jié)晶紫染色30 min。對(duì)細(xì)胞數(shù)目>50的集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.9 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力COL11A1-208敲減或過(guò)表達(dá)細(xì)胞消化后，采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，每上室接種2.5×104個(gè)/100 μl細(xì)胞，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。遷移實(shí)驗(yàn)直接使用未處理的Transwell小室，侵襲實(shí)驗(yàn)采用包被Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室。下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h；4%多聚甲醛溶液固定、0.5%結(jié)晶紫染色后，用棉簽擦去膜上表面的非侵入細(xì)胞；高倍鏡下觀察并進(jìn)行穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)。隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行拍照，細(xì)胞計(jì)數(shù)取平均值，以計(jì)數(shù)所得細(xì)胞數(shù)的相對(duì)數(shù)代表癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

1.2.10 Western blotting檢測(cè)COL11A1蛋白和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白(上皮鈣黏素、波形蛋白)的表達(dá)水平 Smart Silencer轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后或慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞的密度達(dá)80%～90%時(shí)，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，加入適量全細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞；充分裂解后，蛋白裂解液105 ℃煮10 min，–80 ℃保存蛋白樣品。使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，105 ℃煮10 min，冰上備用。配膠后上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳，300 mA轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗[COL11A1(1:1000)、E-cadherin(1:500)、波形蛋白(1:1000)、GAPDH(1:1000)]4 ℃搖床孵育過(guò)夜。次日TBST洗3次，二抗室溫孵育1 h；TBST洗3次后，用ECL超敏發(fā)光液進(jìn)行顯影。采用Image J軟件測(cè)量Western blotting條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5周齡的BALB/C-nu雄性裸鼠8只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2021-0006]。本研究經(jīng)濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批同意(批準(zhǔn)文號(hào)：2019SDL008)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定。

1.3.2COL11A1-208敲減的裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)5周齡的雄性裸鼠4只，隨機(jī)分為ASO-COL11A1-208組和ASO-NC組，每組2只；每只裸鼠均做標(biāo)記，備用。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL27細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基將其重懸并計(jì)數(shù)，將密度調(diào)至2×107個(gè)/ml；用注射器將100 μl細(xì)胞懸液注射于裸鼠的上肢兩側(cè)背部皮下。裸鼠飼養(yǎng)約1周后可見(jiàn)瘤體形成，分別向兩組瘤內(nèi)注射5 nmol/50 μl膽固醇和甲基化修飾的ASO-COL11A1-208或ASO-NC，每4 d注射1次，共注射5次；定期觀察瘤體生長(zhǎng)情況。飼養(yǎng)28 d后結(jié)束觀察，將裸鼠安樂(lè)死，取下完整瘤體，拍照并測(cè)量腫瘤重量和體積。

1.3.3COL11A1-208過(guò)表達(dá)的裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)

5周齡的雄性裸鼠4只備用。分別收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LV-COL11A1-208組及LV-NC組的HN6細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液密度調(diào)至2×107個(gè)/ml，用注射器分別注射100 μl細(xì)胞懸液于裸鼠下肢左、右兩側(cè)背部皮下(左側(cè)為L(zhǎng)V-NC組，右側(cè)為L(zhǎng)V-COL11A1-208組)。裸鼠飼養(yǎng)約1周后可見(jiàn)瘤體形成，定期觀察移植瘤的生長(zhǎng)情況。飼養(yǎng)至21 d結(jié)束觀察，將裸鼠安樂(lè)死，取腫瘤組織拍照并測(cè)量腫瘤重量和體積。

1.3.4 組織學(xué)觀察 將瘤體于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色，并使用Ki-67抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)染色，顯微鏡下觀察并拍照。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以Graphpad Prism 7.0軟件制圖。計(jì)量資料以±s表示，符合正態(tài)分布并滿足方差齊性時(shí)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1COL11A1-208在7個(gè)口腔鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況 qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，口腔鱗癌細(xì)胞系中COL11A1-208相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照細(xì)胞(圖1)，其中，CAL27、HN30細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)水平較高(P＜0.05)，HN4、SCC-9細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)水平中等(P＜0.01)，HN6、SCC-4、SCC-25細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)水平較低(P＜0.05)。本研究選用CAL27、HN4和HN6共3個(gè)口腔鱗癌細(xì)胞系進(jìn)行COL11A1-208的后續(xù)研究。

圖1 qPCR檢測(cè)COL11A1-208在7個(gè)口腔鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 Expression of COL11A1-208 in OSCC cell lines detected by qPCR

2.2COL11A1-208在口腔鱗癌細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位 將CAL27、HN4、HN6細(xì)胞進(jìn)行RNA核質(zhì)分離(以U6、GAPDH作為內(nèi)參驗(yàn)證分離效果)后行qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，COL11A1-208主要定位于口腔鱗癌細(xì)胞核內(nèi)(P＜0.01，圖2A)。FISH實(shí)驗(yàn)亦顯示COL11A1-208定位于細(xì)胞核(圖2B)。

圖2 RNA核質(zhì)分離和FISH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)COL11A1-208的亞細(xì)胞定位Fig.2 Subcellular localization of COL11A1-208 detected by nucleocytoplasmic RNA isolation and FISH assay

2.3COL11A1-208敲減對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖及克隆形成能力的影響 qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，SSCOL11A1-208組細(xì)胞COL11A1-208相對(duì)表達(dá)量均明顯低于SS-NC組(P＜0.01，圖3A)。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，SS-COL11A1-208組細(xì)胞增殖活性明顯低于SS-NC組(P＜0.05，圖3B)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SS-COL11A1-208組細(xì)胞的克隆形成能力明顯低于SS-NC組(P＜0.0001，圖3C)。

圖3 COL11A1-208敲減對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖及克隆形成能力的影響Fig.3 Effect of COL11A1-208 downregulation on the proliferation and colony formation of OSCC cells

2.4COL11A1-208敲減對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 Tanswell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，COL11A1-208敲減的CAL27、HN4細(xì)胞穿膜數(shù)均明顯少于SS-NC組(P＜0.05，圖4A)；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)出一致的結(jié)果(P＜0.01，圖4B)。

圖4 COL11A1-208敲減對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.4 Effect of COL11A1-208 downregulation on the migration and invasion of OSCC cells

2.5COL11A1-208過(guò)表達(dá)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖及克隆形成的影響 qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LVCOL11A1-208組細(xì)胞COL11A1-208相對(duì)表達(dá)量均明顯高于LV-NC組(HN6：6524.216±3395.926vs.1.000±0.000；HN4：3486.230±743.908vs.1.000±0.000；P＜0.05，圖5A)。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，LV-COL11A1-208組細(xì)胞的增殖活性明顯高于LV-NC組(HN6：OD2d值1.012±0.056vs.0.701±0.012，P＜0.001；OD5d值2.345±0.095vs.1.476±0.114，P＜0.05；HN4：OD2d值0.694±0.065vs.0.569±0.028，P＜0.05；OD5d值2.150±0.131vs.1.229±0.131，P＜0.01，圖5B)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LV-COL11A1-208組細(xì)胞克隆形成能力明顯高于LV-NC組(HN6細(xì)胞克隆數(shù)：177.667±23.587vs.86.667±12.583，P＜0.01；HN4細(xì)胞克隆數(shù)：367.000±14.107vs.206.000±21.166，P＜0.001，圖5C)。

圖5 COL11A1-208過(guò)表達(dá)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、克隆形成能力的影響Fig.5 Effect of COL11A1-208 upregulation on the proliferation and colony formation of OSCC cells

2.6CO L 1 1 A 1-2 0 8過(guò)表達(dá)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，COL11A1-208過(guò)表達(dá)的HN6、HN4細(xì)胞穿膜數(shù)明顯多于LV-N C 組(H N 6 遷移細(xì)胞數(shù)：1045.349±58.072vs.600.195±18.259；HN4遷移細(xì)胞數(shù)：642.830±30.836vs.373.784±7.416；P＜0.0001，圖6A)；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果與遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(HN6侵襲細(xì)胞數(shù)：975.349±22.769vs.573.529±32.292；HN4侵襲細(xì)胞數(shù)：542.830±30.836vs.307.118±14.967；P＜0.0001，圖6B)。

圖6 COL11A1-208過(guò)表達(dá)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.6 Effect of COL11A1-208 upregulation on the migration and invasion of OSCC cells

2.7COL11A1-208與COL11A1表達(dá)的相關(guān)性

qPCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，SSCO L 1 1 A 1-2 0 8 組 細(xì) 胞 內(nèi)CO L 1 1 A 1相 對(duì) 表 達(dá) 量均明顯低于SS-NC組(CAL27：0.540±0.090vs.1.000±0.000，P＜0.05；HN4：0.434±0.119vs.1.000±0.000，P＜0.01)，COL11A1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于SS-NC組(CAL27：0.439±0.082vs.1.341±0.125，P＜0.001；HN4：0.129±0.032vs.0.660±0.027，P＜0.0001，圖7A)。LV-COL11A1-208組細(xì)胞內(nèi)COL11A1相對(duì)表達(dá)量均明顯高于LV-NC組(HN6：6.098±0.962vs.1.000±0.000，P＜0.001；HN4：30.172±8.242vs.1.000±0.000，P＜0.01)，COL11A1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于LV-NC組(HN6：0.679±0.018vs.0.330±0.011，P＜0.0001；HN4：0.942±0.019vs.0.709±0.025，P＜0.001，圖7B)。

圖7 COL11A1-208表達(dá)改變對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞COL11A1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect on the mRNA and protein expression of COL11A1 in OSCC cells by change of COL11A1-208 expression

2.8CO L 1 1 A 1-2 0 8表達(dá)改變對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白(上皮鈣黏素、波形蛋白)的影響Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，SS-COL11A1-208組細(xì)胞的上皮鈣黏素相對(duì)表達(dá)量明顯增高(CAL27：0.782±0.077vs.0.618±0.051，P＜0.05；HN4：1.164±0.048vs.0.768±0.103，P＜0.01)，而波形蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(CAL27：0.131±0.028vs.0.527±0.158，P＜0.05；HN4：0.240±0.021v s.0.4 9 3±0.0 2 9，P＜0.0 0 1，圖8 A)。而LVCOL11A1-208組細(xì)胞的上皮鈣黏素相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)，而波形蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增高(P＜0.01，圖8B)。

圖8 COL11A1-208表達(dá)改變對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞內(nèi)上皮鈣黏素和波形蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect on expression of E-cadherin and Vimentin in OSCC cells by change of COL11A1-208 expression

2.9COL11A1-208表達(dá)改變對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響 CAL27細(xì)胞皮下移植瘤內(nèi)定期注射ASOCOL11A1-208觀察COL11A1-208敲減對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示，COL11A1-208敲減的CAL27細(xì)胞形成的移植瘤重量、體積均明顯小于ASONC組[重量：(0.070±0.026) gvs.(0.268±0.146) g，P＜0.0 5；體積：(4 5.6 2 5±1 3.0 0 9) m m3v s.(119.000±31.528) mm3，P＜0.01，圖9A－B)；瘤體組織HE和Ki-67染色后組織學(xué)形態(tài)觀察結(jié)果顯示，COL11A1-208敲減CAL27細(xì)胞形成的移植瘤較ASONC組生長(zhǎng)減緩(圖9C)。此外，COL11A1-208過(guò)表達(dá)的HN6細(xì)胞形成的裸鼠皮下移植瘤明顯大于LV-NC組[重量：(0.485±0.140) gvs.(0.248±0.135) g，P＜0.0 5；體積：(9 8.7 6 6±2 6.2 4 6) m m3v s.(48.313±24.435) mm3；P＜0.05，圖9D－E]；瘤體組織HE和Ki-67染色后組織學(xué)形態(tài)觀察結(jié)果顯示，COL11A1-208過(guò)表達(dá)的HN6細(xì)胞形成的移植瘤較LV-NC組生長(zhǎng)加快(圖9F)。

圖9 COL11A1-208表達(dá)改變對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞形成的裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effect on growth of OSCC xenograft tumor in vivo by change of COL11A1-208 expression

3 討 論

腫瘤發(fā)生發(fā)展涉及一系列復(fù)雜的過(guò)程，與表觀遺傳修飾、非編碼RNA等多種因素有關(guān)[10]。近年來(lái)，lncRNA在惡性腫瘤中的作用及機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道lncRNAs在惡性腫瘤中的異常表達(dá)往往與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)，這些lncRNAs具有成為靶向治療靶標(biāo)和預(yù)后分子標(biāo)記物的潛力[11]。

大量研究顯示，多種lncRNAs在口腔鱗癌的腫瘤組織中表達(dá)異常，如CCAT2、AFAP1-AS1、meg3、HOTAIR和FAL1等，且與口腔鱗癌患者的臨床病理特征相關(guān)，提示lncRNA可能成為口腔鱗癌的輔助診斷指標(biāo)[12-17]。腫瘤轉(zhuǎn)移是影響口腔鱗癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素，而lncRNA在口腔鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制越來(lái)越受關(guān)注[18]。已有研究顯示，部分lncRNAs能夠促進(jìn)口腔鱗癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，但相關(guān)機(jī)制尚不明確[19-21]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，多種lncRNAs(如LINC00460、KTN1-AS1、lnc-H2AFV-1等)可通過(guò)與蛋白互作、吸附微小RNA(miRNA)或調(diào)控m6A RNA甲基化等機(jī)制影響口腔鱗癌細(xì)胞的增殖或轉(zhuǎn)移，在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6-8]。由此可見(jiàn)，與口腔鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)的lncRNAs有望成為口腔鱗癌輔助診斷的分子標(biāo)記物和靶向治療的潛在靶點(diǎn)，對(duì)口腔鱗癌的診治具有潛在的臨床價(jià)值。

本課題前期研究顯示，COL11A1-208在口腔鱗癌組織中高表達(dá)，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，COL11A1-208在口腔鱗癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，與在口腔鱗癌組織中的研究結(jié)果一致；體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示其可促進(jìn)口腔鱗癌的增殖和侵襲能力，為臨床上篩選和鑒定診治口腔鱗癌的分子標(biāo)記物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。COL11A1-208定位于1號(hào)染色體102 877 717－102 880 018反鏈，由兩個(gè)外顯子組成，是COL11A1的轉(zhuǎn)錄本之一。近年有研究顯示，COL11A1基因異常表達(dá)與多種腫瘤(如頭頸鱗癌、卵巢癌、甲狀腺癌等)的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在細(xì)胞增殖、侵襲和化療耐藥等生物學(xué)過(guò)程中起著重要作用，可能成為腫瘤預(yù)后預(yù)測(cè)和診斷治療的潛在分子標(biāo)記物[22]。以往研究發(fā)現(xiàn)，COL11A1在口腔鱗癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，且COL11A1基因表達(dá)下調(diào)后口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯減弱[23]，這與本研究中COL11A1-208在口腔鱗癌細(xì)胞的表達(dá)和功能表現(xiàn)一致。另外，本研究結(jié)果顯示，COL11A1-208主要定位于口腔鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞核，雖然不能編碼蛋白，但其表達(dá)水平的改變可調(diào)控COL11A1的表達(dá)。這可能與胞核lncRNA的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制有關(guān)，如lncRNAs與啟動(dòng)子或增強(qiáng)子等相關(guān)的不穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本能夠選擇性結(jié)合在染色質(zhì)上，參與調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄和RNA加工等過(guò)程[24-25]。

本研究結(jié)果還顯示，COL11A1-208敲減后口腔鱗癌細(xì)胞上皮標(biāo)志物上皮鈣黏素表達(dá)升高、間充質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白表達(dá)降低，而COL11A1-208過(guò)表達(dá)細(xì)胞的上皮鈣黏素表達(dá)降低、波形蛋白表達(dá)升高。這一系列結(jié)果提示，COL11A1-208可促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。EMT作為一種可逆的細(xì)胞程序，可使上皮細(xì)胞瞬間進(jìn)入準(zhǔn)間充質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)[26]，與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和細(xì)胞遷移、侵襲等相關(guān)[27-28]。LncRNA在EMT過(guò)程中可發(fā)揮重要作用，因此常被認(rèn)為是預(yù)測(cè)EMT發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物及靶向治療的潛在靶點(diǎn)[29]。因此，明確COL11A1-208對(duì)EMT的調(diào)控作用可為今后進(jìn)一步深入探討相關(guān)機(jī)制打下基礎(chǔ)。

總之，本研究結(jié)果表明，COL11A1-208作為參與調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的lncRNA，可能成為口腔鱗癌診斷和治療的分子靶標(biāo)。