小檗堿對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠卵巢局部胰島素抵抗的調(diào)控作用

張多加 張明明 王婷婷 張春蘭 郭 瀅 吳效科 李慕白

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦一科,哈爾濱,150040; 2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱,150040)

多囊卵巢綜合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是一種婦科常見的內(nèi)分泌代謝異常疾病,是導(dǎo)致患者無(wú)排卵性不孕的常見原因。研究顯示超過(guò)70%的PCOS患者表現(xiàn)為胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)和(或)高胰島素血癥[1]。盡管肥胖被普遍認(rèn)為是IR的重要促成因素,但有研究顯示,患有PCOS的肥胖女性和非肥胖女性均可伴有胰島素敏感性降低[2]。高胰島素血癥和胰島素抵抗同樣可引起PCOS患者生殖內(nèi)分泌紊亂[3]。一項(xiàng)在全國(guó)22家醫(yī)療分中心收集1 000例不育的PCOS患者的大樣本流行病學(xué)調(diào)查顯示,血清空腹胰島素及穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(Homeostatic Model Assessment for Insulin Resistance,HOMA-IR)水平與經(jīng)過(guò)促排卵誘導(dǎo)的PCOS患者的生育結(jié)局密切相關(guān),并認(rèn)為血清胰島素水平可預(yù)測(cè)PCOS患者的包括排卵、受孕、妊娠及活產(chǎn)率等生育結(jié)局，主要研究結(jié)果發(fā)表在美國(guó)JAMA雜志上[4-5]。研究顯示,卵泡內(nèi)過(guò)量的雄激素,具有阻礙優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育的作用[6]。另外,伴有IR的PCOS患者竇卵泡生長(zhǎng)顯示受阻[7]。高胰島素血癥和IR主要通過(guò)干擾卵泡發(fā)育,導(dǎo)致PCOS排卵功能障礙。

小檗堿(Berberine),又稱黃連素,含多種異哇琳類生物堿,歸中焦脾胃經(jīng),具有清熱燥濕的作用，可有效增加胰島素敏感性,改善胰島素抵抗。宋代《太平圣惠方》中治療消渴病的177首方劑常用的10味藥,黃連就居于前3味。系統(tǒng)評(píng)價(jià)中藥單體小檗堿對(duì)PCOS女性生殖內(nèi)分泌和代謝的影響的研究發(fā)現(xiàn),雖然沒(méi)有確鑿的證據(jù)表明小檗堿可以提高PCOS婦女的活產(chǎn)率或妊娠率,但認(rèn)為小檗堿有助于恢復(fù)正常的內(nèi)分泌和生育能力[8-9]。同時(shí)發(fā)現(xiàn),在改善IR方面,小檗堿與二甲雙胍作用相似,而在改善體脂分布、降低雄激素水平及改善血脂方面,小檗堿優(yōu)于二甲雙胍;與安慰劑和不治療比較,小檗堿與降低黃體生成素(Luteinizing Hormone,LH)水平相關(guān),且和二甲雙胍比較,在降低LH/促卵泡素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)水平方面有顯著優(yōu)勢(shì)[9]。十一五“科技支撐計(jì)劃”項(xiàng)目在全國(guó)19個(gè)分中心收集880例PCOS患者,以小檗堿、來(lái)曲唑進(jìn)行隨機(jī)雙盲對(duì)照試驗(yàn),觀察排卵率、妊娠率、活產(chǎn)率等妊娠結(jié)局,首次發(fā)現(xiàn)小檗堿治療PCOS的6個(gè)月活產(chǎn)率為22%(44/214),小檗堿聯(lián)合來(lái)曲唑的療效達(dá)到34%(74/215),療效水平類似現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一線促排卵藥物枸櫞酸氯米芬。研究成果發(fā)表在Lancet和Fertil Steril上[10-11]。有研究表明,PCOS患者服用小檗堿3個(gè)月后,全身胰島素抵抗有所改善[12]。與二甲雙胍比較,小檗堿有助于恢復(fù)PCOS婦女的生殖內(nèi)分泌水平和生育能力,并且不良反應(yīng)更少,因此,小檗堿似乎是用于改善PCOS患者生殖代謝紊亂和增強(qiáng)生育能力的有效且安全的藥物[9]。

小檗堿對(duì)于PCOS的治療靶點(diǎn)在于單磷酸AMP活化蛋白激酶(Adenine Monophosphate Activated Protein Kinase,AMPK)[13-15],但是并不清楚其對(duì)胰島素信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制,因此,本實(shí)驗(yàn)基于AMPK/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)通路研究小檗堿對(duì)PCOS卵巢局部胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙的改善,同時(shí)從生殖內(nèi)分泌、卵巢組織形態(tài)學(xué)方面的變化,探究小檗堿改善卵巢局部IR的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取60只清潔型雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,6～7周齡,體質(zhì)量160～170 g,由哈爾濱光大動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào)碼:SCXK9(黑)2018-003。飼養(yǎng)條件保持在18～22 ℃的室溫和50%～60%的濕度下,在無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)環(huán)境中,12 h暗/光周期。所有大鼠都隨意接受正常食物和自來(lái)水。所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):2019061801)。

1.1.2 藥物 鹽酸小檗堿片(東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司,批號(hào):2190612);鹽酸二甲雙胍片(格華止)(中美上海施貴寶制藥有限公司,批號(hào):H20023370);生物合成人胰島素注射液(諾和靈,諾和諾德公司,丹麥,批號(hào):J20171005);注射用絨促性素(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠,批號(hào):200309)。

1.1.3 試劑與儀器 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測(cè)試劑盒大鼠胰島素(Insulin,INS,貨號(hào):DECO3003)、總睪酮(Testosterone,T,貨號(hào):DECO2994)、雄烯二酮(Androstenedione,ASD,貨號(hào):DECO2996)、17α-羥孕酮(17α-hydroxyprogesterone,17α-OHP,貨號(hào):DECO2998)、黃體生成素(LH,貨號(hào):DECO2410)、促卵泡素(FSH,貨號(hào)：DECO2320)、性激素結(jié)合球蛋白(Sex Hormone Binding Globulin,SHBG,貨號(hào):DECO2771)ELISA試劑盒均購(gòu)自上海舜冉生物科技有限公司,兔抗大鼠磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白絲氨酸-2481(pSer2481-mTOR)單克隆抗體(貨號(hào):ab137133)、兔抗大鼠磷酸化AMP活化蛋白激酶蘇氨酸-172α(α-pT172-AMPK)單克隆抗體(貨號(hào):2535T)、兔抗大鼠糖原合酶激酶3β(Glycogen Synthase Kinase3β,GSK3β)單克隆抗體(貨號(hào):8885T)均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司,兔抗大鼠磷酸化蛋白激酶B絲氨酸-473(Phospho-Ser473-protein Kinase B,pSer473-AKT)單克隆抗體(Abcam公司,英國(guó),貨號(hào):ab81283),實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒(KAPA Biosystems公司,南非,貨號(hào):KK4601)。光學(xué)顯微鏡(NIKON公司,日本,型號(hào):Eclipse ci),離心機(jī)(賽默飛公司,美國(guó),型號(hào):Sorvall ST 40,SCILOGEX),生化分析儀(邁瑞公司,型號(hào):BS200),酶標(biāo)分析儀(Tecan公司,瑞士,型號(hào):Infinite F50),SDS電泳儀(Bio-rad公司,美國(guó),型號(hào):042BR13724),包埋機(jī)武漢俊杰電子有限公司,型號(hào):JB-P5),凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國(guó),型號(hào):Universal hood II),StepOne Plus實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(ABI公司,美國(guó),型號(hào):ABI7500)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組(15只)和PCOS模型組(45只)。PCOS模型組大鼠從造模第1天起,頸背部皮下注射胰島素(Insulin,INS)0.5 IU,1次/日,此后每日遞增0.5 IU,遞增至6.0 IU/d后,保持該注射劑量至造模結(jié)束;造模第14天起,每只大鼠皮下注射人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin,HCG)6 IU/d,2次/d(上午、下午各3 IU/次),至造模結(jié)束,共9 d。空白組每日給予普通飼料喂食,頸背部皮下注射等劑量生理鹽水,共22 d。

1.2.2 給藥方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將PCOS模型組大鼠隨機(jī)分為模型組(15只)、小檗堿組(15只)、二甲雙胍組(15只)。小檗堿組給予小檗堿混懸液灌胃(170 mg/kg·d);二甲雙胍組給予二甲雙胍混懸液灌胃(200 mg/kg·d);空白組和模型組每日給予等體積生理鹽水灌胃。各組均連續(xù)灌胃31 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.3.1 大鼠動(dòng)情周期檢測(cè) 造模結(jié)束后,隨機(jī)選取大鼠進(jìn)行陰道涂片,觀察陰道上皮角化程度,連續(xù)觀察3個(gè)動(dòng)情周期。

1.2.3.2 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(Oral Glucose Tolerance Test,OGTT) 用藥干預(yù)結(jié)束后,各組大鼠禁食12 h后,空腹采血,之后口服3 g葡萄糖,并開始計(jì)時(shí),分別于服糖后60 min、120 min、180 min分別采血,檢測(cè)血清葡萄糖水平。

1.2.3.3 大鼠血清性激素和糖脂代謝水平檢測(cè) 用藥干預(yù)結(jié)束后,所有大鼠禁食12 h,次日清晨對(duì)動(dòng)情周期處于間期的大鼠進(jìn)行眼眶靜脈取血,分離血清,于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存。之后斷頸處死各組大鼠。計(jì)算HOMA-IR:HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(Fasting Insulin,FINS)(mIU/L)/22.5。使用生化分析儀檢測(cè)血清中三酰甘油(Triacylglycerol,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C)和總膽固醇(Total Cholesterol,TC)水平。采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中FINS、LH、FSH、T、ASD、17α-OHP和SHBG水平,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.3.4 蘇木精-伊紅(Hmatoxylin-eosin,HE)染色法檢測(cè)大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化 摘取各組大鼠卵巢組織,一側(cè)卵巢于液氮中靜置30 min后,于-80 ℃冰箱保存,另一側(cè)卵巢以甲醛固定液固定,常規(guī)石蠟包埋,切片?？瞻捉M、模型組、小檗堿組和二甲雙胍組4組卵巢組織切片中每張切片挑選3個(gè)100倍視野對(duì)卵泡進(jìn)行截圖,于光學(xué)顯微鏡下觀察。截圖時(shí)保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件以100倍標(biāo)尺為標(biāo)準(zhǔn),選取合適的視野,每張圖片分別測(cè)量卵泡5處顆粒層厚度(mm)并計(jì)算出平均值。

1.2.3.5 卵巢組織相關(guān)靶基因蛋白表達(dá)檢測(cè) 以蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting,WB)檢測(cè)卵巢組織α-pT172-AMPK、pSer2481-mTOR、pSer473-AKT、GSK3β蛋白表達(dá)水平。將卵巢組織進(jìn)行蛋白提取、裂解,得到總蛋白產(chǎn)物,進(jìn)行蛋白含量測(cè)定、配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜,洗滌后封閉2 h;加入一抗,孵育過(guò)夜;次日用洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)洗滌后加入二抗,孵育40 min;充分洗滌后,化學(xué)發(fā)光,顯影,使用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析灰度值,其結(jié)果用待測(cè)蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示。

1.2.3.6 卵巢組織葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 mRNA表達(dá)檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(Polymerase Chain Reaction,PCR)檢測(cè)卵巢組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(Glucose Transporter 4,GLUT4)mRNA的表達(dá)。取凍存的卵巢組織進(jìn)行總RNA提取、電泳、反轉(zhuǎn)錄,使用ABI 7500熒光定量PCR儀、采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。引物信息見表1。

表1 引物序列表

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)情周期比較 造模結(jié)束后,光鏡下觀察大鼠陰道涂片,可見陰道上皮細(xì)胞持續(xù)處于以大量白細(xì)胞為主的動(dòng)情間期,提示造模后大鼠動(dòng)情周期紊亂,PCOS大鼠造模成功。藥物干預(yù)后,小檗堿組和二甲雙胍組大鼠動(dòng)情周期恢復(fù)。

2.2 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化觀察 鏡下可觀察到,空白組大鼠卵巢可見各發(fā)育時(shí)期的卵泡,顆粒細(xì)胞形態(tài)完整,排列整齊;與空白組比較,模型組大鼠卵巢各級(jí)發(fā)育期卵泡明顯消退,卵泡顆粒細(xì)胞層厚度明顯減少(P<0.05),囊性擴(kuò)張卵泡和閉鎖卵泡數(shù)量明顯增加;與模型組比較,小檗堿組和二甲雙胍組大鼠卵巢中可見各發(fā)育時(shí)期的卵泡,卵泡顆粒細(xì)胞層厚度明顯增加(P<0.01,P<0.05),囊性擴(kuò)張卵泡和閉鎖卵泡數(shù)量明顯減少。見圖1,表2。

表2 各組大鼠卵巢卵泡顆粒細(xì)胞層厚度比較

圖1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化比較(HE染色)

2.3 各組大鼠血清性激素水平的比較 與空白組比較,模型組大鼠血清性激素中T、LH、LH/FSH、17α-OHP、ASD水平顯著升高,SHBG水平顯著下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);與模型組比較,小檗堿組大鼠血清性激素中T、LH、LH/FSH、17α-OHP、ASD水平顯著降低,SHBG水平顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);與模型組比較,二甲雙胍組T水平下降(P<0.05),LH、LH/FSH、17α-OHP、ASD水平明顯下降(均P<0.01),SHBG水平顯著升高(P<0.01);與二甲雙胍組比較,小檗堿組LH和ASD水平顯著降低,SHBG水平顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠血清性激素水平比較

2.4 各組大鼠糖脂代謝水平的比較

2.4.1 各組糖代謝水平比較 與空白組比較,模型組OGTT試驗(yàn)各時(shí)段血糖水平、FINS和HOMA-IR水平顯著升高(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,小檗堿組和二甲雙胍組OGTT試驗(yàn)各時(shí)段血糖水平、FINS和HOMA-IR水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠糖代謝水平比較

2.4.2 各組脂代謝水平比較 與空白組比較,模型組血清TG、LDL-C、TC水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),HDL-C水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,小檗堿組和二甲雙胍組血清TG、LDL-C、TC水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與二甲雙胍組比較,小檗堿組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠血脂水平比較

2.5 各組大鼠卵巢組織靶基因蛋白表達(dá)比較 與空白組比較,模型組大鼠卵巢組織AMPK的Thr 172位點(diǎn)和AKT的Ser473位點(diǎn)磷酸化水平顯著降低,mTOR的Ser2481位點(diǎn)磷酸化水平和GSK3β蛋白表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,小檗堿組大鼠卵巢組織AMPK的Thr 172位點(diǎn)和AKT的Ser473位點(diǎn)磷酸化水平顯著升高,mTOR的Ser2481位點(diǎn)磷酸化水平和GSK3β蛋白表達(dá)水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2～3。

圖2 各組卵巢組織靶蛋白表達(dá)情況

圖3 各組大鼠卵巢組織中靶蛋白表達(dá)水平比較

2.6 各組大鼠卵巢組織GLUT4 mRNA表達(dá)水平比較 與空白組比較,模型組大鼠卵巢組織中GLUT4 mRNA表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,小檗堿組和二甲雙胍組大鼠卵巢組織中GLUT4 mRNA表達(dá)水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見圖4。

圖4 各組大鼠卵巢組織中GLUT4 mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

本研究采用了INS聯(lián)合HCG法成功制備PCOS大鼠模型,與Poretsky等[16]和Yang等[17]的造模結(jié)果相似,PCOS組大鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期延長(zhǎng);生殖內(nèi)分泌紊亂;胰島素抵抗和高胰島素血癥,糖脂代謝障礙;光鏡下觀察到卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。而在采用小檗堿或二甲雙胍治療后,上述狀態(tài)得以糾正。

3.1 小檗堿恢復(fù)PCOS大鼠卵巢卵泡形態(tài)學(xué)發(fā)育 本研究中,應(yīng)用小檗堿治療后,卵巢正常卵泡發(fā)育形態(tài)學(xué)得到恢復(fù)。卵巢組織中各級(jí)發(fā)育期卵泡復(fù)現(xiàn),囊性擴(kuò)張卵泡消退,卵泡顆粒細(xì)胞厚度明顯增厚。卵巢局部的高雄激素及高胰島素環(huán)境可明顯干擾卵泡的正常發(fā)育。既往研究表明,卵巢局部高雄激素水平可干擾卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育[18],降低顆粒細(xì)胞之間的連接,損害卵泡生長(zhǎng)[7]。而胰島素對(duì)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育同樣起重要作用。過(guò)量的胰島素,可導(dǎo)致顆粒細(xì)胞分化紊亂,卵泡的發(fā)育停止[19]。高胰島素水平還可導(dǎo)致游離胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(Insulin-like Growth Factor 1,IGF-1)水平升高[20],高水平的游離IGF-I可下調(diào)卵泡液中游離IGF-2的水平[21],從而不能促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖和FSH誘導(dǎo)雌激素產(chǎn)生[22]。在本研究中,小檗堿調(diào)節(jié)卵巢局部胰島素信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),改善卵巢局部高胰島素及高雄激素水平,故而恢復(fù)顆粒細(xì)胞增殖,促進(jìn)卵泡發(fā)育,恢復(fù)了卵巢的正常組織形態(tài)。

3.2 小檗堿改善PCOS大鼠生殖內(nèi)分泌紊亂 本研究結(jié)果顯示,應(yīng)用小檗堿治療后,PCOS大鼠T、ASD和17α-OHP高水平狀態(tài)有所恢復(fù)。這表明,小檗堿具有降雄作用,可能是由于小檗堿改善了胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙,從而改善胰島素敏感性的原因。有研究發(fā)現(xiàn),胰島素是導(dǎo)致卵巢雄激素分泌增加的原因,胰島素可協(xié)同LH,刺激卵泡膜細(xì)胞中17α-羥化酶/17,20裂解酶(17α-hydroxylase/17,20 Lyase,CYP17)的表達(dá),導(dǎo)致卵巢產(chǎn)生過(guò)量的雄激素[23]。PCOS患者體內(nèi),高水平胰島素可直接刺激卵巢分泌過(guò)量雄激素[24],研究顯示采用胰島素增敏劑二甲雙胍治療后,高胰島素水平降低的同時(shí),高雄激素水平也得到改善[25]。17α-OHP是合成ASD和T的前體物質(zhì)[26],較高水平的17α-OHP代表合成更多的ASD以及T,導(dǎo)致更嚴(yán)重的雄激素水平升高[27]。本研究認(rèn)為,小檗堿降低了PCOS大鼠空腹胰島素和血清LH水平,因而改善了卵巢局部17α-OHP、ASD以及T的過(guò)多生成。另外,應(yīng)用小檗堿后,PCOS大鼠的血清LH水平下降,這與小檗堿對(duì)PCOS女性生殖內(nèi)分泌和代謝影響的系統(tǒng)評(píng)價(jià)相一致,研究顯示,與安慰劑和不治療比較,小檗堿與降低LH水平相關(guān),與二甲雙胍比較,在降低LH/FSH水平方面有顯著優(yōu)勢(shì)[8]。我們認(rèn)為下丘腦胰島素抵抗與LH的過(guò)量分泌有關(guān)。位于下丘腦弓狀核的吻肽(Kisspeptin,Kp)神經(jīng)元細(xì)胞分泌的Kp多肽類激素,其靶器官是下丘腦的促性腺激素釋放激素(Gonadotrophic Releasing Hormone，GnRH)神經(jīng)細(xì)胞,是GnRH和LH脈動(dòng)釋放的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[28]。研究顯示合并月經(jīng)稀發(fā)的PCOS患者血清Kp濃度及脈沖頻率均明顯增高[29]。Kp與糖代謝途徑息息相關(guān)。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)顯著增加GT1-7 GnRH的神經(jīng)元和胎鼠腦的原代培養(yǎng)物中Kisspeptin-1 mRNA的表達(dá)[30]。健康人靜脈注射Kp可促進(jìn)靜脈葡萄糖負(fù)荷后胰島素分泌,并調(diào)節(jié)血清代謝物。與此相一致,在體外人類胰島細(xì)胞的培養(yǎng)中加入不同濃度的Kp,可劑量依賴地增強(qiáng)胰島B細(xì)胞胰島素的分泌[31]。我們認(rèn)為,小檗堿改善血清高胰島素水平,調(diào)節(jié)下丘腦胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),故而降低了PCOS大鼠的LH水平。

3.3 小檗堿改善PCOS大鼠糖脂代謝紊亂 采用小檗堿治療后的PCOS大鼠糖脂代謝紊亂得到糾正。結(jié)果顯示,小檗堿可明顯降低OGTT試驗(yàn)各時(shí)段血糖水平和HOMA-IR水平,這可能與小檗堿的作用通路有關(guān)。多項(xiàng)研究認(rèn)為小檗堿以AMPK為作用靶點(diǎn)[13-15]。有研究指出,小檗堿通過(guò)AMPK和促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK)通路刺激在大鼠骨骼肌中葡萄糖的攝取,從而降低血糖水平[32]。還有研究已證實(shí)AMPK磷酸化后,可以促進(jìn)糖酵解、抑制糖異生,增加組織細(xì)胞對(duì)葡萄糖的代謝及胰島素敏感性[33]。本研究的結(jié)果證實(shí),小檗堿通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK的活性后,對(duì)磷脂酰肌醇-3-激酶(PhosphatidyLinositol-3-kinase,PI3K)蛋白激酶B/蛋白激酶B(AKT)胰島素信號(hào)通路具有調(diào)控作用,改善其轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙,恢復(fù)下游GLUT4的表達(dá),改善糖代謝。

研究顯示,PCOS患者血脂異?；疾÷矢哌_(dá)76.1%[34]。當(dāng)PCOS發(fā)生胰島素抵抗時(shí),脂肪組織中脂肪分解受到抑制[19]。胰島素可抑制三酰甘油脂肪酶(脂質(zhì)動(dòng)員的關(guān)鍵限速酶)的激活,導(dǎo)致脂質(zhì)動(dòng)員和三酰甘油合成增加[35]。研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可通過(guò)c-Jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal Kinase,JNK)途徑,降低血清LDL[36],或激活A(yù)MPK[37],抑制人類肝細(xì)胞的脂質(zhì)合成,從而改善脂代謝。本研究中,小檗堿可增強(qiáng)胰島素敏感性,激活A(yù)MPK,改善脂代謝,降低血脂水平。

3.4 小檗堿改善PCOS大鼠卵巢局部胰島素信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo) 通過(guò)小檗堿治療后,PCOS大鼠卵巢局部胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙得到調(diào)控,改善局部胰島素抵抗,有效地促進(jìn)了葡萄糖代謝。與Zhang等[38]的研究結(jié)果有類似之處,該研究通過(guò)來(lái)曲唑制造PCOS大鼠模型,對(duì)卵巢組織中PI3K、AKT和GLTU4蛋白水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)應(yīng)用小檗堿后,PI3K、AKT和GLTU4蛋白水平顯著升高。但小檗堿改善卵巢局部PI3K/AKT轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙的機(jī)制尚不清楚。我們認(rèn)為,小檗堿的作用靶點(diǎn)為AMPK基因。有研究表明,AMPK能夠通過(guò)結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物腫瘤抑制基因2(Tuberous Sclerosis Complex tumor suppressor gene 2,TSC2)tuberous sclerosis complex 2 tumor suppressor gene(TSC2),從而抑制mTOR的表達(dá)[39]。胰島素抵抗與mTOR活性增加相關(guān)[40]。研究發(fā)現(xiàn),飲食誘導(dǎo)的IR動(dòng)物模型的骨骼肌和肝臟中mTOR呈異常激活狀態(tài)[41]。mTOR活化后可磷酸化其下游分子核糖體蛋白S6激酶1(Ribosomal-protein S6 Kinase,S6K1),進(jìn)而可導(dǎo)致胰島素受體底物(InsulinReceptor Substrates，IRS)-1磷酸化水平升高,抑制下游的PI3K與IRS-1的結(jié)合[42-43],減弱AKT蛋白的激活,影響PI3K/AKT信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[44]。同樣,AKT磷酸化減少,增加GSK3β蛋白的表達(dá),促進(jìn)糖原合成酶(Glycogen Synthetase,GS)磷酸化而抑制糖原合成[45]。本研究中,應(yīng)用小檗堿后,卵巢局部AMPK被激活,mTOR活性受到抑制,AKT的Ser473磷酸化水平升高,GSK3β蛋白表達(dá)水平下降,GLUT4表達(dá)明顯增加,說(shuō)明小檗堿通過(guò)AMPK/mTOR途徑調(diào)控胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。

本研究結(jié)果顯示,小檗堿恢復(fù)PCOS大鼠生殖內(nèi)分泌狀態(tài),改善高胰島素血癥,調(diào)節(jié)糖脂代謝水平,恢復(fù)卵巢正常形態(tài),究其原因,可能與小檗堿作用于AMPK/mTOR靶點(diǎn),調(diào)控了卵巢局部胰島素信號(hào)PI3K/AKT/GLUT4通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙有關(guān),故改善卵巢局部胰島素抵抗,糾正了卵巢局部的卵泡發(fā)育障礙及性激素分泌異常。